Leccin 1. Los virus. Caractersticas generales. Esquema del tema: Desarrollo histrico de la virologa. Caractersticas diferenciales de los virus.

s. Componentes de las partculas vricas. cido nucleico. La cpside. La envoltura. Generalidades sobre la multiplicacin de virus. Introduccin a la taxonoma de virus. 1. Desarrollo histrico de la virologa. La Virologa es la materia que se ocupa del estudio de los virus. Es interesante su estudio en Farmacia por:

Importancia clnica de estos seres. Son los causantes de numerosas enfermedades. Los virus son importantes herramientas en investigacin. Utilizando virus se ha avanzado en la Biologa Molecular, conocimiento de genes, de mecanismos de replicacin, trascripcin, c. nucleicos, etc. Los genomas de los virus son muy usados en Ingeniera Gentica como vectores para transferir genes de unos individuos a otros. Tienen importancia biolgica. Todos los seres vivos del planeta tienen virus que los parasitan.

La virologa como ciencia exista desde la antigedad, aunque no se conoca el origen de las enfermedades infecciosas, s que se conocan enfermedades como la Polio (poliomielitis), la rabia y la viruela. Hoy sabemos que estas enfermedades est ocasionadas por virus. Tambin se intentaba controlar algunas de estas enfermedades de forma emprica. As, en China y algunos otros pases, exista la costumbre de que las madres, para proteger a sus hijos de la viruela, inoculaban costras de enfermos de viruela. Esta prctica fue observada en Turqua por M. Montague (1721), quien la introdujo en Inglaterra y de esta forma muchas personas quedaban protegidos, pero otras seguan muriendo, por lo que esta prctica dejo de utilizarse. En 1798, el mdico ingls E. Jenner, observ que las personas en contacto con ganado vacuno, a veces resultaba infectados por una forma de viruela que era muy benigna (la persona no mora) y stas personas luego no padecan la viruela humana. Entonces comenz a inocular a las personas con material procedente de pstulas de vacas enfermas de viruela vacuna, inventando la VACUNACIN. El descubrimiento de los virus se atribuye a dos cientficos: Ivanowski (1892) y Beijerinck (1898). Estos cientficos descubrieron los virus de forma independiente. Trabajaban con plantas de tabaco que tenan una enfermedad llamada mosaico (las hojas tienen zonas con diversos colores), e intentaban averiguar el origen. Hacan extractos con las plantas infectadas, los cuales se hacan pasar por unos filtros que retenan los microorganismos conocidos hasta entonces (bacterias, hongos, protozoos, etc), con la esperanza de que los agentes causantes del mosaico quedaran retenidos en el filtro. Pero se comprob que el agente pasaba los filtros ya que al inocular el filtrado en plantas sanas, stas enfermaban. Estos autores dedujeron que el mosaico del tabaco (VMT) estaba producido por un agente muy pequeo que atravesaban los filtros y los denominaron VIRUS FILTRABLES (que viene de veneno). El descubrimiento de los virus filtrables en animales lo hicieron en 1898 los cientficos Loeffler y Frosch, dando a conocer los virus de la glosopeda de las vacas. El descubrimiento de virus en el hombre, lo hizo Walter Reed en 1900, en personas infectadas con la fiebre amarilla. A partir de este hecho, se fueron descubriendo nuevos

virus filtrables. En el ao 1916, Twort, y en 1917, D'Herelle, descubrieron virus en bacterias. Todava no se saba cmo eran esos seres, hasta que en 1935, Stanley cristaliza el virus del mosaico del tabaco (por una tcnica que cristalizaba protenas). Entonces dedujo que los virus filtrables estaban formados solo por protenas. Pero dos aos ms tarde, en 1937, Bawder y Pirie, determinaron que adems de protenas tenan c. nucleico, siendo en el caso del VMT el ARN. En 1940, Delbruck descubri cmo era el ciclo de multiplicacin de los virus bacterianos. Se saba que no podan crecer en medios de cultivo normales, pero s que lo hacan en seres vivos. Entonces, al estudiar el ciclo, se vio que los virus necesitaban crecer dentro de las clulas. Ms tarde se estudi en virus de clulas animales, haciendo cultivos de virus en clulas animales. 2. Caractersticas diferenciales de los virus. En los comienzos de la virologa, los virus se definan en trminos negativos:

No eran retenidos por filtros que retenan microorganismos conocidos. No eran visibles al microscopio ptico. No se podan cultivar en medios de cultivo tradicionales para bacterias. Estas caractersticas, sin embargo, o no son del todo ciertas o no son exclusivas. Se han desarrollado filtros que son capaces de retener a virus (y sustancias ms pequeas). El tamao de los virus es pequeo 25-300nm. Algunos se pueden ver al microscopio ptico (como el virus de la viruela). Hay virus que son ms grandes que algunas bacterias, como el de la viruela, que es ms grande que las clamidias. Los virus necesitan ser cultivados en clulas vivas. Tambin existen microorganismos que tambin tienen que ser cultivados sobre clulas vivas. Los virus, se definen por dos caractersticas fundamentales: A. Organizacin. Los virus no son seres celulares. Son diferentes de los organismos celulares, no tienen organizacin ni eucariota ni procariota. Las partculas virales constan de un genoma formado por DNA o RNA (nunca por ambos), una cubierta proteica llamada cpside y en ocasiones por una envoltura membranosa. B. Ciclo de multiplicacin. Los virus slo pueden multiplicarse en el interior de clulas vivas. No pueden sintetizar ATP ni protenas, ya que no poseen las estructuras necesarias para esta sntesis. Entonces, los virus son parsitos intracelulares obligados. El ciclo de multiplicacin se diferencia en dos etapas:

Extracelular. Fuera de la clula hospedadora. Intracelular. Dentro de la clula hospedadora. A la partcula viral en estado extracelular se la denomina normalmente virin. Un virin es una partcula viral completa, es decir, con c. nucleico y cubierta protectora. El trmino virus es ms amplio que el de virin, ya que se aplica a todas las entidades virales presentes durante todo el ciclo de multiplicacin (intra y extracelular). Cuando los viriones (enteros o en parte) penetran en el interior de la clula hospedadora, comienza la fase intracelular y la multiplicacin del virus. Normalmente el genoma queda libre de las cubiertas protectoras, y se usa la maquinaria metablica de la clula hospedadora para sintetizar nuevos componentes de virus, que se ensamblan para formar partculas virales, que salen de la clula y que son capaces de infectar nuevas clulas. En un virus, el genoma vrico es esencial. La funcin de las cubiertas del virin, es proteger al genoma fuera de la clula hospedadora y transportarlo de una clula a otra.

Definicin de VIRUS. Son seres de organizacin muy sencilla, acelulares. La partcula vrica completa o virin est constituido por el genoma (que consta de DNA o RNA) y unas cubiertas protectoras. Estos seres son parsitos intracelulares obligados que utilizan la maquinaria de la clula hospedadora para sintetizar nuevos viriones que infectan otras clulas. Segn Darnell y Luria (1967), un virus se define como aquella entidad cuyo genoma son elementos de c. nucleico que se replican en el interior de las clulas vivas, usando la maquinaria biosinttica celular para sintetizar elementos especializados (partculas virales o viriones) que pueden transferir el genoma viral a otras clulas. A la pregunta de si los virus son seres vivos, existen varias respuestas aceptadas, segn la opinin de cada uno. En general se puede decir que tienen dos caractersticas fundamentales:

Son capaces de llevar a cabo un metabolismo. Son capaces de replicarse o reproducirse (o multiplicarse). Los virus, fuera de las clulas (viriones), no son capaces de llevar a cabo metabolismo ni multiplicarse. Pero dentro de la clula hospedadora, los virus pueden usar la maquinaria celular para multiplicarse. En muchas ocasiones se acepta que se comportan como seres vivos intracelulares. Respecto al origen de los virus, existen varias teoras que intentan explicarlo: Son los seres ms primitivos, debido a su sencilla estructura. Pero los virus tienen que haber surgido despus de las clulas (o simultneamente), ya que necesitan de ellas para desarrollarse. Los virus se originaron a partir de los organismos celulares. Existen dos tendencias principales dentro de esta teora:

Se originaron a partir de unas clulas, posiblemente procariotas, que parasitaban otras clulas, y que fueron perdiendo estructuras hasta quedarse en forma de virus. Es poco probable porque son muy diferentes a las clulas procariotas y adems no se han encontrado estructuras intermedias. Se originaron a partir de parte del genoma de clulas que se hizo autnomo (plsmidos, elementos transponibles). Pero queda por solventar cmo estas porciones de genoma adquirieron la cubierta proteica o cpside. 3. Componentes de las partculas vricas. Todos los viriones estn constituidos por material gentico DNA o RNA (pero no ambos) y una cpside formada por protenas. Al conjunto del genoma y de la cpside se le denomina ncleo cpside, que puede estar rodeada o no de una envoltura. Podemos diferenciar varios tipos de virus en funcin de su constitucin: desnudos o con envoltura. Los virus desnudos, segn el tipo de cpside, se diferencian en 3 tipos:

Icosadricos. La cpside es un icosaedro. Helicoidales. La cpside es un cilindro hueco. Complejos. Tienen diferentes estructuras anejas a la cpside (cola,..). Los virus con envoltura se diferenciar tambin en tres tipos: Icosadricos. Helicoidales. Complejos. A. cido nucleico.

Los virus son muy variables en cuanto a la naturaleza de su material gentico. El material gentico presente en el virin es RNA o DNA, pero nunca ambos a la vez. Existen unos virus que pueden usar tanto RNA como DNA como material gentico, pero en diferentes fases del ciclo de multiplicacin. P. ej. retrovirus (los viriones tienen RNA, pero se replica el genoma a partir de una forma intermedia de DNA), hepatitis B (tiene DNA dentro del virin pero en la replicacin del genoma se usa RNA como forma intermedia). Tanto se trata de DNA como de RNA, el material gentico del virus lleva la informacin necesaria para la replicacin del virus y formacin de nuevos viriones. El tamao del genoma de los virus es muy variable, los ms pequeos tienen 3 4 genes, mientras que los ms complejos pueden tener varios cientos. En general, los virus son haploides, slo tienen una sola copia del genoma, pero existen casos de retrovirus cuyo genoma est constituido por dos fragmentos de DNA iguales, lo que les hace diploides. Si existen varios fragmentos de material gentico pero que son diferentes, son haploides. 1. DNA viral. En algunos casos puede ser de cadena sencilla, monocatenario, aunque en la mayora de los virus con DNA, es de cadena doble.

El DNA de cadena sencilla, puede ser: De cadena lineal. Como los virus animales (p. ej. Parvovirus). De cadena circular. Como X174 (virus de bacteria).

El DNA de cadena doble puede ser: De cadena lineal. Como los Herpesvirus. De cadena circular. Como los Papovavirus. En ocasiones, primero es lineal y luego se vuelve circular, como en el caso del virus (lambda). 2. RNA viral. La mayora tiene una cadena sencilla de RNA. Slo algunos tienen cadena doble. En la mayora de los casos, es lineal, siendo muy pocos casos aislados los de cadena circular. El RNA de cadena sencilla o doble tiene informacin para la sntesis de nuevos virus. Este concepto se descubri por primera vez en el VMT. En los aos `50, trabajando con este virus se descubri que al purificar el RNA de cadena sencilla de este virus e introducirlo en clulas de plantas sanas, el virus se reproduce, crendose nuevos virus. Posteriormente se descubri que en otros virus RNA, al purificar el RNA no se consegua infectar otras clulas y producir nuevos virus. Estos experimentos llevaron a la divisin de los virus RNA de cadena sencilla en dos grupos:

Virus RNA de cadena positiva (RNA +). Son aquellos en los que el RNA purificado es capaz de infectar a las clulas con produccin de nuevos virus. Esto se debe a que el RNA del virus tiene la misma secuencia de bases que los RNAm, que por definicin se consideran de cadena +. Entonces, el RNA puro, al penetrar en la clula, es capaz de unirse directamente a los ribosomas, actuando como mensajero y sintetizando ya protenas vricas (enzimas y estructurales). Virus RNA de cadena negativa (RNA -). Son aquellos que por s solos (al estar purificados) no son capaces de infectar nuevas clulas y producir nuevos virus. En estos virus el RNA del genoma, tiene una secuencia de bases complementarias con los RNAm. Entonces cuando entra en la clula hospedadora, el RNA tiene que entrar acompaado de una enzima vrica que a partir del genoma sintetice RNAm. En los virus RNA, la mayora de los casos, el genoma est formado por una nica molcula de RNA, pero hay casos de virus en los que el genoma est formado por varias

molculas de RNA (virus con genoma fragmentado o segmentado). Esto puede darse tanto en virus de cadena sencilla (p. ej. virus de la gripe) o pueden ser varios fragmentos de RNA de cadena doble (p. ej. Reovirus), siendo los fragmentos diferentes (entonces haploides), a excepcin de retrovirus como el del SIDA (diploide). Algunos virus de plantas tienen genoma RNA segmentado, pero los diferentes fragmentos del genoma estn incluidos en cpsides diferentes, denominndose entonces virus multiparticulados, ya que el virus est formado por varias partculas. Entonces, para infectar a una clula, tiene que ser infectada por varios de estos virus a la vez. B. Cpside. Es una estructura que rodea y protege al genoma vrico y est formado por unas protenas codificadas por genes del virus. Estas protenas que forman la cpside se denominan protmeros. Las cpsides pueden ser de 3 tipos:

Helicoidales. - Icosadricas. - Complejas. 1. Helicoidales. Son las ms sencilla de todas. Estn formadas por un slo tipo de protmero que se va enrrollando, formando un tubo hueco. Las protenas se enrrollan en forma de hlice. En el centro queda un espacio para que se site el genoma del virus. Estas cpsides, en el caso de virus desnudos, son rgidas (p. ej. VMT), mientras que en los que tienen envoltura, son flexibles y se pliegan en el interior de la envoltura. 2. Icosadricas. Estas cpsides tienen como estructura bsica un cuerpo geomtrico que es el icosaedro, que tiene 20 caras triangulares y 12 aristas. En virus sencillo, la cpside es un icosaedro como tal, pero en los ms complejos, cada cara triangular se divide en otra serie de tringulos. Las protenas de la cpside se agrupan para formar unas unidades estructurales llamadas capsmeros, que tienen forma de anillos. Los capsmeros son fundamentalmente de 2 tipos:

Formados por 6 protenas, 6 protmeros (hexonas o hexones). Se sitan en caras y aristas del icosaedro. Formados por 5 protenas, 6 protmeros (pentonas o pentones). Se localizan en los vrtices del icosaedro. 3. Complejas. Tienen varias estructuras: cabeza, cola y otras. Estas cpsides se estudiaran en cada caso de virus concreto. C. Envoltura. Es una capa membranosa que rodea la nucleocpside en diferentes virus, principalmente en virus animales (p. ej. en el de la gripe), aunque tambin existe en virus bacterianos, pero es menos frecuente. Esta envoltura tiene una estructura de membrana, con bicapa lipdica con protenas:

Los lpidos de la envoltura proceden de las membranas de la clula hospedadora, ya que la envoltura se origina de membranas celulares como membrana plasmtica, membrana nuclear o membranas de vesculas, ... Las protenas estn codificadas por genes del virus. Estas protenas durante la formacin de la envoltura emigran a la membrana celular correspondiente donde se vaya a formar la envoltura y sustituyen a las protenas de la clula hospedadora. Estas protenas que forman parte de la envoltura, se diferencian en dos tipos: Glucoprotenas (o glucoprotenas). Tienen unidas azcares. Estn incluidos en envoltura, pero sobresalen de ella. Concretamente, la parte glucdica sobresale

hacia el exterior. A veces forman una estructura en la superficie externa del virus, formando unas protuberancias que se ven al microscopio electrnico, denominadas espculas (aunque a veces de se denominan peplmeros).Las glucoprotenas tienen varias funciones:

Sirven de unin a clulas hospedadoras. Algunos virus contienen glucoprotenas que les permite unirse a glbulos rojos (pero no los infectan), entonces sirven para unir diferentes glbulos rojos entre s, formando agregados (aglutinan). Entonces se dice que llevan a cabo hemaglutinacin. Esta capacidad se usa para realizar una prueba de deteccin de virus (ensayos de hemaglutinacin). Alguna glucoprotenas tienen actividad enzimtica. Un ejemplo es una glucoprotena del virus de la gripe (y otros) que tiene una actividad enzimtica llamada neuraminidasa, ya que es capaz de romper azcares derivados del c. neuramnico (presente en la superficie de clulas hospedadoras). Esta enzima le sirve al virus para, por una parte, salir de las clulas que infecta, porque en las clulas hospedadoras estos azcares forman una maraa que impiden salir a los virus. Por otra parte, esta actividad tambin sirve al virus para penetrar en las clulas y para penetrar en las mucosas. Existen medicamentos que inhiben la neuraminidasa. Las glucoprotenas son los principales antgenos de los virus que tiene envoltura, ya que estn localizadas en la superficie del virus, y son las primeras estructuras que localiza el sistema inmune, Entonces, tienen importancia clnica, existiendo algunas pruebas de deteccin de virus que se basan en reacciones Antgeno-Anticuerpo.
o

Protenas matriz. Estn insertadas en la bicapa lipdica pero no suelen sobresalir al exterior. A veces se localizan debajo de la bicapa lipdica formando una especie de capa llamada matriz. Esta protena confiere cierta estabilidad y rigidez a la envoltura (si no, sera muy flexible). D. Otros componentes de los viriones. Existen virus que en su interior contienen enzimas que estn codificadas por el genoma del virus. Estas enzimas son importantes en el ciclo de multiplicacin del virus, y suelen acompaar al genoma porque normalmente intervienen en su replicacin. P. ej.:

En virus RNA de cadena sencilla -, y virus RNA de cadena doble tienen acompaando al genoma una RNA polimerasa dependiente de RNA, que sintetiza RNA tomando RNA como molde. En retrovirus, en el ciclo de multiplicacin, a partir del RNA que forma su genoma, se forma DNA. Este proceso lo lleva a cabo una enzima que est dentro del virin, llamada DNA polimerasa dependiente de RNA (tambin llamada transciptasa inversa). Los Arenavirus llevan en su interior ribosomas de la cl. hosp., pero no se sabe si tienen funcin. 4. Generalidades sobre la multiplicacin de virus. Los virus deben multiplicarse dentro de clulas vivas. En su ciclo de multiplicacin hay varias etapas:

Unin del virin a la clula hospedadora. Entrada o penetracin al interior de la clula hospedadora. Segn el tipo de virus, entrar en virin entero, el genoma o parte (lo importante es que entre el genoma). Sntesis de componentes virales. El genoma del virus, suele quedar libre dentro de la clula hospedadora y usando la maquinaria biosinttica de la clula se sintetizan c. nucleicos y protenas (enzimas, estructurales, ...). Ensamblaje de los componentes de los virus para formar nuevas partculas vricas (proceso tambin llamado maduracin).

Liberacin de los nuevos virus de la clula hospedadora, que ya pueden infectar otras clulas. Pueden producirse con o sin rotura de la clula, dependiendo de los virus. La duracin del ciclo de multiplicacin es variable. En bacterias pueden durar hasta 20-25 minutos (los ms rpidos). En virus que afectan a animales, normalmente son ciclos ms largos, durando 5-50 horas. Durante el ciclo de un virus se diferencian varios perodos de tiempo:
o

Perodo de eclipse. Durante este periodo de tiempo, no se observan virus dentro de la clula. En este perodo se estn sintetizando los diferentes componentes virales. El perodo de eclipse dura desde que se inicia la infeccin hasta que se sintetiza la primera partcula de virus. Perodo de acumulacin intracelular. Una vez que se ha sintetizado la primera partcula, antes de que se liberen los virus. Es el tiempo en el cual se acumulan virus dentro de la clula hospedadora. Este perodo finaliza cuando se comienzan a liberar virus de las clulas. Tambin se habla del perodo de latencia, que es el tiempo que transcurre desde la infeccin de una clula por un virus y la liberacin de virus al medio. Por lo tanto, el perodo de latencia puede considerarse como la suma del perodo de eclipse y el perodo de acumulacin intracelular. 5. Introduccin a la taxonoma de virus. La taxonoma de virus est poco desarrollada. Los virus se dividen segn el tipo de hospedador en: - Virus de animales. - Virus de plantas. - Virus de bacterias. - Virus de hongos. En los comienzos de la virologa, los cientficos que estudiaban cada grupo, no se ponan de acuerdo. En 1966, se cre el Comit Internacional para la Taxonoma de Virus. Este organismo intenta establecer una clasificacin uniforme para todos los virus. El ltimo informe se emiti en 1995 por Murphy & Co. Este comit ha creado una serie de grupos de virus. Para ello se ha basado en unos caracteres de los virus:

Caractersticas morfolgicas y estructurales. Forma del virin, simetra de la cpside (icosadrica, helicoidal, compleja), presencia o no de envoltura, tamao del virin. Caractersticas del c. nucleico (o genoma). Tipo de c. nucleico (DNA o RNA), cadena sencilla/doble. Los de RNA de cadena sencilla, polaridad + -, n de fragmentos. Caractersticas referentes a la multiplicacin. Mecanismo de entrada del virus en la clula, localizacin de la multiplicacin/replicacin dentro de la clula, peculiaridades en transcripcin y traduccin de protenas, mecanismo de salida (liberacin) del virus. Caractersticas de protenas vricas. Nmero de protenas que forman el virus (estructurales y enzimas), presencia de enzimas especiales (como la transcriptasa inversa). Propiedades clnicas y biolgicas. Tipo de hospedador (animal, planta, bacteria u hongo), tipo de enfermedad que produce, modo de transmisin de la enfermedad. Otras caractersticas. Propiedades inmunolgicas (reaccin antgeno-anticuerpo). Estos caracteres diferencian a los virus en grupos: Orden, Familia, Subfamilia, Gnero y Especie. El grado de Orden est en desarrollo. Hasta 1995 slo haba uno. Se estn desarrollando segn el c. nucleico. Para nombrar estos grupos, en virus, de Orden, Familia, Subfamilia y Gnero, deben escribirse en cursiva o subrayados, y con la primera letra mayscula. La Especie no se escribe ni en cursiva ni subrayado. Cada grupo tiene una determinada terminacin (sufijo):
o

Orden: -virales

o o o o

Familia: -viridae (Herpesviridae). Subfamilia: -virinae (Alphaherpesvirinae). Gnero: -virus (Simplexvirus). Especie: no tienen una forma determinada. Normalmente se suelen denominar en animales y plantas por el nombre de la enfermedad que producen (p. ej. virus herpes humano tipo 2), y los que infectan a bacterias con nombres alfanumricos ( , X174, T4). nota: A veces se puede referir a los grupos, de manera informal, sin subrayar y sin poner en cursiva. Es muy frecuente referirse a las familias terminando en -virus (p.ej. herpesvirus, poxvirus). La desventaja es que puede llevar a equvocos por no poder diferenciar entre familia y gnero. Leccin 2. Mtodos de estudio de virus. Esquema del tema: 1. Cultivo de virus. 2. Mtodos de deteccin y cuantificacin de virus.

o o o o o

Mtodos fisicoqumicos: Observacin de virus al microscopio electrnico. Ensayos de hemaglutinacin. Estudios de infectividad. Mtodos inmunolgicos para el estudio de virus. Deteccin de c. nucleicos de virus. 1. Cultivos de virus. Los virus se han de cultivar sobre clulas adecuadas. Depende del virus del que tratemos (si son de plantas, bacterias, animales,...). Los ms fciles de cultivar son los virus de bacterias. Se cultivan sobre cultivos de bacterias en medio lquido o slido. Los virus animales, se pueden cultivar de diferentes formas:

En animales enteros. As se haca en el comienzo de la virologa. En la actualidad se usa poco. En huevos embrionados de gallina. En huevos fecundados despus de 6-8 das a partir de la puesta. Tambin pueden ser de otras aves. Los virus se inyectan en el interior del huevo con una jeringa y dependiendo del tipo de virus se deben inyectar en una regin determinada. En cultivos de clulas animales. Es la forma ms usada. Pueden ser de 3 tipos fundamentalmente: cultivos primarios. Es aquel que se obtiene directamente a partir de un tejido animal. Para obtener un cultivo de este tipo, se parte de un tejido aislado, que se deposita en recipientes adecuados, que pueden ser placas petri, botellas tumbadas, erlenmeyer, etc. Luego se aade un medio de cultivo adecuado, normalmente lquido. Estos medios de cultivo son muy ricos, conteniendo vitaminas, aminocidos, sales, suero, p. ej. uno muy usado es el medio EAGLE. Las clulas comienzan a dividirse en el fondo del recipiente, cubriendo este fondo, formando normalmente una monocapa de clulas. Los cultivos primarios se mantienen cambiando el medio de cultivo 2 3 veces por semana, pero al cabo de varias semanas, los cultivos terminan muriendo.

En ocasiones, tomando unas pocas clulas de un cultivo primario, y depositndolas en otro recipiente, comienzan a dividirse y se obtienen lo que se denomina una cepa celular.
o

Cepa celular. Estas cepas celulares sirven para producir ms cultivos. Se pueden subcultivar (cultivar varias veces). Entonces, una cepa celular es un cultivo de clulas animales obtenido a partir de un cultivo primario y cuyas clulas pueden ser subcultivadas varias veces. Las cepas celulares con el tiempo degeneran, no pudiendo volver a subcultivarse. Se pueden obtener cultivos primarios y cepas celulares a partir de diferentes tejidos. Para virus humanos, se suelen usar tejidos de hombre, pero tambin de monos (africanos) y tambin de embriones (de monos y humanos). Pero hay clulas de cepas celulares que sufren una alteracin y comienzan a desarrollarse de forma indefinida, formando entonces una lnea celular.

Lneas celular. Es un cultivo de clulas inmortales, en el sentido de que se pueden subcultivar indefinidamente. Las lneas celulares se pueden obtener a partir de cepas celulares, pero tambin, muy frecuentemente, a partir de clular tumorales, p. ej. dos lneas muy usadas son:

Clulas HeLa. Iniciales procedentes de una mujer que tuvo cncer de cuello de tero. Clulas CaCo. Procedentes de un cncer de colon. Una vez que se ha establecido a), b) o c), se inoculan sobre este cultivo celular los virus, siendo, entonces, diferentes que el cultivo de virus de bacterias.. En virus animales, primero se realiza el cultivo celular y luego se inoculan los virus. En ocasiones los virus animales se pueden cultivar en cultivos de rganos, en medio lquido. Los virus de planteas se pueden cultivar sobre plantas enteras, cultivos de tejidos de plantas, cultivos de clulas aisladas y cultivos de protoplastos. 2. Mtodos de deteccin y cuantificacin de virus. Se basan en considerar a los virus con diferentes propiedades:

Mtodos fisicoqumicos. Se basan en detectar a los virus al microscopio electrnico, como cuerpos fsicos que son, o bien, se basan en una propiedad qumica que tienen algunos de estos virus, que es la capacidad de aglutinar glbulos rojos (ensayos de hemaglutinacin). a.1. Observacin de virus al microscopio ptico. Se pueden aplicar numerosas tcnicas de microscopa electrnica para observar virus. Pero en los anlisis de rutina, para detectar y cuantificar virus slo se emplean los mtodos ms sencillos. Los ms complejos (inclusin en resinas, cortes), slo se usan en investigacin.

Tincin negativa. Consiste en mezclar una suspensin donde suponemos que estn los virus, con una sal densa a los electrones, p. ej. acetato de uracilo, fosfotungstato potsico (c. fosfotungstico). Esta mezcla se deposita en una rejilla de microscopa electrnica y se observa al microscopio electrnico de transmisin. Con esta tcnica, los virus no se tien en realidad, sino que lo que se tie es el medio. Esta es la ms usada porque es la ms sencilla. Sombreado. Consiste en depositar a los virus sobre una rejilla y hacer incidir sobre la misma un metal, normalmente platino, con un cierto ngulo, respecto a la rejilla. El platino, cubre a los virus, pero queda en un lado una sombra de color claro (el platino queda oscuro). Entonces al observar la rejilla, se vern los virus oscuros y la sombra clara. Entonces se observa una imagen de aspecto tridimensional. Mediante estas dos tcnicas, se puede demostrar la presencia de virus en una muestra, pero tambin se pueden contar, por un procedimientos especial.

El mtodo que se utiliza para la cuantificacin de virus consiste en mezclar la solucin de virus que se quiere cuantificar, con unas bolas de ltex. La mezcla se somete a tincin negativa o sombreado, y se cuentan en el microscopio las partculas vricas y las bolas que se observan en un campo de visin, se anota y para conocer la concentracin de virus en la disolucin original, se aplica una frmula: P. ej. Si hemos contado 300 partculas de virus y 30 bolas siendo: a.2. Ensayo de hemaglutinacin. Se basan en la capacidad que tienen diferentes virus de unirse a glbulos rojos, incluso aunque no los infecten. Un virus es capaz de unir entre s a 2 glbulos rojos. Pero si hay bastantes virus en una muestra, se forman unos agregados de virus y glbulos rojos que sedimentan con facilidad, y se produce la aglutinacin de glbulos rojos o hemaglutinacin. Si en una muestra no hay virus, o incluso si hay pocos, no se formarn estos agregados. En una muestra, si no hay virus o hay pocos, no se produce hemaglutinacin, se formarn dmeros. En una hemaglutinacin se pueden detectar virus y cuantificarlos (virus hemaglutinantes). Tenemos una muestra que queremos saber si existen virus que aglutinen glbulos rojos. En la muestra Dnde hay virus? Se aaden los glbulos rojos y se dejan incubar. Si no hay virus o hay muy pocos, los glbulos rojos tambin acaban sedimentando, pero quedan en el fondo del tubo formando un sedimento pequeo en el fondo del tubo en el centro y bien delimitado. Si existen virus y se produce hemaglutinacin, los agregados precipitan por todo el fondo del tubo y se observa, visto desde arriba, un precipitado muy fino en todo el fondo del tubo (no rueda). Para cuantificar los virus, se realiza un ensayo en unas placas de plstico que contienen pocillos. Se realizan diluciones de la muestra en los pocillos a la mitad cada vez: 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32; 1/64, 1/128, 1/256, 1/512, ... A todos los pocillos se le aade igual cantidad de glbulos rojos. Se espera un tiempo y se observa si existe o no, hemaglutinacin. Entonces se calcula la denominada dilucin libre, que es la ltima dilucin de la solucin de virus en la que se observa hemaglutinacin, es decir, que en la siguiente dilucin no hay hemaglutinacin. En fotocopia 1/128. Los resultados se suelen expresar en ttulo del ensayo de hemaglutinacin. Se suele definir como la inversa de la dilucin lmite. El ttulo de nuestro ejemplo sera 128. A mayor ttulo indica que tenamos ms virus en la solucin original porque hemos tenido que diluir ms hasta que no existe hemaglutinacin. Un ttulo de 256, tendra ms virus que en la mezcla de nuestro ejemplo. Los mtodos fisicoqumicos de cuantificacin tienen una serie de inconvenientes: Mediante microscopa electrnica, se cuentan tanto virus con capacidad de infectar clulas como virus que tengan algn defecto, y no puedan infectar clulas o incluso cpsides vacas. Mediante el ensayo de hemaglutinacin, tambin se pueden detectar virus que no sean infectivos y adems hay virus en los que las espculas s sueltan del virus y se pueden contar en la hemaglutinacin. Estudios de infectividad. Hay otros mtodos que se pueden aplicar como los estudios de infectividad. Estos estudios de infectividad nos permiten cuantificar las partculas de virus que son capaces de causar una infeccin. Estos mtodos son varios: b.1. Mtodo de formacin de placas. b.1.1. Para virus bacterianos. Nos permite cuantificar los virus presentes en una solucin que infectan a una determinada cepa bacteriana. Para realizar este ensayo se

parte de un tubo en que tenemos la suspensin de virus, otro tubo que contiene las bacterias hospedadoras de dicho virus y otro tubo que contiene agar fundido a unos 4550. En el agar se deposita una muestra de los dos tubos anteriores (virus y bacterias), se agita para mezclar y se aade todo el contenido del tubo de agar con virus y bacterias a una placa petri que ya contena un medio de cultivo slido, y se deja enfriar para que solidifique el agar que acabamos de aadir (tenemos 2 capas en la placa). Las bacterias y los virus quedan extendidos, por tanto, en toda la superficie y las bacterias comienzan a multiplicarse, formando un csped por la placa. Pero a su vez, cada virus infecta a la bacteria que tenga ms prxima, se multiplica en ella, salen nuevos virus que infectan a las bacterias vecinas y as, en la zona donde haba un virus, se forman unas reas de bacterias muertas (por los virus) que se denomina calva o placa de lisis, y por lo tanto, el recuento del nmero de calvas o placas de lisis, nos da idea del nmero de virus infecciosos que tenamos en la muestra original, aunque no es un mtodo del todo exacto. Los resultados de este ensayo se expresan como unidades formadoras de calas o placas de lisis (ufp). Es conveniente contar las placas de cultivo que contienen entre 30 y 300 calvas, pero a veces, como no sabemos cuntas calvas nos van a salir, lo que conviene es realizar una serie de diluciones de la muestra original que contena a los virus: 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, ... y de cada dilucin se toma un inculo. P. ej. de 0,1 mL y se realiza lo que acabamos de ver; luego se cuentan las calvas de las placas y se aplica la frmula: b.1.2. Para virus animales. En este caso se parte de muestras o diluciones de virus y de placas petri que contienen cultivos de clulas animales; se elimina el medio lquido, a continuacin se aaden los virus (un inculo de la solucin de virus sobre la placa) (0,1 mL, 0,2 mL) se deja un tiempo para que los virus se unan a las clulas y despus de esperar a que esto suceda, y se aade un medio solidificado (capa fina) de agar o gelatina, se incuba un tiempo, dependiendo del virus puede ser de das o semanas, y se observa la aparicin de calvas (porque los virus infectan a las clulas animales, a la ms prxima, los virus se multiplican, salen de las clulas, infectan a las vecinas y se forman esas placas). Algunas de stas placas no se pueden diferenciar directamente. Entonces, para observarlas, hay que aadir una serie de colorantes de cultivo. Se pueden realizar 2 tipos de tincin en clulas animales: Colorante rojo neutro. Tien clulas vivas, aparecer teido el resto, no las placas de lisis o calvas. Colorantes que tien clulas muertas como el Azul Tripn, en este caso, las placas aparecern de color azul. Hay casos en que los virus no matan a las clulas y se pueden detectar de otras formas. Ej.: virus cancergenos que transforman a las clulas y hacen que proliferan de forma anormal y en ste caso lo que se hace es que observan en la placa de cultivo unos cmulos o grumos de clulas que se pueden contar (virus tumorgenos). b.2. Mtodo de produccin de lesiones en hojas de plantas. Para cuantificar virus que infectan a plantas. Una muestra con virus se extiende sobre la superficie de hojas de plantas y se espera un tiempo hasta que aparecen lesiones en las hojas de las plantas y se realiza un recuento de las lesiones, que aparecen. Es un mtodo muy sencillo. b.3. Mtodos de determinacin de la dosis letal 50 (DL50) y de la dosis infectiva 50 (DI50). A partir de una muestra se realizan disoluciones decimales 10-1, 10-2, 10-3, ... A partir de cada dilucin, se toman alcuotas con las que se infecta a organismos prueba, que pueden ser plantas, animales, huevos de gallina (se requieren muchos organismos prueba). Se espera un tiempo y se cuentan los organismos que han resultado infectados o muertos por el virus para cada dilucin y se calcula el %. Ej.: para 0,1-100%, para 0,290%, etc. Con estos datos se realiza una curva (fotocopia) y en esta curva, en el eje de

abcisas (x) se pone la dilucin 10-5, 10-6, 10-7, etc, y en el eje de ordenadas (y) se pone el % de individuos, o bien infectados, o bien muertos, por cada dilucin de virus. Si la solucin est poco diluida todos o la mayora de los organismos prueba estarn infectadas; y en diluciones muy altas, poco o ninguno de los organismos prueba estarn infectados. Se calcula la dilucin (una vez hecha la grfica), que produce que el 50% de los organismos prueba estn infectados y esa es la DI50. Si hemos tenido como criterio la muerte de los organismos prueba, se determina la dilucin que produce la muerte del 50% de los organismos prueba y entonces tenemos la DL50 (en el ej. 10-6). Mtodos inmunolgicos para el estudio de un virus. Los virus cuando se introducen en el organismo actan como Ag e inducen la formacin de Ac especficos. Las pruebas inmunolgicas de deteccin de virus se basan en reacciones Ag-Ac. Se puede abordar el diagnstico viral de 2 formas mediante estas pruebas: Identificar un virus o Ag vrico desconocido, hacindolos reaccionar con Ac conocidos. Detectar Ac frente a un virus en el suero del paciente. Para ello se hace reaccionar el suero problema con virus o Ag vricos conocidos. Hay numerosos mtodos inmunolgicos para el diagnstico vrico. De stos, unos ensayos muy usados, son los ensayos inmunoenzimticos o test de ELISA, que se utilizan tanto para identificar Ag vricos como sueros problema. Vamos a ver 3 de estos mtodos: Inmunotransferencia de protenas (inmunobloting). Se usa como confirmacin de prueba de ELISA. Test de neutralizacin (de infectividad). Test de inhibicin de la hemaglutinacin c.1. Test de inmunotransferencia de protenas. Se basa en hacer reaccionar Ag y Ac sobre un papel y los Ag protenas separadas por electroforesis. Partimos de una muestra con protenas que se aplica a un gel de poliacrilamida. A continuacin se somete el gel a electroforesis en un campo elctrico, quedando las protenas separadas en bandas. A continuacin las protenas se transfieren a un papel o membrana de nitrocelulosa, en unos aparatos especiales para ello. Cuando la protena est en papel de nitrocelulosa, se aaden en papel (o membrana), un suero con Ac. Si los Ac reconocen algunas bandas de protenas en gel, se unir a ella. A continuacin se lava porque si no existe unin Ag-Ac, se eliminan los Ac. Luego se aade a la membrana Ac secundarios (que es aquel que reconoce a otro Ac como Ag). P. ej. Si el Ac primario es suero humano (protenas) entonces el Ac secundario se podra obtener inyectando los Ac humanos en un animal como un conejo. Entonces el conejo reconoce como Ag a los Ac del hombre y formar antianticuerpos o Ac secundarios. Estos Ac secundarios se unirn a los Ac primarios si estn presentes y se realiza un lavado porque si no existe unin, se eliminan. Los Ac secundarios tienen que ir marcados de alguna forma, p. ej. Una enzima, con un compuesto radioactivo (lo normal es una enzima, ya que el uso de compuestos radioactivos es ms problemtico). A continuacin se aade el sustrato de la enzima que origina un producto coloreado. Entonces se detecta en el papel la aparicin de unas bandas coloreadas. Esto se puede aplicar para detectar Ag vricos en una muestra problema (p. ej. Para detectar virus del SIDA en una muestra). Entonces se rompen las clulas, las protenas se someten a electroforesis y se sigue todo el proceso..

Tambin se puede hacer lo contrario, intentar determinar si en un suero hay Ac frente a un virus determinado. P. ej.: si en el suero de un paciente hay Ac para el virus del SIDA. En este caso se parte de protenas conocida del virus, se realiza todo el proceso anterior. En el caso del SIDA, ya se venden unas membranas de nitrocelulosa con protenas del virus ya separadas donde se realiza la prueba. Ver fotocopias. c.2. Tcnica de neutralizacin de la infectividad. Estos ensayos se fundamentan en que si mezclamos un virus con Ac y stos se unen al virus, disminuye la capacidad de los virus de infectar clulas. Entonces mezclamos virus con Ac; si existe unin especfica virus -Ac y aadimos todo esto a un sistema indicador (p. ej. Un organismo prueba, como plantas, embriones de pollo, cultivo de clulas, animales), entonces disminuimos la capacidad de los virus de infectar a stos organismos prueba. Si no existe unin especfica (unin Virus-Ac) y se aade a un sistema indicador, entonces no queda afectada la capacidad de los virus de infectar al sistema indicador. Este mtodo se puede realizar de dos formas: Se puede intentar identificar un aislado vrico desconocido. P. ej. Si hemos aislado un virus y se trata del virus de la gripe, entonces lo que se hace es mezclar el virus desconocido con Ac. Conocidos, se aade al sistema indicador y se observan los resultados. Si se disminuye la capacidad infecciosa de los virus, respecto a un control (en el que no estn los Ac) entonces hemos identificado al virus problema. Por otro lado se puede intentar identificar o detectar en el suero de un paciente la presencia de Ac frente a un virus determinado. En este caso se hace reaccionar el suero problema con virus conocido (p. ej. De la gripe) y se realiza el proceso. Entonces se disminuye la capacidad infectiva, entonces se identifica. c.2. Inhibicin de hemaglutinacin. Se basa en que si hacemos reaccionar virus con Ac y se produce una unin de los virus con los Ac y se produce una unin de los virus con los Ac. Si aadimos a continuacin glbulos rojos, se produce una disminucin de la capacidad de los virus de aglutinar glbulos rojos. Si no existe unin, disminuye la capacidad de producir hemaglutinacin. Estos ensayos se realizan slo para virus que son capaces de llevar a cabo la hemaglutinacin. Slo se usan para determinar la presencia de Ac frente a un virus en el suero de un paciente (no se usa la otra posibilidad). Deteccin de cidos nucleicos. Mediante estos mtodos se intenta detectar secuencias de genoma de virus en una muestra. stos mtodos se suelen usar como confirmacin de los mtodos inmunolgicos. Tambin se usan en casos especiales como, p. ej., estudios del cncer para investigar la presencia de genoma de virus en clulas tumorgenas (p. ej. Verrugas, hepatitis). Tambin se usan para detectar virus en recin nacidos. En el caso del VIH, es difcil aislar los virus y los Ac, pueden proceder de la madre, entonces se detecta el cido nucleico. Las pruebas de deteccin de cidos nucleicos se basan en tcnicas de hibridacin de c. nucleicos. Estas tcnicas se fundamentan en el hecho de que cadenas sencillas de c. nucleico, que sean complementarias entre s, tienden a formar un hbrido si se ponen juntas. Esta hibridacin puede ser entre hebras: DNA-DNA, RNA-DNA, DNA-RNA. Con estas pruebas se intenta detectar en la muestra la presencia del genoma de un determinado virus (una secuencia), usando unas secuencias de c. nucleicos conocidos por nosotros, y que sean complementarias con secuencias del genoma del virus.

Para realizar esta prueba, en primer lugar hay que generar molculas de c. nucleico de cadena sencilla en la muestra, si el genoma que estamos buscando en de cadena doble, es decir, hay que intentar separar las cadenas (si es doble) del virus por un tratamiento especial. Una vez que tenemos las cadenas sencillas, se adiciona la secuencia conocida por nosotros (secuencia sonda), que hibridar con la secuencia del virus, si sta est presente en la muestra. Para detectar que se ha producido esta hibridacin, la secuencia sonda tiene que ir marcada de alguna forma: con un compuesto radioactivo, fluorescente o una enzima (que es lo ms frecuente). A continuacin, se valora si se ha producido la unin, con un contador de centelleo (radiactividad), o con un contador de fluorescencia o bien aadiendo el sustrato de la enzima y viendo si ha aparecido el producto. Con estas reacciones se puede intentar buscar en la muestra genomas de virus tanto de RNA o DNA, siendo la sonda RNA o DNA. La sensibilidad de estos mtodo aumentan notablemente si el genoma que estamos buscando es ampliado previamente por la aplicacin de la PCR (reaccin en cadena de la polimerasa). Leccin 3. Virus bacterianos. Caractersticas y reproduccin. Esquema del tema: Clasificacin de los virus bacterianos Multiplicacin de los bacterifagos. Ciclo ltico Ciclo lisognico. Clasificacin de los virus bacterianos. A los virus bacterianos se les suele llamar bacterifagos o fagos. Parasitan tanto a bacterias y arqueas. La mayora de los virus bacterianos tiene DNA como genoma. Este DNA normalmente es de cadena doble (aunque tambin hay de cadena sencilla). Slo existe unos pocos virus con RNA que pueden ser tanto de cadena sencilla como doble. La mayora de los fagos, son virus desnudos (sin envoltura), aunque algunos s la poseen. Las familias de virus que infectan a bacterias se recogen en el siguiente cuadro: Multiplicacin de los bacterifagos. Existe gran diversidad de estrategias de multiplicacin de los fagos, pero un esquema general podra ser este: Ahora vamos a centrarnos en dos tipos de ciclos de multiplicacin, que son los ms conocidos: A. Ciclo ltico. Tomamos como ejemplo a los virus llamados Tpar (T2, T4, T6) que pertenecen a la familia Myoviridae, que son virus desnudos, con DNA de cadena doble y parsitos de E. Coli. Muchos virus bacterianos tienen un ciclo de multiplicacin al que se denomina ltico porque los virus se multiplican en el interior de la bacteria ay salen de la misma matando o lisando a la clula. A ste tipo de virus con este ciclo, se les denomina virus virulentos. Vamos a tomar como ejemplo al virus T4 como caracterstico del ciclo ltico.