MEDIOS DE CULTIVO

Introduccin

Koch realiz sus investigaciones utilizando en un primer momento rodajas de patata como soporte nutritivo slido pero no tard en recurrir al caldo de carne lquido, diseado por Loeffler, al que, en 1881, aadi gelatina, logrando un medio slido transparente ideal para la observacin de la morfologa macroscpica de las colonias microbianas. En 1887 un ayudante de Koch llamado Petri, comienza a utilizar placas de cristal planas, que se llaman desde entonces placas de Petri, para sustituir a las clsicas bandejas de vidrio cubiertas con campanas que se usaban hasta entonces. Actualmente se han preparado ms de 10.000 medios de cultivo diferentes. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo. Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial debe reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de humedad y presin de oxgeno adecuadas, as como un grado correcto de acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y factores de crecimiento necesarios y debe estar exento de todo microorganismo contaminante.

Condiciones generales para el cultivo de organismos

Disponibilidad de nutrientes adecuados Como minimo C,N,S,P y sales organicas Vitaminas, sustancias inductoras crecimiento Consistencia adecuada del medio Albumina, gelatina o agar obteniendo medio semisolido o solido

Esterilidad del medio Esteril, para evitar la microorganismos Esterilizar usando la autoclave

aparicion

de

Clasificacin
Segn su estado fisico Solidos --- presencia AGAR 12-15 gramos/litro Semisolidos --- AGAR 2,5- 4 gramos/litro Liquidos --No presenta ningun solidificante

Segn su composicin Medios complejos --Fueron los primeros utilizados, y los ms empleados se preparan a partir de tejidos animales, y ms raramente de vegetales. Su composicin no es exactamente definida, y por consiguiente no es rigurosamente constante. Esto puede tener ciertos inconvenientes en condiciones experimentales, donde la reproductibilidad no podr ser exacta. En la prctica corriente estos medios dan excelentes resultados y son los ms empleados.

Medios sinttico --- Son aquellos que contienen en su composicin exclusivamente sustancias qumicas conocidas y disueltas en agua destilada en proporciones determinadas, resultando un medio de composicin perfectamente definida. Medios semisintticos --- El gran nmero de factores de crecimiento exigidos para ciertos grmenes hace que la fabricacin de un medio sinttico para estos grmenes sea imposible o demasiado cara. En este caso se aportan los factores de crecimiento bajo la forma de un extracto orgnico complejo (extracto de levadura, extracto de tejidos, etc.).Ciertos grmenes no crecen en ningn medio por muy enriquecido que est ste, hacindolo exclusivamente en clulas vivas con unas caractersticas determinadas. Ejemplos de este tipo son, aparte de los virus, las Chlamydias, Rickettsias, etc

Segn al uso al que se destinen Enriquecidos --- Presentan un nutriente simple que presentan enriquecedores ejm. Sangre de caballo Selectivos --- Contienen agentes para inhibir la flora acompaante de la muestra , y aislar de este modo al microorganismo

 Transporte

y mantenimiento --- Se utilizan en la recogida, transporte y conservacin de muestras biolgicas. Medios reductores que inhiben las reacciones enzimticas autodestructivas dentro de las clulas evitando los efectos destructivos de la oxidacin. Filtros de membrana --- Permiten el examen de grandes volmenes con baja concentracin de microorganismos, la separacin de microorganismos del medio de cultivo e incluso su cambio de un medio de cultivo a otro, permite el crecimiento sin interrupcin del microorganismo.

 Medios

comunes --poseen los componentes mnimos para que pueda producirse el crecimiento de bacterias que no necesiten requerimientos especiales. El medio ms conocido de este grupo es el agar nutritivo o agar comn, que resulta de la adicin de agar al caldo nutritivo. Otros representantes de este grupo son el agar tripticase de soja, el agar Columbia, etc.

 Medios

inhibidores --Cuando las sustancias aadidas a un medio selectivo impiden totalmente el crecimiento de una poblacin microbiana, se denomina inhibidor. Los medios inhibidores podran considerarse como una variante ms restrictiva de los medios selectivos. Los medios inhibidores se consiguen habitualmente por adicin de sustancias antimicrobianas o de cualquier otra que inhiba completamente el desarrollo de una poblacin determinada. Un medio inhibidor es el MacConkey que permite el crecimiento de los grmenes Gram negativos e impide el crecimiento de los Gram positivos.

 Medios

diferenciales --- Se utilizan para poner en evidencia caractersticas bioqumicas que ayuden a diferenciar gneros o especies. La adicin de un azcar fermentable o un sustrato metabolizable se utilizan para este fin. El medio MacConkey es un medio diferencial porque permite distinguir los grmenes que fermentan la lactosa de aquellos que no lo hacen. Tambin lo son el C.L.E.D. (lactosa +/lactosa -), el agar sangre (tipo de hemlisis), el SS (que es doblemente diferencial), etc.

Medios de identificacin --- Son los destinados a comprobar alguna cualidad especfica que puede servirnos para reconocer la identidad de un microorganismo. Estos medios han de poseer los elementos necesarios para asegurar el crecimiento de los microorganismos, el sustrato especfico que vaya a ser metabolizado y el indicador que nos muestre el resultado. El agar Kligler, el medio de Simmons y en general, cualquier medio al que se le haya aadido un elemento diferencial de un microorganismo, son medios utilizados en identificacin. Actualmente estn apareciendo en el mercado una gran cantidad de medios especficos de identificacin para ciertos microorganismos, con lo cual se consigue simultneamente abaratar el costo y reducir el tiempo de identificacin. Son ejemplos de esto ltimo los medios CPS ID3 o Uriline ID(Biomerieux), utilizados para identificar los grmenes urinarios ms importantes a partir de la placa de cultivo gracias a la utilizacin de sustratos cromognicos especficos

Medios de multiplicacin --- Sirven para obtener una gran cantidad de clulas a partir de un microorganismo ya aislado. Se emplean en la obtencin de vacunas, en la investigacin y en la industria. Los medios ms adecuados para la multiplicacin suelen ser lquidos. El caldo-infusin cerebro-corazn (BHI), es un ejemplo tpico de estos medios. Medios de conservacin --- Se utilizan para conservar una cepa que, por diversas razones nos interese mantener. Fundamentalmente se utilizan como controles de calidad de las pruebas y reactivos utilizados en el Laboratorio de Microbiologa. En el laboratorio se pueden conservar las cepas de tres formas: a) haciendo pases peridicos de placa a placa, b) mediante liofilizacin de una suspensin bacteriana, y c) congelando las cepas en leche descremada estril al 0,1%.

Medios de cultivo mas utilizados

AGAR SANGRE es un medio de uso general que permite el crecimiento tanto de microorganismos exigentes como no exigentes, que incluyen bacterias aerobias y anaerobias Permite visualizar reacciones hemolticas que producen muchas especies bacterianas. Tiene por base una fuente proteica con una pequea cantidad de hidratos de carbono naturales, cloruro sdico y 5% de sangre. La aportacin de casena y peptonas hace el medio en muy nutritivo por el suministro de nitrgeno orgnico, particularmente aminocidos y ppticos de cadena ms larga. La presencia de estas peptonas en el medio permite el cultivo de una gran variedad de grmenes aerobios y anaerobios que crecen rpidamente, as como los del gnero Cndida.

Tambin permite el crecimiento de algunos grmenes exigentes como estreptococos, pneumococos, Brucella, corinebacterias, Erysipelothrix y Pasteurella.

Permite as mismo determinar la capacidad de algunas bacterias de producir enzimas extracelulares que actan sobre los glbulos rojos, ya sea por lisis completa, parcial o por ausencia de alteracin (hemlisis gamma). La produccin de hemolisinas por las bacterias depende del pH o atmsfera de incubacin.

AGAR CHOCOLATE El Agar chocolate es un medio destinado principalmente al aislamiento de gonococos y meningococos, pero en el que pueden 10 crecer muchos otros microorganismos exigentes. El Agar chocolate lleva Hemoglobina que aporta al medio otros factores, en particular el factor V termosensible, que no se encuentran en el Agar chocolate pueden aportarse en una mezcla qumicamente definida: el PolyViteX. El Agar chocolate con PolyViteX permite el cultivo de la mayor parte de los grmenes encontrados en patologa humana o veterinaria. La siembra de lquidos cefalorraqudeos, pus, resiembra de hemocultivos, etc., es favorable en este medio, pero est particularmente indicado para aislamiento de las Neisserias patgenas

y de los Haemophilus.

AGAR MCCONKEY El agar MacConkey II es una medio selectivo y diferencial para la deteccin de organismos coliformes y patgenos entricos., cultivo e identificacin de bacterias entricas. Este medio es ligeramente selectivo ya que la concentracin de sales Biliares, que inhiben el crecimiento de los microorganismos Gram positivos, es baja en relacin con otros medios similares. Se incluye tambin cristal violeta para inhibir el crecimiento de las bacterias Gram positivas, especialmente estafilococos y enterococos.

CALDO TIOGLICOLATO Es el caldo de enriquecimiento ms utilizado en Microbiologa. Contiene 0,075 % de Agar para evitar que las corrientes de conveccin transporten el oxgeno de la superficie a toda la masa del caldo. El cido tiogliclico acta como agente reductor, disminuyendo aun ms el potencial de xidoreduccin del medio. Con el agregado de muchos factores nutrientes (Casena, extractos de Levadura y Carne, Vitaminas, etc.), el medio permite el desarrollo de la mayor parte de las bacterias patgenas. Hay distintas frmulas modificadas en las que se han incluido otros componentes: un indicador de xido-reduccin (Resazurina), Glucosa, Vitamina K1 y Hemina.

AGAR SCHAEDLER Schaedler + 5% sangre de cordero es un medio reductor est particularmente adaptado al cultivo de los grmenes anaerobios. La presencia de factores de crecimiento tales como el extracto de levadura, la hemina y la vitamina K3, as como la adicin de la sangre de cordero, permiten el crecimiento de especies exigentes. Debido al elevado contenido en glucosa de este medio, la intensidad de la hemlisis de los estreptococos puede disminuir. Despus de sembrar, colocar inmediatamente las placas en la jarra de anaerobiosis o bien en sistema individual.

AGAR KANA-VANCO Se utiliza para el aislamiento rpido de Bacteroides sp. Contiene 75 g/ml de Kanamicina, que inhibe a la mayora de los bacilos aerobios, facultativos y anaerobios excepto Bacteroides, y 7,5 g/ml de Vancomicina, que inhibe a la mayora de los microorganismos 12 grampositivos. Contiene tambin sangre "lacada" de conejo que permite la pigmentacin precoz de los Bacteroides sp pigmentados. Muchas cepas de B. assaccharolyticus y B. gingivalis no

crecern en este medio debido a su sensibilidad a la Vancomicina. Las levaduras y otros microorganismos resistentes a la Kanamicina pueden crecer en este medio, en consecuencia, debe realizarse una tincin Gram y confirmar la tolerancia al aire de todos los organismos aislados.

AGAR BBE ( Bacteroides Bilis Esculina) El medio BBE es un medio selectivo para el aislamiento e identificacin presuntiva de bacterias del grupo Bacteroides fragilis. El agar BBE permite una inhibicin selectiva de microorganismos anaerobios facultativos y de la mayor parte de los anaerobios Gram negativos debido a que contiene amikacina y oxgall. La diferenciacin del grupo Bacteroides fragilis se basa en la hidrlisis de la esculina con produccin de esculetina y dextrosa. La esculetina reacciona con la sal de hiero presente en el medio (citrato frrico amnico) produciendo una coloracin marrn oscuro-negro rodeando a las colonias de de las cepas del grupo Bacteroides fragilis. Contiene Amikacina que inhibe el desarrollo de los microorganismos aerobios, Bilis que inhibe a la mayora de anaerobios excepto los del grupo B. fragilis y otras pocas especies, y Esculina que es til para la deteccin de este grupo de microorganismos ya que por lo general son Esculina positivos. Tambin pueden crecer en este medio: Fusobacterium mortiferum, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus sp, levaduras y algunos otros microorganismos.

AGAR SALMONELLA-SHIGELLA Agar altamente selectivo que se utiliza para el aislamiento de Salmonella y de alguna especies de

Shigella.

Se dise para diferenciar fermentadores de lactosa de los que no la fermentan, proporcionando buena inhibicin de coliformes sin restringir el crecimiento de otros bacilos Gramnegativos (BGN) patgenos. 13 Salmonella y Shigella producen colonias transparentes, translcidas, mientras los pocos fermentadores de lactosa que se desarrollan dan colonias mucosas, rojizas.

AGAR KLIEGER (KIA) Se recomienda para la identificacin de bacilos entricos gramnegativos. Se basa en la fermentacin de dextrosa y lactosa y en la produccin de cido sulfhdrico (H2S). Se recomienda para identificar posteriores cultivos de colonia tomados de medios primarios (Agar McConkey, Agar SS, etc). El rojo de fenol es el indicador de la produccin de cido y el sultafo ferroso es de la produccin de H2S

AGAR SABOREUAD Es un medio diferencial, recomendado para el cultivo y crecimiento de hongos. Para que ocurra el crecimiento selectivo de hongos sobre bacterias en las muestras a analizar, este medio tan solo depende de la reaccin cida (pH 5,6)

AGAR MUELLER-HINTON Especfico para la realizacin de antibiogramas, existen dos variantes, Agar MuellerHinton/Sangre y Agar MuellerHinton/Chocolate , estas variaciones se realizan para obtener la sensibilidad antimicrobiana de ciertos microorganimos, St. Pneumoniae y Haemophilus spp. AGAR THAYER-MARTIN Es un medio empleado para el crecimiento de Neisseria spp, de muestras que contengan flora acompaante (bacterias y hongos). Bsicamente, el medio es un Agar Chocolate con los factores V y X, al que se aaden cuatro antibiticos para que acten de inhibidores (Vancomicina, Colistina, Anfotericina, Trimetopin)

AGAR CLED Utilizado como medio diferencial para el aislamiento, enumeracin e identificacin de microorganismos en orina. Al tener deficiencia electroltica, este medio inhibe la aglomeracin de Proteus spp al no formar el sobrecrecimiento en lmina. El medio incluye lactosa, para detectar contaminantes coniformes que fermenten la lactosa, que hace que el medio en torno a la colonia vire a color amarillo.