CARACTERSTICAS PARA LA IDENTIFICACIN MICROBIANA

Se entiende por identificacin microbiana al conjunto de tcnicas y procedimientos que se aplican para establecer la identidad de un organismo. .

Estas tcnicas se utilizan en diferentes reas:

En el rea clnica es importante conocer cual es el agente causal de la infeccin que presenta un enfermo para poder tratarlo. Investigacin bsica donde se aisla un determinado organismo que debe identificarse para comprobar si se trata de un organismo conocido o de uno nuevo para poder clasificarlo. En la industria de alimentos, donde las normas de control de calidad exige que la fabricacin de estos alimentos debe realizarse en reas controladas con ausencia de ciertos organismos, los alimentos son sometidos a una serie de controles microbiolgicos para asegurar la ausencia de organismos que puedan causar infecciones y/o descartar la presencia de toxinas capaces de causar intoxicaciones alimentarias.

Los mtodo ms utilizados para la identificacin microbiana se clasifican en:

Mtodos Mtodos Mtodos Mtodos Mtodos

basados basados basados basados basados

en en en en en

criterios morfolgicos. tincin diferencial. pruebas bioqumicas. pruebas serolgicas. deteccin molecular.

No todos los organismos se identifican por las mismas tcnicas, ni con base a un solo mtodo, sino a la combinacin de uno o ms.

MTODOS BASADOS EN CRITERIOS MORFOLGICOS.

Los rasgos morfolgicos (estructurales) han ayudado a los taxonomistas a clasificar organismos. Bajo el microscopio pueden ser tan parecidos dificultndose su clasificacin, an cuando la morfologa celular dice poco sobre las relaciones filogenticas, sigue siendo til para la identificacin bacteriana. Caractersticas macroscpicas, en funcin del tamao, altura de la colonia, forma, color, olor, textura y grado de adherencia al medio de cultivo.

Por ejemplo: la presencia de endosporas y su localizacin resulta de mucha utilidad para la identificacin de bacilos esporulados.

MTODOS BASADOS EN TINCIN DIFERENCIAL.

Es posible sacar conclusiones en relacin con la morfologa examinando una lamina que fue sometida a un proceso de tincin. Estos criterios morfolgicos encabezan la primera etapa del proceso de identificacin la mayor parte de la bacterias teidas con Gram se pueden clasificar como Gram positivas y Gram negativas.

Tinciones fluorescentes (naranja de acridina, rodamina, blanco calcofluor) tincin de inmunofluorescencia directa o indirecta.
Tinciones vitales. protozoos. para la visualizacin de espiroquetas y

Tinciones acidorresistentes y capsulas, flagelos, esporas

otras

tinciones

para

detectar

MTODOS BASADOS EN PRUEBAS BIOQUMICAS

Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el organismo es capaz de fermentar azcares, la presencia de enzimas, la degradacin de compuestos, la produccin de compuestos coloreados. Aun bacterias fuertemente relacionadas pueden separase en dos especies diferentes con base a pruebas bioqumicas.

Por ejemplo las bacterias entericas Gram forman un grupo grande y heterogneo. Esta familia Enterobacteriaceae incluye a varios patgenos que causan sindromes diarreicos. Los gneros clinicamente ms importantes son: Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter y Enterobacter. El gnero Escherichia, Enterobacter y Citrobacter, fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a diferencia de los gneros Salmonella y Shigella que no fermentan la lactosa.

Demostracin de la produccin de Indol Aqu se emple dos tubos con triptona y se inocul los microorganismos Salmonella y Staphylococcus Aureus y se dej incubado a 37 C por 24 horas y despus a temperatura ambiente por 7 das. El tubo de S. Aureus dio positivo con color a rojo cereza, esto indica que este tipo de microorganismo es capaz de degradar al aminocido tritfano formando un producto de hidrlisis de Indol. Bioqumicamente la Salmonella se caracteriza por no fermentar la lactosa y por no licuar la gelatina y por no producir Indol, aunque existen algunas excepciones. No todos los microorganismos pueden realizar este rompimiento de triptona a indol, por lo cual esta reaccin es de valor taxonmico. E. coli logr degradar la triptona y reaccionar para producir Indol, es decir dio positiva la prueba, el microorganismo Gram - a pesar de que se le consideraba susceptible, en este medio reaccionan sin ningn problema.

Los sistemas comerciales ms comnmente usados son :

* BBL, ENTEROTUBE II (Becton Dickinson). Es un sistema para usar en la identificacin de Enterobacterias, definida como bastones Gram -, aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (-). Consiste en un tubo de plstico con 12 medios de cultivo contenidos en compartimentos individuales que se inoculan simultneamente en una etapa y permiten la deteccin de 15 caractersticas bioqumicas. * OXI/FERM TUBE II, (Becton Dickinson). Es un sistema listo para usar para la identificacin de bastones gram (-), aerobios o anaerobios facultativos, oxidasa (+). Consiste en un tubo de plstico de 12 medios de cultivo que permite la realizacin simultnea de 14 pruebas bioqumicas. * API 20 E. Es un sistema estandarizado para la identificacin de Bacterias Gram -. Consiste en una plantilla con microtubos conteniendo medios de cultivo deshidratados que se reconstituyen al agregar una suspensin bacteriana. Permite la realizacin de 23 pruebas bioqumicas a partir de una nica colonia bacteriana

Produccin Alcohlica de Levadura En la levadura que realiza una fermentacin alcohlica, como es el caso de cepas en tubo de ensayo pasteurizado produjo mayor fermentacin ya que al someterlo al calor se inhibe el crecimiento bacteriano que no son de nuestro inters y al inocular levadura esta se desarrolla sin ninguna dificultad; lo que ocurri en el tubo rotulado, no pasteurizado ya que aunque crecieran levaduras y la fermentacin no fue completa, ya que parte de la glucosa all existente fue consumida por los dems microorganismos.

Produccin de H2S por los microorganismos Aqu se inocul los microorganismos E. coli y Salmonella en un tubo de ensayo cada uno con agar inclinado. En el primer tubo con E. Coli no cambio color, dio negativo, no reacciono con el azufre o no es capaz de producir cido sulfhdrico en un medio de aminocido que contenga azufre, el microorganismos no se desarrolla en medio de O2 en este caso. Mientras que la salmonella si desarroll (en este medio con aminocido) (H2S), esta prueba dio positivo. Tambin hubo presencia del gas en medio del agar, este gas demuestra la presencia de (H2S). Tambin el ennegrecimiento en la lnea de siembra, nos indica que hubo produccin de cido sulfhdrico

MTODOS BASADOS EN DETECCIN MOLECULAR

A travs de procedimientos y reactivos, se pueden detectar determinadas secuencias de ADN que son propias de un determinado agente microbiano.

PCR se aplica generalmente para la identificacin de organismos que no pueden ser cultivados por mtodos convencionales

1.

Separacin de las cadenas de ADN, ello se realiza aumentando la temperatura, la cual rompe los enlaces de H que mantiene unidos a las cadenas de ADN.
Adicin de cadenas cortas de polinucletidos, denominados cebadores que se unen por complementariedad de bases a cada una de las cadenas del fragmento de ADN que se desea amplificar, uno se une a la cadena 5-3 y otro a la cadena 3-5.

2.

3. Disminucin de la temperatura para permitir que los cebadores hibridicen con las cadenas de ADN de la muestra problema por complementariedad de bases.

4. Adicin del ADN polimerasa, los cuatro nucletidos y cofactores, para que tenga lugar la sntesis de la cadena complementaria.

ejemplos Bacterias Vibrio cholerae, helicobacter pylori, Staphylococcus aureus. Shigella dysenteriae, Escherichia coli, Mycobacterium tuberculosis.

Virus: Parvovirus, Rotavirus, Adenovirus Rhinovirus. Protozoarios: Toxoplasma gondii, entamoeba histolyticum, Tripanosoma cruzi.

Otro mtodo se fundamenta en la complementariedad de bases de cidos nucleicos. Son aquellos que utilizan sondas de ADN, que se define como secuencias de oligonucleotidos de ADN marcados, con un elemento radioactivo (32P, 125I, 35S)con una protena unida a una enzima como la fosfatasa alcalina. Estas sondas se utilizan para la deteccin de una secuencia complementaria de ADN o ARN, presente en el agente que se desea identificar.

MTODOS BASADOS EN PRUEBAS SEROLGICAS.

Implican la utilizacin de preparaciones de inmunoglobulinas especficas provenientes de suero o de un reactivo y que pueden ser de gran utilidad en la identificacin microbiana en muestras puras o muestras biolgicas. Cada uno tiene un fundamento particular, pero en lneas generales todos se basan en la reaccin de un antgeno presente en el agente microbiano con su anticuerpo correspondiente.
Los serotipos permiten diferenciar organismos a nivel de subespecie, algo de gran importancia en epidemiologa.

Inmunofluorescencia puede utilizarse para la identificacin del organismo aislado o presente en una muestra biolgica. En el mtodo directo se fija la muestra problema a una lamina y se pone en contacto con el antisuero especfico marcado con una sustancia fluorescente (rodamina o fluorescena) transcurrido el tiempo para que tenga lugar la reaccin antgeno anticuerpo se expone la lamina a la radiacin ultravioleta para visualizar la reaccin

ELISA Enzyme Linked Immuno Sorbent Asssay" por sus siglas en ingls que significan Ensayo Inmuno Enzimtico Absorbente. Estudio inmunolgico de laboratorio por medio de reactivos para detectar diversos grmenes, tales como virus o protozoarios.

Se basa en la deteccin de un antgeno inmovilizado sobre una fase slida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reaccin cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotomtricamente

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes : Conjugacin del anticuerpo o del antgeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa alcalina,...). El antgeno marcado se emplea en ensayos de competicin de antgeno. Unin del antgeno (o del anticuerpo) a los pocillos. se realiza con facilidad a la superficie de plsticos tratados que tienen gran afinidad por protenas. Formacin de una o ms capas de inmunocomplejos. En el caso del antgeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antgeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antgeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo mtodo permite la amplificacin de la seal al poderse unir uno o ms anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antgeno y antgeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antgeno fro frente a una cantidad fija de antgeno marcado. Es el ensayo de competicin del antgeno. Revelado de la reaccin enzimtica. Despus de un lavado para eliminar todos las molculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se aade el sustrato enzimtico en solucin. Se deja reaccionar y se lee la densidad ptica (D.O.) mediante espectrofotometra.

Esta prueba se utiliza ampliamente laboratorios clnicos y le permite al mdico:

en

los

Analizar la sangre del paciente con un antgeno (ej., virus o bacterias) para ver si su sistema inmunolgico lo reconoce como algo que ha visto antes. Analizar la sangre del paciente para ver si una sustancia particular como una hormona (un antgeno) est presente en su organismo.