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CAPACIDAD ANTIOXIDANTE TOTAL, CONTENIDO DE COMPUESTOS FENLICOS Y PRODUCTOS DE MAILLARD EN CAIHUA (Chenopodium pallidicaule) GERMINADA Y EXTRUIDA TOTAL ANTIOXIDANT CAPACITY, TOTAL PHENOLIC COMPOUNDS AND MAILLARD PRODUCTS IN CANIHUA GERMINATED AND EXTRUDED (Chenopodium pallidicaule) Elizabeth Huanatico Suarez1#, Roger Segura Pea2, Ftima Abderrahim3, Silvia M. Arribas3, M. Carmen Gonzalez3, Luis Condezo-Hoyos3* Universidad Nacional de San Antonio Abad del Cusco. Facultad de Ingeniera Agroindustrial. Cusco-Per Universidad Nacional del Altiplano. Facultad de Ciencias Agrarias. Escuela Profesional de Ingeniera Agroindustrial. Puno-Per Universidad Autnoma de Madrid. Facultad de Medicina. Departamento de Fisiologa. MadridEspaa. *Correspondencias: # Primer autor, e-mail: elizabethhuanatico@hotmail.com *Autor principal, e-mail: luisalberto.condezo@uam.es Abreviaturas: AGEs, productos avanzados de glicacin; TAC, capacidad antioxidante total; TPC, compuestos fenlicos totales. RESUMEN La germinacin es un mtodo efectivo para incrementar compuestos antioxidantes en cereales y pseudo-cereales. Sin embargo, este proceso tambin incrementa los niveles de azcares reductores y podra favorecer la formacin de productos de Maillard por la aplicacin de algn proceso de coccin, dado el contenido en protenas de estos granos. El objetivo del estudio fue determinar el efecto de distintos tiempos de germinacin/coccin-extrusin de la caihua (Chenopodium pallidicaule) sobre: 1) la capacidad antioxidante total medido por el mtodo QUENCHER, 2) compuestos fenlicos extractables medido por espectroscopa (FolinCiocalteau, 2-amino-etil-difenilborinato) y 3) productos iniciales, intermedios y avanzados de la reaccin de Maillard medidos mediante protenas carboniladas, productos fluorescentes (FIC y FAST) y productos avanzados de glicacin de protenas (AGEs). La germinacin de la caihua durante 72 horas y su posterior extrusin incrementa la capacidad antioxidante total, el contenido de compuestos fenlicos de novo y los productos de Maillard (carbonilos, FIC, FAST y AGEs) respecto a los controles no germinados y no extruidos. Los parmetros evaluados muestran un perfil similar a los distintos tiempos de germinacin, indicando una posible asociacin directa entre ellos. La relevancia fisiolgica de los compuestos de Maillard, producido durante la germinacin, requiere de posteriores estudios in vivo.
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Palabras claves: Capacidad antioxidante total; Compuestos fenlicos; Germinacin de cereales y pseudo-cereales; Productos de Maillard.

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1. INTRODUCION La germinacin es un mtodo efectivo para incrementar compuestos antioxidantes en cereales y pseudo-cereales (AlvarezJubete, Wijngaard, Arendt & Gallagher, 2010). Sin embargo, este proceso tambin incrementa los niveles de azcares reductores y podra favorecer la formacin de productos de Maillard por la aplicacin de algn proceso de coccin, dado el contenido en protenas de estos granos. El objetivo del estudio fue determinar el efecto de distintos tiempos de germinacin/coccin extrusin de la caihua (Chenopodium pallidicaule) sobre: 1) la capacidad antioxidante total medido por el mtodo QUENCHER, 2) compuestos fenlicos extractables medido por espectroscopa (Folin-Ciocalteau, 2-aminoetil-difenilborinato) y 3) productos iniciales, intermedios y avanzados de la reaccin de Maillard medidos mediante protenas carboniladas, productos fluorescentes (FIC y FAST) y productos avanzados de glicacin de protenas (AGEs). 2. MATERIALES Y METODOS 2.1. Reactivos 2-amino-etil-diphenylborinato, cido glico, ABTS, celulosa, persulfato de potasio, polivinilpirrolidona, SDS y trolox de SigmaAldrich (Espaa). Acido actico, carbonato de sodio y reactivo de Folin Ciocalteau de Merck (Espaa). Kit de cuantificacin de protenas de Bio-Rad S.A (Espaa). Metanol adquirido de Panreac S.A. (Espaa) y acetona de Cofares. 2.2. Materia prima La caihua (Chenopodium pallidicaule), variedad cupi, se obtuvo de la estacin experimental de Salcedo del Instituto Nacional de Investigacin Agraria, INIA, Puno, Per. 2.3. Germinacin extrusin de la caihua Los granos de caihua fueron sometidos a lavados sucesivos con agua y luego se desinfectaron con una solucin de hipoclorito de sodio (0.3% v/v) durante 15 minutos, seguido por cuatro lavados con agua estril para remover el agente desinfectante. Inmediatamente despus, se hidrataron a 20C durante 14 horas hasta alcanzar alrededor de 45% de humedad (etapa de imbibicin). La caihua embebida se germin a 20C durante 48, 72 y 96 horas en ausencia de luz, en un germinador marca Mermmet. La caihua germinada se deshidrat a 60C durante 12 horas, con la finalidad de inhibir su evolucin biolgica, se elimin las raicillas para evitar la absorcin de agua y que a su vez, pueden conferir un sabor amargo al producto. Previo al extruido, se adecu la humedad de la caihua germinada a 16% mediante la adicin de agua. La operacin de extrusin se realiz en un extrusor monotornillo (Modelo INNOVA, potencia 50 HP, cuya capacidad es de 150 180 Kg/h). a 150C. La caihua germinada y extruida se moli, se tamiz con una malla No 100, se empac en bolsas de polietileno y se almacen a -20C hasta llevar a cabo los anlisis de laboratorio. 2.4. Capacidad antioxidante total (TAC) El TAC se midi mediante el mtodo directo QUENCHER (Serpen, Capuano, Fogliano & Gokmen, 2007; Serpen, Gokmen, Pellegrini & Fogliano, 2008). 10 mg de muestra -caihua no germinada (DC) y germinada-extruida (GEC)- se diluyo con celulosa (factor de dilucin = 50) en tubos ependdorf. Seguidamente, 1 ml del radical ABTS, sintetizado de acuerdo a Re et al. (Re, Pellegrini, Proteggente, Pannala, Yang & Rice-Evans, 1999) y diluido en etanol/agua (50:50 v/v) (Serpen et al., 2007)), se adicion a cada tubo. Los tubos se agitaron en un sistema movil rod (J. P. Selecta S.A, Barcelona, Espaa) a velocidad mxima durante 30 minutos y a temperatura ambiente. Las muestras se centrifugaron a 2100 g durante 10 min (4C) y los sobrenadantes se transfirieron a una placa de 96 pocillos para medir la absorbancia a 734 nm en un lector de placa Synergy HT Multi-Mode (Biotek, Rochester, VT, USA). El TAC se expres como mmol de equivalentes de trolox (TEAC) por kilogramo de materia seca estimado a partir de una curva dosis respuesta. 2.5. Cuantificacin fenlicos extrables 2.5.1. Extraccin fenlicos de de compuestos compuestos

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100 mg de muestra (DC y GEC) se colocaron en sendos tubos de centrfuga con tapa rosca y se llevo a cabo una primera etapa de extraccin de compuestos fenlicos con 1 ml de metanol acidificado (HCl/H2O, 50:50 v/v, pH 2) en un agitador movil rod (J. P. Selecta S.A, Barcelona, Espaa) a velocidad mxima durante 1 h (temperatura ambiente), el extracto metanlico (AMext) se obtuvo por centrifugacin a 2100 g durante 10 min (4C). A continuacin, 1 ml de una solucin de acetona/agua (70:30 v/v) se adicion al precipitado obtenido y el extracto acetnico (ACEText) se obtuvo utilizando las mismas condiciones de la etapa anterior. Alcuotas de los extractos se almacenaron a -20C hasta su anlisis. 2.5.2. Cuantificacin de compuestos fenlicos totales (TPC) El contenido de TPC se midi empleando un micro-mtodo de Folin-Ciocalteau (FC), el cual se adapt a un lector de placa (Abderrahim, Estrella, Susin, Arribas, Gonzalez & Condezo-Hoyos, 2011). 10 l de muestra (AMext y ACEText de DC y GEC) o una disolucin de cido glico (0.04-0.20 g/l) como estndar o agua como blanco se mezclaron con 10 l del reactivo de FC en un agitador orbital durante 2 minutos. Seguidamente, 80 l carbonato de sodio (5% p/v) se adicion a la mezcla anterior para conseguir condiciones alcalinas y favorecer la reaccin de cuantificacin. Esta se llev a cabo a 40C durante 10 min en un termociclador PCR (DeltaCycler ITM system, Ericomp Inc., California, USA). La absorbancia a 740 nm se midi en un lector de placa Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Biotek, Rochester, VT, USA) y contenido de TPC se expres en mg de equivalentes de cido glico (GAE)/100 g de peso seco. 2.5.3. Cuantificacin totales de flavonoides un lector de placa Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Biotek, Rochester, VT, USA). El contenido de flavonoides se estim a partir de una recta patrn de quercetina (0-1 mM) y se expres en mol de equivalentes de quercetina (QE)/100 g de peso seco. 2.6. Cuantificacin de azcares libres y reductores 2.6.1. Preparacin de la muestra 10 mg de la muestra de caihua DC y GEC se mezcl con 1 ml etanol al 80% v/v durante 2 h en un agitador movil rod (J. P. Selecta S.A, Barcelona, Espaa) a velocidad mxima y a temperatura ambiente para extraer los azcares. El sobrenadante, obtenido por centrifugacin a 2100 g durante 30 minutos, se mezcl con una disolucin de polivinilpirrolidona para eliminar compuestos fenlicos (Tian et al., 2010) que puede interferir con la cuantificacin. La mezcla anterior se centrifug a las mismas condiciones y el sobrenadante final se us en la valoracin del contenido de azcares reductores y libres. 2.6.2. Azcares reductores El contenido de azcares reductores se valor empleando el mtodo adaptado a un lector de placas basado en la reaccin con el cido 3,5-dinitrosalicilico (DNS) (King, Donnelly, Bergstrom, Walker & Gibson, 2009). El DNS se prepar de acuerdo al protocolo previamente descrito por Kning et al. (Knig, Grasser, Pikor & Vogel, 2002). Disoluciones de glucosa de 0, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, y 3.0 mg/ml preparados en 0.1 M de tampn acetato de sodio pH 5.5 se usaron para preparar la recta de calibrado. La mezcla de 60 l de muestra (DC o GEC) o estndar y 120 l DNS se incub a 95C durante 5 minutos e inmediamente enfriado a 20C en un termociclador (DeltaCycler ITM system, Ericomp Inc., California, USA). La mezcla de reaccin se diluy 5.4 veces con 160 L de agua en pocillos de una placa de 96 y la absorbancia a 540nm se ley en un lector Synergy HT Multi-Mode Microplate Reader (Biotek, Rochester, VT, USA). El contenido de azcares reductores se expres en g de glucosa/100 g de peso seco. 2.6.3. Azcares libres

El contenido de flavonoides se midi mediante el protocolo descrito por Oomah y Mazza (Oomah & Mazza, 1996) adaptado a un lector de placa. 20 l de la muestra (AMext y ACEText de DC y GEC) se hizo reaccionar con 100 L 2-amino-etilldifenilborinato (0.125% p/v disuelto en metanol) a temperatura ambiente durante 10 minutos. Luego, la absorbancia de la mezcla de reaccin se midi a 405 nm en

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El contenido de azcares libres se evalu usando el mtodo antrona-H2SO4 (Laurentin & Edwards, 2003). Las protenas se precipitaron en cido tricloroactico al 10% p/v mantenido en hielo durante 10 minutos. El sobrenadante, obtenido despus de la centrifugacin a 2100 g x 10 min (4C), se empleo en el ensayo. 30 l del sobrenadante se mezcl con 75 l del reactivo de antrona (0.2 % p/v in H2SO4 concentrado). La mezcla se incub a 95C durante 3 min e inmediatamente se enfri a 20C en un termociclador (DeltaCycler ITM system, Ericomp Inc., California, USA). La mezcla de reaccin se transfiri a una placa de 96 pocillos y la absorbancia a 630 nm se midi en un lector Synergy HT MultiMode Microplate Reader (Biotek Instrument Inc., Rochester, VT, USA). El contenido de azcar libre, estimado de una recta de calibrado de glucosa (0-0.3 g/l), se expres en g de glucosa/100 g de peso seco. 2.7. Cuantificacin de los productos de Maillard 10 g de muestra de caihua DC y GEC se pesaron en tubos de centrfuga con tapa rosca y a continuacin se procedi a extraer la protenas en 1 ml de una disolucin de SDS al 6% p/v bajo agitacin a velocidad mxima, en un agitador movil rod (J. P. Selecta S.A, Barcelona, Espaa), durante 30 minutos a temperatura ambiente. La mezcla se centrifug a 2100 g durante 10 min (4C). Los sobrenadantes obtenidos se usaron para medir los productos intermedios y avanzados de la reaccin de Maillard: productos fluorescentes y AGEs. 2.7.1. Productos fluorescentes Los productos intermedios (FIC) y avanzados (FAST index) de la reaccin de Maillard se midieron de acuerdo a metodologas previamente descritas (Kim & Lee, 2009; Michalska, Amigo-Benavent, Zielinski & del Castillo, 2008a). El contenido de protenas, medido por el mtodo de Bradford, se us en la normalizacin de los parmetros FIC y FAST. 2.7.2. AGEs Los niveles de AGEs en el sobrenadante proteico se midieron empleando el mtodo basado en la reaccin con el cido tiobarbitrico (TBA) (Dolhofer & Wieland, 1981). 52.5 l de la muestra se mezcl con 17.5 l de cido tricloroactico al 20% p/v, 10 l H2SO4 al 1% v/v y 70 l de TBA al 0.67% p/v. La mezcla se incub a 60C durante 1 h bajo agitacin intensa para liberar hidroxi-metil-furfural (HMF) conjugado a protena y a su vez permitir la reaccin con el TBA. La absorbancia a 450 nm se midi en un lector Synergy HT MultiMode Microplate Reader (Biotek, Rochester, VT, USA) y se compar una curva estndar de HMF (0-5 nmol) para realizar la cuantificacin de AGEs. El contenido de AGEs se expres en nmol de HMF/mg protena. El contenido de protena se midi sobre el precipitado, obtenido por precipitacin con acetona y centrifugacin a 2100 g durante 10 minutos (4C). 2.7.3. Protenas carboniladas Las protenas totales de las muestras de caihua se extrajeron de acuerdo al protocolo experimental de Branlard y Bancel (Branlard & Bancel, 2007). 100 mg de caihua se pes en un tubo de centrifuga con tapa rosca y se adicion 1 ml de la solucin de extraccin (0.4 M NaCl + 0.07% v/v de 2-mercaptoetanol y 0.4% v/v de una mezcla de inhibidores de proteasas de Sigma-Aldrich). A continuacin, la suspensin se agit en un movil rod (J. P. Selecta S.A, Barcelona, Espaa), a velocidad mxima, durante 2 horas a temperatura ambiente. El extracto se centrifug a 2100 g durante 30 min (4C) y luego el sobrenadante, en alcuotas, se almacen a -20C hasta su anlisis. Las protenas carboniladas se midi de acuerdo al protocolo basado en la reaccin con el 2,4-dinitrofenilhidrazina (DNPH) (Hawkins, Morgan & Davies, 2009). Los complejos de polifenoles-protena se eliminaron por extraccin con 2-propanol (ratio extracto de protena/disolvente =1:5 v/v) (Tang, Wang, Liu & Wang, 2009). Volumenes iguales de muestra proteica sin compuesto fenlicos conjugados y DNPH (10 mM disuelto en HCl 2.5 M) se hicieron reaccionar en oscuridad durante 15 minutos. Las protenas se precipitaron con cido tricoloroactico de 10% TCA sobre hielo durante 30 minutos y los pellets se prepararon mediante centrifugacin a 2100 g durante 30 minutos (4C). El exceso de DNPH se elimin mediante tres lavados con una disolucin de etanol/acetato de

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etilo (1/1 v/v) y centrifugado a las mismas condiciones anteriores. El pellet de protena se disolvi en cloruro de guanidina 6M y la absorbancia de la disolucin se midi a 370 nm. El contenido de protenas carboniladas se determin usando el coeficiente de extincin del D DNPH ( =22000 M-1cm-1) y se expres en nmoles/mg de protena. 2.8. Cuantificacin de protenas El contenido de protenas de las muestras se midi mediante el micro-mtodo de Bradford (Bio-Rad, Espaa) usando albumina de suero de bovino (BSA) como estndar. La absorbancia se midi a 595 nm en un lector de placa Synergy HT MultiMode Microplate Reader (Biotek, Rochester, VT, USA). 2.9. Cuantificacin del contenido de materia seca El contenido de materia seca de las muestras se determin por secado a 100C durante 24 h. 2.10. Anlisis estadstico Los resultados se expresaron como promediodesviacin estndar de 3 replicas. Los datos se analizaron mediante anlisis de varianza de una va y se compararon mediante la prueba de Bonferroni en el programa estadstico GraphPad Prisma (GraphPad Software, Inc., CA, USA). Valores de p<0.05 se consideraron estadsticamente diferentes. 3. RESULTADOS 3.1. Capacidad antioxidante total (TAC) El valor TAC de la muestra DC fue 70.95 1.70 mmol trolox/kg de peso seco. La germinacin durante 72 y 96 h y la posterior extrusin incrementa significativamente este parmetro hasta alcanzar valores de 106.56.8 y 89.03.9 mmol trolox/kg de peso seco, respectivamente. No se observ ningn cambio en los valores TAC de la caihua germinada durante 48 h y extruida con respecto a la muestra DC (Figura 1).
125
Capacidad antioxidante total (mmol de equivalente de Trolox/kg de peso seco )

+++

++ *** **

100

75

50

25

DC

48 h

72 h GE C

96 h

Figura 1 Capacidad antioxidante total de la caihua sin germinar (DC) y la germinada durante 48, 72 o 96 h y extruida (GEC). Los valores TAC estn expresados como promedio desviacin estndar, n= 3; ** p< 0.01 y ***p<0.001 cuando se compara con DC, +++ p< 0.001 y ++ p< 0.01 cuando se compara entre los grupos GEC. 3.2. Contenido de TPC y flavonoides totales El contenido de TPC extrables en las fracciones AMext y ACEText y el total se increment durante la germinacin. El mximo valor correspondi a la muestra GEC-72h. Los compuestos fenlicos en la caihua se extrajeron mejor en acetona/agua (70:30 v/v) (Figura 2A). Contrariamente, los flavonoides se lixiviaron ms eficientemente en la disolucin acuosa de metanol acidificado a pH=2. El contenido de flavonoides totales son significativamente mayores en las muestras de canihua germinadas y extruidas (Figura 2B).

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3000

A
AMExt ACETExt Total

Contenido de compuestos fenlicos extrables (mg GAE/100 g de peso seco)

+ *** ***

extruidas respecto al control D C, correspondiendo el valor mximo a la muestra GEC-72h (Figura 3A y 3B). Sin embargo, en el caso del contenido de azcares libres, el mximo se observ en las muestras GEC-72h y GEC-96h (Figura 3B).

2000

++ + *** **
1000

***

***
Contenido de azcares reductoresr (g glucosa/100 g de peso seco)

+++

+++ ***

+++

+ *** **

***

***

DC 48 72

96 h

DC 48 72

96 h

DC 48 72

96 h

GEC

GEC

GEC

***

B
400 AMExt ACETExt Total

Contenido de flavonoides extrables (mg QE/100 g de peso seco)

*** *** ***

300

0 15

+++ +++ ***

+++ +++ *** ***

**

200

++ ***
100

Contenido de azcares libres (g glucosa/100 g de peso seco)

++

10

***

** **

0
DC 48 72 96 h DC 48 72 96 h DC 48 72 96 h

GEC

GEC

GEC
0

Figure 2 Contenido de compuestos fenlicos (A) y flavonoides totales (B) en los extractos AMext y ACEText y el total (la suma de las fracciones) de caihua sin germinar (DC) y germinada durante 48, 72 o 96 h y extruida (GEC). GAE, equivalentes de cido glico y QE, equivalentes de quercetina. Los valores estn expresados como promedio desviacin estndar, n= 3; ** p< 0.01 y ***p<0.001 cuando se compara con DC, +++ p< 0.001 y ++ p< 0.01 cuando se compara entre los grupos GEC. 3.3. Contenido de azcares reductores y libres El contenido de azcares reductores y libres se incrementa significativamente en las muestras de caihua germinadas y

DC

48 h

72 h
GE

96 h

Figure 3 Azucares reductores (A) y libres (B) en caihua sin germinar (DC) y caihua germinada durante 48, 72 96 h y extruida (GEC). Los valores estn expresados como promedio desviacin estndar, n= 3; ***p<0.001 cuando se compara con DC, +++ p< 0.001 cuando se compara entre los grupos GEC. 3.4. Productos de Maillard El valor FIC se increment significativamente en las muestras de GEC72h y GEC-96h en comparacin con el control DC (Figura 4A). Este indicador temprano de

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la formacin de productos de Maillard result mximo a la muestra GEC-72h. Un perfil similar se obtuvo para el contenido de protenas carboniladas (Figura 4B). parmetros relacionados con la formacin de productos de Maillard con un mximo en la muestra GEC-72h (Figura 5B).

150
20000

A
+++

+++ +++ ***

+++ ***

++

Valor FIC (Unidades de fluorescencia)

15000

100

10000

**

FAST index
50

***

5000

0
0

800
400

B
+++ +++ ***

B
+
AGEs (nmoles de HMF/mg de proteina)

Protenas caboniladas (nmoles de carbonilos/mg de proteina)

300

*** **

600

200

**

400

** *
200

100

0
DC 48 h 72 h GE C 96 h

DC

48 h

72 h GE

96 h

Figure 4 Valor FIC y protenas carboniladas en caihua sin germinar (DC) y caihua germinada durante 48, 72 o 96 h y extruida (GEC). Los valores estn expresados como promedio desviacin estndar, n= 3; ** p< 0.01 ***p<0.001 cuando se compara con DC, + p< 0.05, ++ p< 0.01 y +++ p< 0.001 cuando se compara entre los grupos GEC. El parmetro FAST index, un indicador de la presencia de productos avanzados de Maillard, se increment significativamente en las muestras GEC-72h y GEC-96h, siendo mximo en GEC-72h (Figura 5A). Los niveles de AGEs se incrementaron en todas las muestras GEC y al igual que en todos los

Figura 5 FAST index y AGEs en caihua sin germinar (DC) y germinada durante 48, 72 o 96 h y extruida (GEC). Los valores estn expresados como promedio desviacin estndar, n= 3; * p< 0.05, ** p< 0.01 y ***p<0.001 cuando se compara con DC, +++ p< 0.001 cuando se compara entre los grupos GEC. 4. DISCUSION 4.1. Efecto de la germinacin y extrusin sobre la capacidad antioxidante total de la caihua La capacidad antioxidante reportada en este estudio, el valor TAC, es mucho ms alta (71.01.7 mmol trolox/kg de peso

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seco) comparado con el reporte previo (1.87.8 mmol trolox/kg de peso seco) (Penarrieta, Alvarado, Akesson & Bergenstahl, 2008). Esta diferencia significativa guarda relacin con el uso del procedimiento directo QUENCHER (Serpen et al., 2007). Se sabe que la mayor parte de los compuestos fenlicos en cereales y pseudo-cereales estn covalentemente ligadas a protenas y carbohidratos; es decir, no pueden ser extrados con disolventes y, por tanto, la capacidad antioxidante medida en extractos suele ser inferior a la real (Arranz, Silvan & SauraCalixto, 2010). Comparado con otros cereales los valores TAC de la caihua medido por el procedimiento directo QUENCHER y expresados en mmol de trolox/Kg materia seca- fueron ms altos que aquellos encontrados en mijo (~10), trigo (~35), avena (~30), cebada (~55) y comparable con el trigo integral (60-80) (Serpen, Gkmen, Pellegrini & Fogliano, 2008). Estos datos indican que la caihua posee una elevada capacidad antioxidante incluso sin germinar. En un estudio previo evaluamos el efecto de la germinacin (Aro et al., 2011) sobre la capacidad antioxidante total medido por el mtodo directo, observndose un patrn similar al que presentan las muestras de caihua germinadas y extruidas. Esto significa que, la extrusin de la caihua germinada a 150C durante aproximadamente 30 segundos no afecta la capacidad antioxidante total de las muestras, en concordancia con lo descrito en trigo sarraceo extruido (Zielinski, Michalska, Piskula & Kozlowska, 2006) y la mxima actividad antioxidante alcanzada a 142C en una mezcla de frijol/maz extruida (Delgado-Licon et al., 2008). 4.2. Efecto de la germinacin y extrusin sobre compuestos fenlicos y flavonoides totales de la caihua El presente estudio demostr, que en caihua, la germinacin incrementa en paralelo el TPC extrables. Similares cambios en TPC extrables ha sido reportado en diferentes pseudo-cereales. Por ejemplo, la quinua y el amaranto germinados a 10C durante 98 h y 82 h duplica o cuadruplica el TPC, respectivamente (Alvarez-Jubete et al., 2010). Similarmente, en mijo germinado, el contenido de TPC, extrado en metanol, aumenta ligeramente respecto a las muestras no germinadas (Pradeep & Guha). Los cambios en el TPC durante la germinacin de cereales/pseudo-cereales est relacionado con un complejo proceso de reacciones bioqumicas y se han sugerido dos mecanismo posibles: de novo biosntesis y/o la liberacin de estos compuestos a partir de protenas y carbohidratos mediante reacciones de hidrlisis enzimtica (Hahlbrock & Scheel, 1989). La no correspondencia entre los altos valores TAC a las 72 h de germinacin puede estar relacionado con la biosntesis de otros compuestos con actividad antioxidante (Alvarez-Jubete et al., 2010; Pasko, Barton, Zagrodzki, Gorinstein, Folta & Zachwieja, 2009; Sharma & Gujral) y/o la existencia de una fraccin no extrable (Arranz et al., 2010). Asimismo, se ha descrito que en cereales la germinacin incrementa el contenido de flavonoides extrables. Se ha observado que en muestra de mijo (Pradeep et al.), quinua y trigo sarraceno, la germinacin incrementa el contenido de quercetina, kaempferol, catequinas, luteolina y apigenina (Alvarez-Jubete et al., 2010). Adicionalmente, el trigo sarraceno germinado entre 4-14 das incrementa significativamente su contenido en rutina, aproximadamente 80 veces ms que su control no germinado (Lin, Peng, Yang & Peng, 2008). En correspondencia que los hallazgos descritos, la germinacinextrusin de la caihua permite incrementar el contenido de flavonoides. El efecto de la extrusin sobre el TPC probablemente dependa del tipo de compuestos fenlicos y de la matriz de en la que ellas se encuentra, es decir del cereal. As, se ha descrito una reduccin importante del TPC en trigo sarraceo extruido a 120C (Zielinski et al., 2006); en tanto, no se ha observado ningn cambio en el TPC en harina integral del mismo trigo extruido a 170C (Sensoy, Rosen, Ho & Karwe, 2006). Adicionalmente, la estabilidad de la actividad antioxidante en la mezcla de frijol/maz extruida, sumado a la correlacin positiva y significativa entre la actividad antioxidante y el contenido de TPC (Delgado-Licon et al., 2008), reflejara que los compuestos fenlicos en general y los flavonoides en particular son estables al proceso de extrusin (Delgado-Licon et al., 2008; Sensoy et al., 2006). Esto se correspondera con lo encontrado en las

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muestras extruidas. de caihua germinadas y grupos amino y forman productos avanzados tales como las melanoidinas (Martins et al., 2000). El contenido de azcares reductores se increment significativamente en las muestras GEC, pero el nivel de protenas carboniladas se increment significativamente en la muestra GEC-72h. Se sabe que la glucosa posee una baja actividad de glicacin y por tanto su relevancia en la formacin de productos de Maillard in vivo es limitada (NegreSalvayre, Salvayre, Auge, Pamplona & Portero-Otin, 2009). Sin embargo, a altas temperaturas como las utilizadas en la extrusin esta capacidad de glicacin puede potenciarse, hecho que se correspondera con la disminucin del contenido de azcares reductores observado. Las protenas carboniladas son precursores de los productos fluorescentes y no fluorescentes formados en estados tardos de la reaccin de Maillard (Liggins et al., 1997). Asimismo, tanto el FAST index como los valores FIC han sido usados como medida in vitro de la formacin de AGEs (Wang, Chang, Pokkaew, Lee & Chiou). Particularmente, en cereales el valor FIC es definido como un indicador de productos intermedio de Maillard, en tanto que FAST index est relacionado con productos avanzados de Maillard (Michalska, Amigo-Benavent, Zielinski & del Castillo, 2008b). La germinacin y extrusin de la caihua produce el incremento en ambos parmetros, lo que corroborara lo mencionado. Particularmente, la extrusin incrementa an ms los productos fluorescentes de Maillard en las muestras de caihua germinadas (datos no mostrados). De manera similar, los niveles de AGEs en las muestras germinadas y extruidas son significativamente mayores que en las muestras no germinadas (DC) y que en algn caso (en la muestra de 96 h) la extrusin potencia la formacin de AGEs. Dado que los AGEs han sido implicados en varias situaciones patolgicas (Buetler, 2007), es importante considerar que la coccin de cereales germinados puede acrecentar la formacin de estos compuestos.

4.3. Efecto de la germinacin y extrusin sobre el contenido de azcares reductores y libres en caihua Un conjunto de enzimas hidrolticas incrementan su actividad durante la germinacin de cereales, lo cual significa que macromolculas, tales como protenas y carbohidratos, pueden ser degradados a compuestos con ms bajo peso molecular (Nirmala et al., 2000). Esto es evidenciado en el presente estudio por lo niveles de azcares reductores en las muestras de caihua germinadas. Este incremento es mximo en la muestra GE72-h seguido por una reduccin a las 96 h de germinacin. Este perfil son compatibles con la actividad de amilasas y glucosidasas que inducen la temprana degradacin del almidn (Nirmala et al., 2000; Tian et al., 2010). La reduccin en los niveles de azcares reductores similar a lo descrito en arroz germinadopodra estar relacionado su uso como sustrato en otras rutas metablicas activadas por el proceso de germinacin (Saman, Vazquez & Pandiella, 2008). La extrusin de la caihua previamente germinada puede modificar el contenido de azcares reductores siempre y cuando la temperatura del proceso favorezca reacciones del tipo Maillard (Singh, Wakeling & Gamlath, 2007). En el presente estudio, el contenido de azcares reductores se reduce con la extrusin en las muestras germinadas (datos no mostrados). 4.4. Efecto de la germinacin y extrusin sobre productos de Maillard en caihua La qumica subyacente a la reaccin de Maillard es muy compleja, pero la existencia de tres etapas goza de amplio consenso cientfico. La primera, conocido como el estado temprano, involucra la glicacin no enzimtica mediada por la adicin nucleoflica entre un azcar reductor y un grupo amino que da lugar a la formacin de una base de Schiff, que posteriormente deriva en lo productos de Amadori (Martins et al., 2000). En la siguiente etapa se forman los productos intermedios tales como hidroxi-metilfurfural, aldehdos de Strecker o pirazinas. En la etapa final, la interaccin de los productos de Amadori reaccionas con otros

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5. CONCLUSIONES Los resultados obtenidos en el presente estudio nos permitieron establecer las siguientes conclusiones: 1. El proceso de germinacin y extrusin incrementa la capacidad antioxidante de la caihua. 2. El incremento de la capacidad antioxidante de la caihua est asociado con la biosntesis de de compuestos fenlicos y otros inducidos por la germinacin y extrusin. 3. La germinacin incrementa el contenido de productos de Maillard y el proceso de extrusin tiende a acentuar ello; por lo tanto, es necesario optimizar el proceso para cada tipo de cereal. 6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAA Abderrahim, F., Estrella, S., Susin, C., Arribas, S. M., Gonzalez, M. C., & Condezo-Hoyos, L. (2011). The antioxidant activity and thermal stability of lemon verbena (Aloysia triphylla) infusion. J Med Food, 14(5), 517-527. Alvarez-Jubete, L., Wijngaard, H., Arendt, E. K., & Gallagher, E. (2010). Polyphenol composition and in vitro antioxidant activity of amaranth, quinoa buckwheat and wheat as affected by. Food Chemistry, 119(2), 770-778. Arranz, S., Silvan, J. M., & Saura-Calixto, F. (2010). Nonextractable polyphenols, usually ignored, are the major part of dietary polyphenols: a study on the Spanish diet. Mol Nutr Food Res, 54(11), 1646-1658. Branlard, G., & Bancel, E. (2007). Protein extraction from cereal seeds. Methods in molecular biology (Clifton, N.J.), 355, 1525. Buetler, T. (2007). The health risks of dietary advanced glycation end-products. Interview by Monika Pischetsrieder. Mol Nutr Food Res, 51(9), 1071-1073. Delgado-Licon, E., Ayala, A. L., RochaGuzman, N. E., Gallegos-Infante, J. A., Atienzo-Lazos, M., Drzewiecki, J., MartinezSanchez, C. E., & Gorinstein, S. (2008). Influence of extrusion on the bioactive compounds and the antioxidant capacity of the bean/corn mixtures. Int J Food Sci Nutr, 1-11. Hahlbrock, K., & Scheel, D. (1989). Physiology and Molecular Biology of Phenylpropanoid Metabolism. Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology, 40(1), 347-369. Lin, L. Y., Peng, C. C., Yang, Y. L., & Peng, R. Y. (2008). Optimization of bioactive compounds in buckwheat sprouts and their effect on blood cholesterol in hamsters. J Agric Food Chem, 56(4), 1216-1223. Oomah, B. D., & Mazza, G. (1996). Flavonoids and Antioxidative Activities in Buckwheat. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 44(7), 1746-1750. Pasko, P., Barton, H., Zagrodzki, P., Gorinstein, S., Folta, M., & Zachwieja, Z. (2009). Anthocyanins, total polyphenols and antioxidant activity in amaranth and quinoa seeds and sprouts during their growth. Food Chemistry, 115(3), 994-998. Penarrieta, J. M., Alvarado, J. A., Akesson, B., & Bergenstahl, B. (2008). Total antioxidant capacity and content of flavonoids and other phenolic compounds in canihua (Chenopodium pallidicaule): an Andean pseudocereal. Mol Nutr Food Res, 52(6), 708-717. Pradeep, S. R., & Guha, M. Effect of processing methods on the nutraceutical and antioxidant properties of little millet (Panicum sumatrense) extracts. Food Chemistry 2010, 126(4), 1643-1647. Re, R., Pellegrini, N., Proteggente, A., Pannala, A., Yang, M., & Rice-Evans, C. (1999). Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorization assay. Free Radic Biol Med, 26(9-10), 1231-1237. Sensoy, I., Rosen, R. T., Ho, C.-T., & Karwe, M. V. (2006). Effect of processing on buckwheat phenolics and antioxidant activity. Food Chemistry, 99(2), 388-393. Serpen, A., Capuano, E., Fogliano, V., & Gokmen, V. (2007). A new procedure to measure the antioxidant activity of insoluble food components. J Agric Food Chem, 55(19), 7676-7681. Serpen, A., Gkmen, V., Pellegrini, N., & Fogliano, V. (2008). Direct measurement of the total antioxidant capacity of cereal products. Journal of Cereal Science, 48(3), 816-820. Sharma, P., & Gujral, H. S. Antioxidant and polyphenol oxidase activity of germinated barley and its milling fractions. Food Chemistry 2010, 120(3), 673-678. Singh, S., Wakeling, L., & Gamlath, S. (2007). Retention of Essential Amino Acids during Extrusion of Protein and Reducing Sugars. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 55(21), 8779-8786.

11 Zielinski,H.,Michalska,A.,Piskula,M.K.,& Kozlowska, H. (2006). Antioxidants in thermally treated buckwheat groats. Mol NutrFoodRes,50(9),824832.