Identificacin de Enterobacteriaceae mediante, BBL Enterotube II

Apartados del ejercicio A. Sistemas de identificacin bioqumica miniaturizados y Enterobacteriaceae B. El sistema BBL Enterotube II C. Procedimiento de inoculacin y lectura del sistema de identificacin D. Interpretacin de resultados E. Entrenamiento en la lectura de los resultados positivos o negativos de cada prueba F. Entrenamiento en la codificacin de los tripletes y en la interpretacin de los colores de cada prueba G. Supuesto prctico: Identificacin de tres aislados problema H. Comprobar los resultados del ejercicio

A. Sistemas de identificacin bioqumica miniaturizados y Enterobacteriaceae

La identificacin de microorganismos patgenos y microorganismos alterantes, cultivos iniciadores ("starter cultures"), etc., en microbiologa de alimentos, es una parte importante de los mtodos microbiolgicos. Los mtodos convencionales (que datan de hace ms de 100 aos) utilizaban grandes volmenes de medio para examinar una caracterstica particular de una bacteria, por ejemplo: 10 ml de caldo lactosado para observar la fermentacin de lactosa por E. coli. A travs de los aos, han comenzado a utilizarse sistemas miniaturizados de identificacin (manuales o automatizados), en los que, en un solo paso, se examinan varias pruebas bioqumicas con gran ahorro de tiempo, encontramos en el mercado distintos sistemas multipruebas bioqumicas: API, Enterotube, Minitek, Crystal ID, MicroID, entre otros. Una batera de pruebas bioqumicas es el mejor medio para la identificacin especfica de miembros de la familia Enterobacteriaceae. Principales caractersticas de las Enterobacterias; Las Enterobacteriaceae son bacilos Gram negativos, aerobios y anaerobios facultativos, no esporulados, mviles o inmviles, que fermentan la glucosa, reducen nitratos y nitritos, son citocromo oxidasa negativos y catalasa positivos. Principales enterobacterias; De los integrantes de la familia unos fermentan la lactosa y otros no. Incluye los siguientes gneros: No fermentadores de lactosa Salmonella Shigella Edwarsiella Hafnia Proteus Providencia Yersinia Morganella Erwinia Fermentadores de lactosa

Escherichia Enterobacter Citrobacter Serratia (a veces) Klebsiella (excepto.Kb. rhinoscleromatis)

B. El sistema BBL Enterotube II Batera de pruebas incluidas y tablas de lectura con coloraciones positivas y negativas

BBL Enterotube II es un tubo de plstico con compartimientos, formado por 12 medios de cultivo diferentes, que permiten la determinacin de 15 reacciones bioqumicas. Est concebido para la inoculacin simultnea de los 12 medios con una sola colonia, utilizando, la aguja de inoculacin dispuesta en el centro. La combinacin de reacciones resultante, junto con la gua de interpretacin (libro de cdigos), permite la identificacin de Enterobacteriaceae con importancia clnica.

Las reacciones bioqumicas: Prueba Glucose Reaccin / Enzimas fermentacin de glucosa Negativo rojo (a naranja) Positivo amarillo (a dorado)

sin desprendimiento sin desprendimiento de

Gas Lysine Ornithine H2S Indole Adonitol Lactose Arabinose Sorbitol VP Dulcitol PA Urea Citrate

produccin de gas en la fermentacin de la glucosa lisina descarboxilasa ornitina descarboxilasa produccin de H2S produccin de indol produccin de adonitol fermentacin/oxidacin de lactosa fermentacin/oxidacin de arabinosa fermentacin/oxidacin de sorbitol produccin de acetona (Voges-Proskauer) utilizacin del dulcitol fenilalanina descarboxilasa ureasa utilizacin del citrato

sin desprendimiento sin desprendimiento de de cera cera amarillo amarillo de beige a mbar claro incoloro rojo (a naranja) rojo (a naranja) rojo (a naranja) rojo (a naranja) de incoloro a mbar claro verde cualquier tono de verde de incoloro a mbar claro verde morado morado negro rojo o rosa amarillo (a dorado) amarillo (a dorado) amarillo (a dorado) amarillo (a dorado) rojo amarillo (a dorado) de negro a gris oscuro de rosa claro a rosa azul

Gua de interpretacin

Para ms informacin vaya a consultar en los documentos del curso la informacin de las casas comerciales.

C. Procedimiento de inoculacin y lectura del sistema de identificacin A partir de un cultivo puro de bacterias Gram negativas, podemos discernir, mediante la prueba de la oxidasa qu sistema de identificacin utilizar. En el siguiente diagrama de flujo se muestra cundo debe utilizarse BBL Enterotube II o BBL Oxi/Ferm Tube II:

Para la inoculacin de BBL Enterotube II, se puede utilizar crecimiento de agar MacConkey (MAC), agar Eosina Azul de Metileno (EMB), agar Salmonella Shigella (SS) o agar Hektoen Entrico (HE), o medios de agar sangre no selectivos. El cultivo utilizado para la inoculacin debe tener por lo menos 18 h, pero generalmente no ms de 48 h. Es necesario asegurarse de que el aislado a identificar con BBL Enterotube II proceda de un cultivo puro de un bacilo gram negativo. BBL Enterotube II puede utilizarse solamente en colonias con resultados negativos a la oxidasa, ya que los organismos positivos a la oxidasa (diferentes de Enterobacteriaceae) requieren el uso de BBL Oxi/Ferm Tube II para su identificacin. Procedimiento Inoculacin (ver vdeo del procedimiento de inoculacin). Requiere QuickTime 1. Preparar una hoja del bloc de cdigos para el aislado con el nombre del paciente, el nmero de muestra y la fecha. Nota: El usuario puede decidir si desea utilizar la base de datos con o sin VP. Segn esta decisin, utilizar el anverso o el reverso del bloc de cdigos. Si se selecciona la base de datos sin VP, tal vez sea necesario realizar la reaccin de VP como prueba complementaria para los organismos seleccionados. 2. Etiquetar el Enterotube II correctamente

3. Retirar las dos tapas. La punta de la gua de inoculacin se encuentra debajo de la tapa blanca. No someter al calor la gua.

4. Seleccionar una colonia bien aislada directamente con la punta de la gua de inoculacin BBL Enterotube II. Se debe observar una cantidad visible de inculo en la punta y en el costado de la gua. No tocar el agar con la gua.

5. Inocular el Enterotube II primero retorciendo la gua y luego retirando la gua por todos los compartimientos y aplicando un movimiento giratorio.

6. Volver a insertar la gua (sin esterilizar) en BBL Enterotube II, utilizando un movimiento giratorio en todos los compartimientos, hasta que la muesca de la gua se alinee con la abertura del tubo. La punta de La gua debe estar visible en el compartimiento de citrato. Cortar la gua en la muesca mediante torsin.

7. Con la parte restante de la gua, hacer orificios a travs del papel metalizado que cubre las entradas de aire de los ltimos ocho compartimientos (adonitol, lactosa, arabinosa, sorbitol, VogesProskauer, dulcitol/PA, urea y citrato) para favorecer el crecimiento aerobio en estos compartimientos. Volver a colocar las tapas.

8. Incubar a 35 o 37 C durante 18 - 24 h sobre una superficie plana o en posicin vertical. Permitir la circulacin de aire entre los tubos incubados.

9. Efectuar la interpretacin y registrar todas las reacciones con excepcin de indol y Voges-Proskauer. Se debe efectuar la lectura de todas las dems pruebas antes de realizar las pruebas de indol y Voges-Proskauer, puesto que los reactivos aadidos a estas pruebas pueden alterar las dems reacciones de BBL Enterotube II.

Revelado (ver vdeo del procedimiento de revelado). Requiere QuickTime Adicin de los reactivos indol y Voges-Proskauer:

Para realizar la prueba de indol: Colocar BBL Enterotube II en la gradilla con el compartimiento de glucosa hacia abajo o colocar el sistema en posicin horizontal y aadir una o dos gotas de reactivo Kovacs a travs de la pelcula plstica del compartimiento de H2S/indol con una aguja o jeringa o haciendo un orificio mediante calor en la pelcula plstica mediante una aguja de inoculacin caliente o pipeta desechable y vertiendo el reactivo en el compartimiento. Permitir que el reactivo entre en contacto con la superficie del medio o la superficie interna de la pelcula de plstico. Una prueba positiva se indica por la aparicin de color rojo en el reactivo aadido sobre la superficie del medio o la pelcula de plstico a los 10 seg.

Para realizar la prueba de Voges-Proskauer: Esta prueba es obligatoria si se selecciona la base de datos con VP. Tambin puede ser necesario realizar esta prueba si se requiere como prueba de confirmacin al utilizar la base de datos sin VP.

Respecto a la prueba de indol, colocar BBL Enterotube II en la gradilla con el compartimiento de glucosa hacia abajo o colocar el sistema en posicin horizontal y aadir: VP1- Dos gotas de solucin de hidrxido de potasio al 20% con 0,3% de creatina VP2- Tres gotas de alfanaftol al 5% en alcohol etlico puro. Una prueba positiva se indica por la aparicin de un color rojo a los 20 min.

D. Interpretacin de resultados Seguir las instrucciones suministradas a continuacin para identificar el aislado. Nota: Si no se registra cambio de color o se observa un color naranja en el compartimiento de glucosa y el crecimiento es evidente por los cambios de color en otros compartimientos, el organismo no es miembro de la familia Enterobacteriaceae. Lectura de los resultados (ver vdeo del procedimiento de lectura de resultados). Requiere QuickTime 1. Despus de 18 - 24 h de incubacin, efectuar la interpretacin de todas las reacciones, con excepcin de indol y VP, efectuar la lectura de las reacciones de manera secuencial, comparando los colores de los medios en el tubo despus de la incubacin con aquellos que se suministran en el esquema de colores. Todas las reacciones positivas, pueden ser de igual, mayor o menor intensidad que los colores indicados en el grfico de reacciones de colores.

Vista delantera

2. Indicar cada resultado de prueba positivo marcando con un crculo el nmero que aparece debajo del compartimiento apropiado en el bloc de resultados.

3. Finalmente, realizar las pruebas de indol y VP. En caso de resultado positivo, marcar con un crculo los nmeros apropiados en la hoja preparada. Las pruebas de VP son obligatorias slo si se utiliza la base de datos con VP.

Vista trasera tras revelar indol y VP

4. Sumar tos nmeros marcados con un crculo en la seccin entre corchetes e ingresar la suma en el espacio suministrado debajo de las flecha.

5. Buscar el nmero de cinco dgitos en la gua de interpretacin y encontrar la o las mejores respuestas en la columna denominada "ID Value" (valor de ID). Asegurarse de utilizar la base de datos correcta [(1) No fermentadores negativos a la oxidasa (2) Enterobacteriaceae mtodo sin VP y (3) Enterobacteriaceae - mtodo con VP].

E. Entrenamiento en la lectura de los resultados positivos o negativos de cada prueba En las tablas de lectura del comienzo de este ejercicio se muestran los colores de los resultados positivos y negativos para cada prueba. Para irse familiarizando con dichos resultados le proponemos realizar estos ejercicios de entrenamiento aconsejando que consulte tambin la gua de interpretacin de resultados a que nos hemos referido anteriormente (colores en modo imagen y en modo texto). Para ello: Observe la imagen del supuesto prctico para cada prueba (columna) Compare con las imgenes de resultados positivos y negativos de esa prueba de esta tabla y de las otras 2 anteriores, y Conteste a la preguntas de entrenamiento para esa prueba, haciendo clic sobre la letra azul que antecede a la opcin. Pruebas Glucosa Gas Lisina Ornitina H2S Indol Adonitol

Supuesto prctico

RESULTADO: Contestar Preguntas a ) Negativo de entrenamiento b ) Positivo Pruebas Lactosa

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo Arabinosa

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo Sorbitol

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo VP

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo Dulcitol/PA

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo Urea

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo Citrato

Supuesto prctico

RESULTADO: Contestar Preguntas a ) Negativo de entrenamiento b ) Positivo

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo

RESULTADO: a ) Negativo b ) Positivo

G. Supuesto prctico: Identificacin de tres aislados problema En los 5 casos del supuesto prctico realize lo siguiente: Interpretar y anotar los resultados positivos o negativos de cada una de las 15 pruebas. Ver gua de interpretacin de resultados. Codificar los 5 tripletes Obtener el perfil numrico de 5 cifras e introducirlo en el rea correspondiente para su envo al servidor Convertir ese perfil numrico en el nombre de la especie o gnero a la que pertenece utilizando un extracto de la basa de datos Ver extracto de base de datos con algunos perfiles numricos Aislado # 1 del supuesto prctico

Resultados

Pregunta 1. Marque el perfil numrico de 5 cifras: Perfil numrico

a) 75240

Ver perfiles numricos

b) 64060 c) 76151 Pregunta 2. Haga clic sobre el radio botn de la especie a la que corresponden los resultados y el perfil numrico obtenido

Identificacin

a) Acinetobacter calcoaceticus b) Enterobacter cloacae c) Enterobacter gergoviae d) Escherichia coli e) Hafnia alvei

f) Klebsiella oxytoca g) Klebsiella pneumoniae h) Plesiomonas shigelloides i) Proteus mirabilis j) Proteus vulgaris

Aislado # 2 del supuesto prctico

Resultados

Pregunta 3. Marque el perfil numrico de 5 cifras: Perfil numrico Ver perfiles numricos a) 64060 b) 76141 c) 75151 Pregunta 4. Haga clic sobre el radio botn de la especie a la que corresponden los resultados y el perfil numrico obtenido

Identificacin

a) Pasteurella multocida b) Plesiomonas shigelloides c) Proteus mirabilis d) Proteus vulgaris e) Pseudomonas aeruginosa

f) Salmonella arizonae g) Salmonella gallinarum h) Salmonella paratyphi A i) Salmonella spp. j) Serratia marcescens

Aislado #3 del supuesto prctico

Resultados

Pregunta 5. Marque el perfil numrico de 5 cifras: Perfil numrico Ver perfiles numricos a) 76151 b) 77750 c) 66027

Pregunta 6. Haga clic sobre el radio botn de la especie a la que corresponden los resultados y el perfil numrico obtenido a) Serratia marcescens Identificacin b) Serratia odorifera c) Serratia rubidae d) Shigella boydii e) Salmonella sp. subsp choleraesuis Aislado #4 del supuesto prctico f) Vibrio cholerae g) Vibrio parahemolyticus h) Yersinia enterocolitica i) Yersinia pseudotuberculosis j) Yersinia ruckeri

Resultados

Pregunta 7. Marque el perfil numrico de 5 cifras: Perfil numrico Ver perfiles numricos a) 44102 b) 44121 c) 50733 Pregunta 8. Haga clic sobre el radio botn de la especie a la que corresponden los resultados y el perfil numrico obtenido a) Serratia marcescens Identificacin b) Serratia odorifera c) Serratia rubidae d) Shigella boydii e) Shigella flexneri Aislado #5 del supuesto prctico f) Vibrio cholerae g) Vibrio parahemolyticus h) Yersinia enterocolitica i) Yersinia pseudotuberculosis J) Yersinia ruckeri

Resultados

Pregunta 9. Marque el perfil numrico de 5 cifras: Perfil numrico Ver perfiles numricos a) 66027 b) 74573 c) 65153 Pregunta 10. Haga clic sobre el radio botn de la especie a la que corresponden los resultados y el perfil numrico obtenido

Identificacin

a) Serratia marcescens b) Serratia odorifera c) Serratia rubidae d) Shigella boydii

f) Vibrio cholerae g) Vibrio parahemolyticus h) Yersinia enterocolitica i) Yersinia pseudotuberculosis

e) Proteus mirabilis

j) Yersinia ruckeri

Las galeras de identificacin utilizadas en la simulacin de este ejercicio has sido facilitados

por Becton Dickinson Diagnostics

H. Comprobar resultados del ejercicio

OBTENER RESULTADOS

Laboratorio de Tecnologa Educativa. Departamento de Microbiologa y Gentica. Universidad de Salamanca.