Cuantificación simultánea de fluoxetina y norfluoxetina en calostro y leche

humana madura usando un sistema de espectrometría de masas en tándem

bidimensional de cromatografía líquida.

Bianca Rebelo Lopes, Neila Maria Cassiano, Quezia Bezerra Cass, Daniela Miarelli Carvalho, Elaine
Christine Dantas Moisés.
SEPARARE − Núcleo de Pesquisa em Cromatografia, Departamento de Química, Universidade Federal de
São Carlos, São Carlos 13565-905, SP, Brazil.
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Departamento de Ginecologia e Obstetrícia, Universidade de São
Paulo, Ribeirão Preto 14049-900, SP, Brazil.
INTRODUCCIÓN
Problema experimental.
La leche materna constituye uno de los alimentos más adecuados para los bebés,
pero esta puede estar expuesta a una serie de drogas presentes en la terapia
materna realizada a la madre durante el embarazo y el post-parto. Por esta razón
es importante determinar la cantidad de medicamento que puede ser transferido al
recién nacido mediante la leche y de qué manera puede afectar su desarrollo.
INTRODUCCIÓN
La leche humana está clasificada como calostro, leche de transición y leche
madura, estas contiene altas concentraciones de proteínas, lípidos y
carbohidratos. La composición de estos compuestos cambia durante el período de
lactancia de acuerdo con las necesidades del bebé.

• Alto nivel de proteína y menor

nivel de lactosa.

• Alto contenido de vitaminas

solubles en grasa, minerales e
inmunoglobulinas.

• Baja concentración de lípidos.

INTRODUCCIÓN
Debido a trastornos depresivos durante el embarazo y los primeros meses después del parto
se prescribe Fluoxetina para tratar este trastorno.

Se empleó un sistema de cromatografía líquida bidimensional acoplada a un espectrómetro

de masas de triple cuádruplo para la determinación de Fluoxetina (FLU) y Norfluoxetina (N-
FLU) en calostro y leche madura mediante una inyección directa de muestras.

Técnica LC-MS/MS.
PROCEDIMIENTO
▪ INSTRUMENTACIÓN

Equipo cromatográfico:
- Bomba binaria (BSM).
- Bomba cuaternaria de clase H (QSM).
- Detector UV-vis.
- Muestreador automático con válvula Valco de seis puertos y dos válvulas Everflow
de seis puertos.
Espectrometría de masas:
- Se llevó a cabo utilizando una interfaz de electrospray (ESI) en modo ionización
positiva.
 PROCEDIMIENTO
▪  PARÁMETROS CROMATOGRÁFICOS

Fase ligada: Cromatografía de reparto/adsorción (fases químicamente ligadas).

Fase reversa: La fase estacionaria tiene una naturaleza apolar (cadenas
hidrocarbonadas, grupos fenilo) y las interacciones que se producen son
inespecíficas.
Fase estacionaria:
- Columna de fenilhexilo (100 × 2.1 mm, 2.7 m).
- Columna C18 (100 × 2.1 mm, 2.7 m).
Fase móvil:
Agua y un modificador orgánico: Acetonitrilo, metanol y 2-propanol.

Ref 1.LC y LC/MS su recurso imprescindible para columnas y consumibles. (n.d.). [ebook] Agilent Technologies, p.212. Available at: https://goo.gl/CReRbQ [Accessed 7 May 2018].
Ref 2. Cromatografía líquida de alta eficacia. (n.d.). [ebook] Available at: https://goo.gl/V91CVX [Accessed 7 May 2018].
PROCEDIMIENTO
▪ ESPECTROMETRÍA DE MASAS

El ESI-MS/MS (Ionización por electrospray): La muestra en solución se hace pasar

a través de un capilar al que se aplica un alto potencial eléctrico, a la salida del
capilar la solución se dispersa en forma de spray formado por pequeñas gotas
cargadas, las cuales se evaporan liberando moléculas (péptidos o proteínas)
protonadas a la fase gaseosa.

Ref.Centro de biología molécular Severo Ochoa. Espectrometría de masas de tipo

Electrospray (ES/MS). Sf. Recuperado el 07 de mayo de 2018 en https://goo.gl/aAkYtu.
Ref. LabCe. Liquid Chromatography with Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS). Sf.
Recuperado de https://goo.gl/SZS7L3 el día 07 de mayo de 2018.
 PROCEDIMIENTO
1. Soluciones de trabajo.

Se preparó una Se prepararon Se prepararon soluciones

soluciones para FLU de Se prepararon
solución madre de FLU para N-FLU, de Se prepararon soluciones para soluciones para FLU de
(15,0 g / ml) y N-FLU calibración: calibración: FLU de QC: QC:
(20,0 g / ml) en 0.15, 0.75, 1.50, 2.25, 0.20, 1.00, 2.00, 3.00, 0.30, 3.00 y 6.00 g / mL
4.50, 6.75 y 7.50 g / mL 0.40, 4.00 y 8.00 g /
acetonitrilo. 6.00, 9.00 y 10.0 g / mL (Agua) mL
(Agua) (Agua) (Agua)

Se almacenaron a
-20°C
 PROCEDIMIENTO
2. Preparación de la muestra de leche madura.

A cada 445 L de
leche, se añadieron
10.0 L de la Mezcla de vórtice Se agregaron 40.0 L de Centrifugación
Se dejaron reposar
solución de trabajo durante 30 s 2-propanol y 5.00 L de (13,420 g) durante
durante 10 min
apropiada. ácido fórmico. 15 min a 4 ◦C

Se transfirieron
Se inyectaron 10,0 L en el 200L a los viales
sistema 2D LC-MS / MS del
automuestreador.
 PROCEDIMIENTO
3. Preparación de muestra de calostro.

Se transfirieron
alícuotas de 12,3L Adición de 200L de Se trataron con
de la sln de trabajo agua ultrapura y Se mantuvieron durante
Mezcla vortex (30 s) 10 minutos a 150L de
apropiada a tubos de 250L de leche de acetonitrilo, 5,00L
centrífuga calostro temperatura ambiente.
de ácido fórmico.

Se sometieron Se centrifugaron a
10,0mL a análisis de Se recogió la capa acuosa
media. 13.420 g a 4 ° C
LC-MS / MS. por 15 min.
PROCEDIMIENTO
4. Estudio clínico.
colección de muestras de
calostro (24 - 72 h posparto)
de 17 madres que
recibieron una
administración oral preparto
de una dosis única de 20.0
mg de FLU
Las muestras de leche
madura de un donante bajo
terapia con 40.0 mg diarios Las muestras se Recolección de muestras
almacenaron en alícuotas de calostro y leche
de FLU se recolectaron 4 h
después de la de 2,00 ml a -20 ◦C madurada libre de droga.
administración del fármaco
RESULTADOS
DISCUSIÓN DE RESULTADOS
CONCLUSIONES