AISLAMIENTO DE DNA PLASMÍDICO POR LISIS ALCALINA

INTEGRANTES:
MARGY JULIANA ROJAS LOZANO
MARIA VALENTINA GOMEZ AGUILAR
JULIETH CAMILA JEREZ AGUDELO

UNIVERSIDAD DE SANTANDER
MICROBIOLOGÍA INDUSTRIAL
BIOLOGÍA MOLECULAR
BUCARAMANGA
2021
 Cultivo de células

AISLAMIENTO DE DNA Agua HPLC

PLASMÍDICO POR LISIS Reactivos Etanol 70% o cloruro de litio

ALCALINA Suspensión
Era la técnica más
habitual Buffer
anteriormente para Lisis
esta identificación
Neutralización
PROCEDIMIENTO

10. Centrifugar 10 min 13. Incubar y centrifugar 15 min

1. Marcar 2 tubos
Eppendorf

4. Añadir 200μl de buffer de 6. Añadir 200μl de buffer de lisis 8. Añadir 200μl de buffer de Pastilla complejo SDS proteína y
2. Transferir el cultivo suspensión neutralización DNA cromosómico 14. Descartar el sobrenadante y dejar
de células al 1 tubo secar la pastilla en el tubo
TRIS CH3CO2K
NaOH 11. Transferir el
PH 7,5
sobrenadante al 2 tubo

Desnaturaliza el DNA Desnaturaliza el plásmido y el DNA Precipita el complejo SDS el cual

cromosómico contiene lípidos y proteínas
Precipitar DNA
plasmídico 15. Resuspender en 40 ml de agua
EDTA
Renaturaliza el DNA HPLC
SDS
Agente quelante, estabiliza la
3. Centrifugar 5 min membrana celular uniendo los
cationes divalentes Detergente iónico,
12. Adicionar 2,5μl de
disuelve fosfolípidos de
etanol
la membrana causando
lisis

Gel agarosa
7. Incubar temperatura electroforesis
5. Incubar 15 min ambiente 5 min 9. Incubar 15 min
 Función de los reactivos en lisis
alcalina

El acetato re naturaliza las

El SDS es un detergente que cadenas de ADN, puede
La glucosa es más común en rompe las membranas ser de potasio 5M.
cósmidos. Esta disolución bacterianas y desnaturaliza Además, el potasio forma
isotónica secuestra los iones proteínas. El NaOH complejos con el SDS que
presentes en el medio, que desnaturaliza el ADN. a su vez interaccionan con
son cofactores de las las proteínas formando
endonucleasas. precipitados junto con el
ADN cromosomal.
Función de los reactivos
• Incubación en frío: Esto se realiza para que la célula que esta
estudiando dure más tiempo