Purificacin de Protenas

Dado que una clula contiene miles de protenas distintas, la tarea de separarlas y determinar su estructura es en extremo difcil. Hay muchas tcnicas para purificar y caracterizar protenas que van desde estrategias para determinar caractersticas fsicas hasta descubrir el nmero y el tipo de aminocidos constituyentes y determinar su secuencia completa.

Una protena se puede identificar por cromatografa segn su carga y polaridad. La cadena entera se puede degradar por escisin especfica con enzimas para obtener fragmentos de pptidos relacionados. Luego cada pptido se puede degradar aminocido por aminocido para descubrir su secuencia.

En el paso final de la determinacin de la estructura, la protena intacta se somete a un anlisis por difraccin por rayos X para determinar su conformacin tridimensional. Sin embargo, antes es necesario purificar la protena empleando tcnicas como cromatografa de columna y electroforesis, y luego cristalizacin.

Aislamiento de Protenas de clulas.

Antes de purificar, es preciso extraer las protenas de las clulas y organelos subcelulares. Al primer paso se le denomina homogeneizacin e implica la ruptura de las clulas. Una vez homogeneizadas las clulas, se somete a centrifugacin diferencial. Despus de solubilizada la protena se somete a un primer paso de purificacin basado en la solubilidad.

PURIFICACION DE PROTEINAS

Se aplican muchas tcnicas para eliminar contaminantes y lograr una muestra pura de la protena de inters. Al seguirse los pasos de purificacin, se elabora una tabla de recuperacin y pureza de la protena para juzgar el xito de cada etapa.

Purificacin por salting-out.

Uno de los primeros pasos para iniciar el fraccionamiento proteico consiste en agregar una sal inica a la mezcla en cuestin (salting out). Se puede comenzar adicionando cantidades cada vez mayores de la sal y separando cuidadosamente las protenas que vayan precipitando, de forma que se obtendrn protenas relativamente puras (ver la siguiente figura).

Purificacin por pH

El valor de pH en el cual una protena tiene su mnima solubilidad se llama punto isoelctrico, y es muy til cuando se pretende purificar protenas provenientes de una mezcla. Lo que se hace es preparar varias soluciones de pH s diferentes y colocar en ellos la mezcla de protenas para que aquella cuyo pI sea el mismo que el pH del amortiguador, precipite all.

Tabla de purificacin de protenas

Los primeros pasos de purificacin de una protena que se encuentre formando parte de una mezcla comienzan casi siempre con salting-out, pues esta tcnica cumple muy bien su objetivo, que es el de preparar el homogeneizado crudo para los procedimientos ms eficaces y finos que siguen.

En la tabla siguiente hay que observar que tanto el volumen como la cantidad total de protena disminuyen (por qu?) mientras que la actividad especfica (en el caso de las enzimas) se incrementa (por qu?). Para calcular la actividad especfica hay que hacer la siguiente operacin:
Actividad = Actividad total Especfica total de protena

TABLA .1 Ejemplo de esquema para purificacin de protenas: Purificacin de la enzima xantina deshidrogenasa de un hongo.
Fraccin Volumen (ml) Total de protena (mg) Actividad Actividad Porcentaje de total. especfica recuperacin.

Extracto crudo Precipitado salino Cromatografa por intercambio inico Cromatografa por criba molecular Cromatografa por inmunoafinidad

3800 165 65 40 6

22 800 2 800 100 14.5 1.8

2 460 1 190 720 555 275

0.108 0.425 7.2 38.3 152.108

100 48 29 23 11

El porcentaje de recuperacin indica cunto de la protena de inters se ha conservado en cada paso. Esta cifra suele ir bajando durante la purificacin. El grado de purificacin compara la pureza de la protena en cada paso y este valor debe ir en ascenso si la purificacin tiene xito.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL

CROMATOGRAFA BIDIMENSIONAL

Croma = color Grafein = escribir Esta tcnica se comienza a utilizar en el siglo XX para separar pigmentos vegetales cuyos colores se distinguan con facilidad Se basa en la distribucin de compuestos en distinto grado entre diferentes fases (fase mvil y fase estacionaria)

Se emplea para la separacin de mezclas o purificacin de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina dentro de la columna. La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin.

CROMATOGRAFIA DE COLUMNA

Se introduce la muestra por la parte superior de la columna y se eluye con el disolvente elegido, recogindose por lo general en tubos de ensayo La columna se prepara mezclando el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de sta un poco de algodn, para evitar que la slica o la almina se salgan de la columna.

CROMATOGRAFIA DE COLUMNA

Tipos de cromatografa de columna

Cromatografa de afinidad Cromatografa de exclusin molecular Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa de afinidad

La cromatografa de afinidad permite la separacin de mezclas proteicas por su afinidad o capacidad de unin a un determinado ligando. Las protenas que se retienen en la columna son aquellas que se unen covalentemente a la matriz de la columna. La protena de inters que ha quedado retenida en la columna se eluye (se libera) mediante el empleo de una solucin que rompa la interaccin entre el ligando y la protena.

Cromatografa de exclusin molecular o cromatografa en gel

Separa a las protenas en funcin de su tamao. La matriz de la columna esta formada por un polmero entrecruzado con poros de tamaos determinados. Las protenas de mayor tamao migran a lo largo de la columna ms deprisa que las de pequeo tamao. Las protenas de menor tamao, entran en los poros y su marcha a lo largo de la columna se hace ms lenta.

Filtracin en Gel

En este tipo de cromatografa se coloca la muestra dentro de la columna empacada con perlas de agarosa. Las protenas grandes pasan de largo, mientras que las pequeas entran en los pequeos poros de las perlas y se quedan all un rato, eluyendo despus de las grandes.

Los resultados obtenidos se ilustran en la siguiente figura, en la cual se observa que, mientras ms grande sea la protena, ms rpido saldr de la columna (cuidado al interpretar el eje vertical o de las ordenadas, pues se refiere a Ve/Vo)

Dilisis

Las protenas se pueden separar en base a su tamao y solubilidad a ciertos pHs, pero cuando estos ltimos, como pIs, son muy cercanos, se hace necesaria otra tcnica que sea capaz de separar a las protenas en base a su tamao, y esta es la dilisis.

Electroforesis.

Se basa en el movimiento de partculas cargadas en un campo elctrico, hacia un electrodo con carga opuesta. La movilidad de estas macromolculas depende de su carga, forma y tamao.

Medios de soporte para Electroforesis.

El soporte ms comn es un polmero de agarosa o acrilamida, similar a los empleados en la cromatografa de columna. No obstante, pueden emplearse medios de soporte como papel y lquidos.

Forma en la que se lleva a cabo la Electroforesis. 1. Se aplica una muestra con carga elctrica en el
2.

3. 4.

medio de soporte, que puede ser papel o gel. Se hace pasar una corriente elctrica por el medio, a un voltaje controlado, para lograr la separacin deseada. Cada banda que se observa en el gel es una protena distinta. Una vez que las protenas se han separado en el gel (agarosa), ste se tie para revelar la ubicacin de las protenas.

En una variacin de la electroforesis en gel de poliacrilamida, la muestra de protenas se trata con el detergente dodecil sulfato de sodio (SDS), cuya estructura es CH3 (CH2)10 CH2OSO3Na, antes de aplicarse en el gel. El SDS, desnaturaliza por completo a las protenas , rompiendo todas las interacciones no covalentes que determinan su estructura terciaria y cuaternaria.

Ventajas de la electroforesis en gel de SDS- poliacrilamida (SDSPAGE)

La acrilamida ofrece ms resistencia a las molculas grandes que a las pequeas. Las protenas pequeas avanzan con ms rapidez que las grandes.

Este tipo de electroforesis puede servir para estimar el peso molecular de las protenas comparando las muestra con muestras estndar. Para casi todas las protenas , el logaritmo del peso molecular tiene una relacin lineal con su movilidad en SDSPAGE.

El enfoque isoelctrico o isoelectroenfoque

Este es otra variacin de la electroforesis en gel. Dado que las distintas protenas tienen diferentes grupos titulables, tambin tienen distinto punto isoelctrico. En un experimento de enfoque isoelctrico, se prepara el gel con un gradiente de pH.

Conforme las protenas migran a travs del gel bajo la influencia del campo elctrico, encuentran regiones de distinto pH que hacen que cambie la carga de la protena. Despus cada protena llega a un punto en el que no tiene carga neta (su punto isoelctrico) y deja de avanzar.

Centrifugacin en gradiente de concentracin

CRISTALOGRAFA POR RAYOS X.

Conocimiento de la estructura y funcin de las protenas. Puede revelar la posicin tridimensional exacta de la mayor parte de los tomos de una molcula proteica.

Aspectos bsicos

Se requieren cristales puros de la protena que interesa estudiar, obtenidos generalmente por aadir sulfato de amonio u otra sal concentrada a la disolucin proteica para disminuir su solubilidad. Una adicin lenta de sal favorece la formacin de cristales ordenados en vez de precipitados amorfos.

Figura: un cristal de protena.

Anlisis con rayos X.

Hay tres componentes requeridos en un experimento cristalogrfico por rayos X : La fuente de rayos X . Un cristal de protena. Un detector .

Al acelerar los electrones contra una pieza de cobre, se produce un haz de rayos X de longitud de onda de 1.54 A. Un haz estrecho de rayos X se hace incidir en el cristal proteico. Parte de este haz atraviesa el cristal sin ningn cambio de direccin. El resto se dispersa en una serie de direcciones diferentes. Los haces dispersos (o difractados) pueden ser detectados mediante pelcula fotogrfica, de manera que el ennegrecimiento de la emulsin es proporcional a la intensidad del haz de rayos X dispersado.

El cristal de la protena se monta en un capilar y se sita en una orientacin precisa con respecto al haz de rayos X y a la pelcula sensible. Un movimiento de precesin del cristal suministra una fotografa de rayos X en la que existe una disposicin regular de manchas.

Se miden las intensidades de cada una de las manchas y estos son los datos experimentales bsicos de un anlisis cristalogrfico de rayos X. El paso siguiente consiste en reconstruir la imagen de la protena a partir de las intensidades de las manchas. Los puntos ms prximos a la periferia de la fotografa contienen informacin de los lados de las molculas ms prximos en el espacio dentro del cristal. La resolucin obtenida mediante difraccin de rayos X depende del nmero de puntos analizados.

Patrn de difraccin de rayos X