MICROSCOPIA OPTICA

COMPUESTA
 INTRODUCCION

El microscopio es uno de los instrumentos

más versátiles usado por la ciencia.

Este instrumento en virtud de las leyes de

formación de imágenes ópticas aumentadas a
través de lentes convergentes, permite
amplificar la imagen de un objeto que no
puede ser identificado a simple vista
INTRODUCCION

La imagen puede ser observada directamente,

fotografiada o percibida por fotocélulas u
otros receptores, el enfoque revela gran
cantidad de información.

Las principales características del

microscopio son su aumento y poder de
resolución, permitiendo examinar detalles de
la estructura de una muestra.
La Microscopia

La microscopía es la técnica de
producir imágenes visibles de
estructuras o detalles demasiado
pequeños para ser percibidos a simple
vista .

“El ser humano posee el sentido de la vista .

Sin embargo, no puede ver simple vista cosas que
midan menos de una décima de milímetro”
La invención del microscopio es atribuida a dos fabricantes
holandeses de gafas .

En 1590, Hans Janssen y su hijo Zacharias Janssen, costruyeron

un artefacto, compuesto por dos lentes .
No se tiene registro que hubieran usado este instrumento para
fines científicos.

Imagen virtual

Objeto

p
El primer estudioso en usar un
microscopio para fines cientificos fue el
holandes Antoine Van Leeuwenhok (1632-
1723),

Usando un equipo de su propia

construcción, este cientifico observo u
relato el comportamiento de los
organismos y es por eso que considerado
el padre de la Microbiologia.
 La
Microscopia
El holandés Antonie Van
Leeuwenhoek
Los microscopios constaban de
una única lente pequeña y
convexa, montada sobre una
plancha, con un mecanismo para
sujetar el material que se iba a
examinar (la muestra o
espécimen).
• VIDEO 1
Un microscopio óptico
Es un equipo basado en
lentes.
También se le conoce como
microscopio de luz, (que
utiliza luz o fotones) o
microscopio de campo
claro.

Microscopio óptico. Descripción: A) ocular, B) objetivo,

C) portador del objeto, D) lentes de la iluminación, E)
sujeción del objeto, F) espejo de la iluminación.
 EL MICROSCOPIO
Para un mejor estudio del
microscopio reconoceremos los
siguientes sistemas:

Sistema mecánico
Sistema óptico
Sistema de iluminación
 El sistema mecánico
tiene como misión sostener a la parte
óptica y permitir los desplazamientos
necesarios para el enfoque y está
constituido por lo siguiente:
Base, pie o estativo. Además de ser
un soporte firme para el microscopio,
suele tener peso suficiente para dar
estabilidad al instrumento,
presentándose en diferentes formas.
Columna. Está formada por el pilar
que une la platina con la base y el
brazo, que sirve para el transporte
del instrumento.
Platina. Es una placa cuadrangular
que presenta una perforación
central que deja pasar los rayos
procedentes de la fuente de
iluminación y donde se coloca el
portaobjetos con la muestra a ser
observada.
Pinzas. Sostienen la preparación
con firmeza sobre la platina.
Vernier. Sistema de medida
ubicado en la platina que se utiliza
para tomar las coordenadas de una
muestra y también desplazarla de
derecha a izquierda o arriba y
abajo.
Tornillo macrométrico. Se utiliza
para desplazar rápida y
ampliamente el objetivo a la
distancia de trabajo aproximada
con respecto a la muestra.
Tornillo micrométrico. Sirve para
realizar desplazamientos cortos en
micras y enfocar la muestra.
Revolver. Permite colocar en posición
de trabajo alternativamente a los
objetivos con que cuenta el
microscopio.
Tubo ocular. Proporciona estabilidad
a los oculares y objetivos manteniendo
la separación a la distancia correcta
de trabajo.
• VIDEO 2
 El sistema óptico
Comprende un conjunto de lentes
dispuestos de tal manera que produce
el aumento de las imágenes que se
observan a través de ellos. Está
formado por los oculares y los
objetivos.
 El sistema óptico
Ocular. Denominado así porque va
cerca del ojo observador, ubicado en la
parte superior del tubo ocular, consta
de un sistema de lentes de aumento y
puede intercambiarse. En la parte
superior lleva grabado el número de
aumentos (10X, 15X).
Objetivos. Denominados así porque
van cerca del objeto por observar,
ubicados en el revolver, compuestos
por lentes de diferentes aumentos
(4X, 10X, 20X, 40X, 100X).
Hay dos clases de objetivos:

objetivos secos porque entre ellos y la

muestra sólo se interpone el aire y

objetivo de inmersión porque entre el y la

muestra se interpone una sustancia
líquida, llamada aceite de inmersión;
además, lleva una línea negra que facilita
su identificación. En el tubo de los objetivos va
grabado el número de aumentos (4X, 10X, 40X, 100X) y
la apertura numérica (0.20, 0.60, 1.25).
• VIDEO 3
 El sistema de iluminación
comprende las partes del microscopio
que reflejan, trasmiten y regulan la
cantidad de luz necesaria para
efectuar la observación a través del
microscopio.
Espejo. De forma circular y presenta
una cara cóncava y otra plana que
reflejan los rayos luminosos.
Las fuentes de luz , halógenas ,
leed
Condensador. Situado debajo de la
platina, tiene por objeto condensar
o concentrar los rayos luminosos
provenientes del espejo.

Diafragma. Dispositivo del

condensador que permite regular la
cantidad de rayos luminosos
emitidos por el espejo.
Filtros. Se usan para observar
las muestras con una longitud
de onda seleccionada (azul,
verde, naranja…) Se ubican en
el portafiltros.
La trayectoria que sigue un haz de luz a
través del microscopio es la siguiente:

El haz luminoso procedente de la lámpara

pasa directamente a través del diafragma al
condensador, gracias al sistema de lentes
que posee el condensador, la luz es
concentrada sobre la preparación a
observar: El haz de luz penetra en el
objetivo y sigue por el tubo ocular hasta
llegar al ocular, donde es captado por el ojo
del observador.
La imagen que se observa a través del
microscopio es una imagen virtual, invertida y
aumentada.
Se denomina “campo del microscopio” al
círculo visible que se observa a través del
microscopio, también podemos definirlo como
la porción del plano visible observado.
Si el aumento del campo es mayor, el campo
disminuye, lo cual quiere decir que el campo
es inversamente proporcional al aumento del
microscopio.
• VIDEO
El primer microscopio
electrónico fue diseñado por
Ernst Ruska y Max Knoll entre
1925 y 1930

(1) carcasa, (2) emisor de electrones,

(3) electrones, (4) cátodo, (5) ánodo,
(6) inductor de enfoque, (7) muestra
analizada, (8) detector
 Microscopía Electrónica
Borries y Ruska en Alemania 1938 , construyeron
el primer M E , resolución de 10 nm - 100 veces mejor
que el MO.
Comercializa do por SIEMENS en 1939.

Es muy similar al MO Tiene una Fuente de iluminación ,

sistemas condensadores para la iluminación de la muestra , una
primera lente magnificadora (Objetivo) seguidas de otras lentes
que aumentan la magnificación .
Los Microscopios Electrónicos La luz se sustituye por un haz de electrones, las
lentes por electroimanes y las muestras se hacen conductoras metalizando su
superficie.
se presentan con una gran variedad de marcas y modelos adecuados al
tipo de investigación que el Investigador requiera.
Los modelos convencionales :
Microscopios Electrónicos de Transmisión MET
Microscopios Electrónicos de Barrido MEB
 Microscopía Electrónica
Microscopio electrónico de transmisión (MET): permite la
observación de muestra en cortes ultrafinos.

Un TEM dirige el haz de electrones hacia el objeto que se desea

aumentar. Una parte de los electrones rebotan o son absorbidos
por el objeto y otros lo atraviesan formando una imagen
aumentada del espécimen.

Para utilizar un TEM debe cortarse la muestra en capas finas, no

mayores de un par de miles de ángstroms. Se coloca una placa
fotográfica o una pantalla fluorescente detrás del objeto para
registrar la imagen aumentada. Los microscopios electrónicos de
transmisión pueden aumentar un objeto hasta un millón de
veces.
 Microscopía Electrónica
Para utilizar un TEM debe cortarse la
muestra en capas finas, no mayores a
150 nm.

Se coloca una placa fotográfica o una

pantalla fluorescente detrás del
objeto para registrar la imagen
aumentada.

Los microscopios electrónicos de

transmisión pueden aumentar un
objeto hasta un millón de veces.
 electron gun CM 30 FEG / UT
CS = 0.65 mm
U = 300 kV
Objective Point resolution 0.18 nm
aperture
Condensor aperture
Goniometer for spec. holder

SA
TV
mon.

TV
camera CCD
camera
behind GIF (Gatan imaging filter)
El microscopio electrónico de transmisión
 PREPARACION DE LA MUESTRA

PELICULA DE SOPORTE
MUESTRA

REJILLA
Rejilla
HAZ ELECTRONICO INTERACTUANDO CON LA MUESTRA
 MODOS DE OPERACIÓN DEL TEM

IMAGEN DA INFORMACION MORFOLOGICA

DIFRACCION DA INFORMACION DE LA
MICROESTRUCTURA CRISTALINA
TEM
Imagen y difraccion
 Shortening of Electron Wavelength: High-Voltage Microscopy

Demonstration
of 0.1 nm point
resolution by
diffractogram
analysis

Thin slab of
bcc-Cu in a
3 - 84
tilt grain
boundary
(F. Ernst)

JEM-ARM1250 in Stuttgart

Dr. Fritz Phillipp, Max-Planck-Institut fuer Metallforschung, Stuttgart

Muestra Arqueológica
Pigmento Rojo
TM 1131
LA MICROSCOPIA ELECTRÓNICA EN LA CARACTERIZACIÓN DE
MATERIALES BIOLÓGICOS

 Eldesarrollo de la Biología y áreas afines depende como en otras

ciencias de la caracterización de la microestructura, composición y
propiedades de las células como: Bacterias, protozoos, hongos, Célula
animal y vegetal y en particular los virus.
La ME y sus Aplicaciones
• Estructura y ultraestructura de tejidos y órganos animales y
vegetales.
• Inmunocitolocalización de macromoléculas.
• Patologías animales y vegetales.
• Estudios forenses (búsqueda de partículas, tejidos, hilos,
semen...)
• Identificación de minerales y sustancias sintéticas.
• Estudios de corrosión de metales y aleaciones.
• Biodeterioro de obras de arte.
• Textura de rocas y minerales.
• Irregularidades de piezas fabricadas en cadena.
 Membrana
Citoplasmática
RE liso en una célula RE rugoso en una célula
secretora de esteroides secretora de proteínas
 Compartimentalización funcional del Golgi

Sin contrastar
Osmio

Nucleósido
Fosfatasa ácida
difosfatasa
Polirribosomas

1 triplete: 1 nm
100 aA: 100nm
Distancia entre
ribosomas: 34 nm
3 ribosomas/100 aA
 MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO
MEB

* Magnificación 500 000

aumentos

* Resolución 0.3 nm a 30 Kv

* Análisis de Superficie

* Acoplado a un detector de dispersión

de Rayos X -
Análisis por elementos
 MICROSCOPIA ELECTRONICA DE BARRIDO

Filamento

Lente Condensadora

Bobinas de barrido

Lente Objetivo

e
Detector de R “X”
e
Detector Monitor TV
ios
Secundar
EDAX Bomba de
Vacío
Interacción entre el haz de electrones y la muestra sólida

E. Incidentes

E. Retrodispersados
E. Secundarios

E. Auger
Rayos X
característicos

E. Absorbidos Rayos X

Rayos X
Transmitidos E. Transmitidos
y difractados y difractados

Fotones
ML/MEB
CELULA VEGETAL
DIATOMEAS
Euglena viridis
Trypanosoma cruzi
Giardia lamblia
Trichomona vaginalis
LA MEB EN EL ESTUDIO
BACTERIOLÓGICO

• La identificación
de bacterias
patógenas o no
mejoran el
conocimiento de
ellas y su
importancia en el
ecosistema.
 Echerichia coli
Forma parte de la flora
bacteriana del
intestino grueso del
hombre.
Bacillus anthrasis
Estudiando las
Bacterias
• Bacilos
• Cocos
• Estreptococos
• Estreptobacilos
Partículas virales brotando de una célula animal
 Transmission
Electron
Microscopy (TEM)
La Microscopia Electrónica Forense en
Aparece en el que hacer de lael Perú forense en los años 1988 con
investigación
el empleo de un Microscopio Electrónico de Barrido con analizador de rayos
“X” de marca PHILIPS modelo SEM 515
 La Microscopia Electrónica Forense en
el Perú
Nuestra historia se base en la labor
desarrollada en la lucha frontal
contra el terrorismo el narcotráfico
y la delincuencia común.
Para lo años 1990 nos
encontrábamos inmersos en una
sucesión de eventos terroristas que
llevaron a mejorar sustancialmente
los niveles de investigación Técnico
Científica de la Policía Nacional en
el Perú .
MEB 515 PHILIPS
 La Dirección de Criminalística cuenta con un moderno Microscopio
Electrónico de Barrido SEM con detector de rayos “X” EDAX, marca
FEI modelo Inspect

El cual brinda un apoyo importante en la elaboración de los

Dictámenes Periciales , en forma rápida, muchas veces
inmediata permitiendo investigar y resolver muchos casos
delictivos.
En la actualidad la delincuencia utiliza la tecnología
para desarrollar su accionar, es motivo por el cual es
imperiosa la necesidad de buscar los medios más
adecuados para poner en descubierto estos los hechos.

Por años el MEB ha sido una herramienta

indispensable en la investigación forense
permitiendo estudiar trazas microscópicas de
evidencia mediante :
– Las imágenes
– La comparación de imágenes
– El micro análisis por rayos x
Parte importante para la solución de un crimen es
validar la evidencia y convertirla en prueba para
el juzgador

Mediante :

* Resultados precisos
* Métodos de análisis no destructivos
* Con apreciable disminución del tiempo de
análisis
CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA PARA MEB EN CRIMINALISTICA

• Las muestras pueden tener un tamaño

que va desde milímetros hasta los
30 centímetros .

• Las muestras no deben requerir

preparación alguna y deben ser
examinadas en su estado natural
 CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA PARA MEB EN CRIMINALISTICA

• Debe obtener imágenes de la superficie …

con electrones secundarios

• Debe obtener imágenes composicionales...

con electrones retrodispersados

• Debe permitir la adquisición de

micro análisis químicos con rayos
“X”
CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA PARA MEB EN CRIMINALISTICA

En el área forense nos permite tener

una gran variedad de muestras a
analizar.
 CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA PARA MEB EN CRIMINALISTICA

La variedad de estas
muestra y las condiciones
en la que se encuentran,
son muy diferentes a los
analizados para un control
de calidad, básicamente por
su procedencia y el interés
en descubrir su relación con
el delito.
 CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA PARA MEB EN CRIMINALISTICA

Esto hace que las muestras

necesariamente tengan un
tratamiento especial, siendo
motivo que la Microscopia
Electrónica de Barrido en lo
forense, crea o modifica
muchos métodos ligados
básicamente a la característica
propia de la muestra a
analizar .
Casos como homicidios, suicidios robos,
falsificaciones, entre otros pueden ser descubiertas
por esta técnica y de esta manera aportar en la buena
Administración de Justicia .

Casos emblemáticos como :

 Una grapa permitió descubrir el robo y su autor

Las marcas de herramientas permite tener una relación entre el

objeto que ocasionó el daño y el soporte .

Este caso se trató de un robo sistemático de dinero en efectivo y

sumando la experiencia del personal investigador permitió su solución.

El hecho sucedió en una fabrica como existen en todas las latitudes ,

con más de doscientos trabajadores con un sistema de pagos en
efectivo y con muchos reclamos de éstos por los pequeños descuentos
indebidos.
 Una grapa permitió descubrir el robo y su autor

Para esto el personal policial

interviniente nos remitió al
laboratorio un sobre de Manila con
tres grapas acompañado de once
engrampadores .

Con el fin de buscar la relación entre estas muestra , el delito y su

autor .

Caso que se pudo descubrir por microscópicas marcas de la herramienta

del instrumento utilizado.
 Una grapa permitió descubrir el robo y su autor

Caso que se pudo Marcas de

descubrir por herramienta
microscópicas marcas de la
herramienta o del
instrumento utilizado.

MICROANALISIS (Wt
%)
SUPERFICIE
  FeK 11.40
ZnK 88.60

SECCIÓN
  FeK 100
 HOMICIDIO

Muchas veces nos ha tocado demostrar la relación entre el sospechoso y

el hecho con evidencias. muy pequeñas

Como el caso de un homicidio

que sucedido en las a fueras de
Lima, lugar en donde se
encontró a una mujer de raza
mestiza, semi enterradas en
una quebrada , con un pasador
(cordones) de zapatilla (tenis)
en el cuello.
 HOMICIDIO
La relación victima - autor se
logró con un estudio por MEB-
EDAX del pasador en el cual se
determinó microscópicos
restos de cemento utilizados
en albañilería .
 HOMICIDIO

El autor en este caso fue el

esposo y en su domicilio se
encontró el par de
zapatillas , el pasador que
completaba el par y la
actividad que realizaba era
de ayudante de albañil ,
aclarándose la autoría y el
motivo que terminó con la
vida de esta mujer .
 HOMICIDIO
MICROANALISIS
Wt%

 
CK 20.10
OK 43.45
AlK 1.34
SiK 4.24
SK 1.55
ClK 1.37
KK 0.58
CaK 27.37
 EXAMENES EN ACCIDENTES AEREOS
En 1996 un avión de la empresa estatal de aeronáutica del Perú sufre
un desastre con la caída de un BOING 747 en las costas de Lima .

Se tejieron muchas hipótesis y otras especulaciones entre los medios

de comunicación de la época .
 EXAMENES EN ACCIDENTES AEREOS
Nuestro trabajo fue
demostrar científicamente que
la causa fue por haberse
encontrado bloqueado el
detector de altitud.

Este detector se encontraba

tapado por una cinta adhesiva
y debió demostrarse que el
avión al momento de la caída
ya se encontraba con esa cinta
.
 EXAMENES EN ACCIDENTES AEREOS

Después de minuciosos estudios

microscópicos se halló un
elemento identificatorio en este
caso diatomeas del lecho marino .

Las cuales solo se encontraron en

la parte externa de la cinta no así
en las partes de contacto con el
fuselaje. Comprobándose y
determinándose la causa y
autoría del accidente.

Diatomea
 EXAMENES EN ACCIDENTES DE
VEHICULOS

VIDRIO
 EXAMENES DE PRENDAS DE
VESTIR

Se identifican las causas de las roturas examinando las

evidencias macroscópica y microscópicamente
EXAMENES EN TEJIDOS
EXAMENES EN PRENDAS CON
MANCHAS PARDO ROJIZAS
EXAMENES DE RESTOS
VEGETALES EN PRENDAS
EXAMENES EN PRENDAS CON
MANCHAS APERGAMINADAS
EXAMENES EN PRENDAS DE
VESTIR
 EXAMENES EN CASQUILLOS Y
PROYECTILES DE ARMAS DE FUEGO
 Transmission
Electron
Microscopy (TEM)
Manejo y Uso del Microscopio
Manejo y Uso del Microscopio
Coloque el microscopio sobre la mesa delante
de la fuente de luz (natural o artificial).

Utilizando el objetivo de menor aumento y la

cara del espejo cóncava o fuente de luz, suba la
platina hasta que la lente del objetivo se
encuentre a unos 0.5 cm. de la muestra.

Mirando por el ocular oriente la fuente de luz y

centrela, hasta que todo el campo visual
ofrezca una iluminación clara y uniforme.
Coloque el portaobjetos con la preparación
sobre la platina y sujétela con las pinzas,
con ayuda del vernier centre la preparación.

Suba la platina con el tornillo macrométrico

hasta que esté a 0.5 cm. de la muestra y
observando por el ocular baje suavemente
la platina con ayuda del tornillo
macrométrico hasta que la imagen se
encuentre en el campo visual.
Proceda a la focalización con el tornillo
micrométrico.
Si desea una magnificación mayor, basta
girar el revolver pues los objetivos son
parafocales y están graduados a una
misma distancia focal, regule usando el
tornillo micrométrico.
Terminada la observación, saque la
muestra y deje el microscopio con el
objetivo de menor aumento en posición de
trabajo.
Mantenimiento del
Microscopio
Mantenimiento del Microscopio

El microscopio debe estar protegido del

polvo, humedad y otros agentes que
pudieran dañarlo. Mientras no esté en uso
debe guardarse en el gabinete y cubrirlo con
una bolsa plástica.
El sistema mecánico debe limpiarse con un
paño suave; en algunos casos, éste se
puede humedecer con xilol para disolver
ciertas manchas de grasa, aceite de cedro o
parafina, que hayan caído sobre el mismo.
Mantenimiento del Microscopio

La limpieza del sistema óptico requiere

precauciones especiales, para ello debe emplearse
papel “lente” que expiden las casas distribuidoras
de material de laboratorio.
Nunca deben tocarse las lentes del ocular, objetivo
y condensador con los dedos; dejar las huellas
digitales perjudican la visibilidad, y cuando se secan
resulta trabajoso eliminarlas.

Para una buena limpieza de las lentes puede

humedecerse el papel “lente” con éter y luego
pasarlo por la superficie cuantas veces sea
necesario.
Mantenimiento del Microscopio

El aceite de cedro que queda en el objetivo de

inmersión debe quitarse inmediatamente
después de finalizada la observación. Para ello
se puede pasar el papel “lente” impregnado en
una solución alcohol/agua.
Para guardarlo se acostumbra colocar el
objetivo de menor aumento sobre la platina
bajado hasta el tope.

El condensador debe estar en su posición más

baja, para evitar que tropiece con alguno de los
objetivos.

Guárdese en lugares secos, paras evitar que la

humedad favorezca la formación de hongos. 
VIDEO
 MICROSCOPIA
ESTEREOSCOPICA
FORENSE
Estereomicroscopio triocular
equipado con cámara digital para
toma de imágenes.
  
Los microscopios estereoscópicos, por
definición, deben ser binoculares (con
un ocular para cada ojo), por lo que a
veces se confunden ambos términos.
Existen dos tipos de diseño,
denominados respectivamente
convergente (o Greenough) y de
objetivo común (o Galileo).
El diseño convergente consiste
en usar dos microscopios
idénticos inclinados un cierto
ángulo uno con respecto a otro y
acoplados mecánicamente de tal
forma que enfocan la imagen en
el mismo punto y con el mismo
aumento.
Es un diseño
económico, potente y
  
en el que las
aberraciones resultan
muy fáciles de
corregir.
El Microscopio Estereoscópico

  
• 5.VIDEO
MICROSCOPIO DE
COMPARACIÓN
BALISTICA
BROCHURE
EL OJO NO VE, LO QUE EL
CEREBRO NO CONOCE