Identificación de Aminoácidos y Proteínas,

Determinación de Proteína de Leche por el Método

de Kjeldahl y Desnaturalización de Proteínas

Natalia Trujillo, Cristian Pisso, Leidy Sánchez, Felipe Soto y Daniela Martínez.

Facultad de Educacion
Licenciatura en Ciencias Naturales: Química, Física y Biología.
 Resumen
En esta práctica se realizaron una serie de experimentos, los cuales fueron el
método kjeldahl y desnaturalización, en donde se produjeron una variedad de
reacciones con la leche, yema de huevo y clara del mismo con el vinagre y de la
misma forma con el alcohol en cada uno de sus casos, luego en la segunda práctica
virtual provista por el docente, se les realizó a las muestras tirosina, gelatina, prolina,
caseína, leucina, metionina, tirosina valina y agua como muestra de referencia o
blanco las pruebas de Millón, Biuret, Ninhidrina y Xantoproteica, con las cuales se
buscará identificar de forma cualitativa los aminoácidos y proteínas presentes en
cada una de las muestras como fin de la práctica.

Palabras claves: proteínas, aminoácidos, método de kjeldahl, cualitativo,

reacciones, desnaturalización.
 Materiales y métodos

1. Identificación cualitativa de aminoácidos y proteínas.

Para el desarrollo de la práctica se utilizaron aminoácidos como tirosina, valina, leucina,

metionina y prolina al 1% y proteínas como la caseína y gelatina al 2%. Para empezar se
trasvaso 1 mL de cada disolución de aminoácido y proteína en tubos de ensayo y se dispuso un
tubo de ensayo con agua destilada (muestra blanco), luego se adiciono 1 mL de reactivo de
biuret; para la prueba de ninhidrina se trasvaso 1 mL de cada disolución de aminoácido,
proteína y la muestra blanco en tubos de ensayos, seguidamente se agregaron 7 gotas de
disolución de ninhidrina y se calentó a 100°c por 10 minutos. Luego en la prueba de Millón, se
trasvaso 1 mL de cada disolución de aminoácido, proteína y la muestra blanco en tubos de
ensayos, se agregaron 6 gotas de del reactivo de millón y se agita, posteriormente se calentó a
30°c. Por ultimo en la prueba xantoproteica, se transvaso 1 mL de cada disolución de
aminoácido, proteína y la muestra blanco en tubos de ensayos, se adiciono 1 mL de ácido
nítrico concentrado y se calienta suavemente.
2. Determinación de proteínas en leche por el método de Kjeldahl.

Inicialmente se pesaron 10 g de sulfato potásico en una balanza analítica y posteriormente se

colocaron en los tubos de digestión, se adiciono 1 mL de disolución de sulfato de cobre al 5%. Se
agito la leche cuidadosamente sin hacer espuma, en un tubo de ensayo con tapón se vertió 5 mL de
la muestra de leche, luego se tapó y se procedió a pesar colocando un vaso precipitado sobre el
platillo de la balanza analítica. La muestra de leche se vierte en el tubo de digestión y se pesa
nuevamente el tubo de ensayo para saber la cantidad de muestra. Luego se añadieron 20 mL de
ácido sulfúrico concentrado con un dosificador y se agito, se tomaron 4 muestras en los tubos de
digestión y se dejó dos más con tan solo ácido sulfúrico. Se tapó con el objeto de vidrio del tubo de
digestión que se conecta a una bomba de vacío, se colocó en el bloque calefactor y se dejó por 4
horas. Se comenzó calentando suavemente y posteriormente se fue elevando la temperatura.
Después se dejaron enfriar a temperatura ambiente los tubos de digestión, posteriormente se
adiciono 100 mL de agua destilada, luego se lleva la muestra a la unidad de destilación. Se
vertieron 50 mL de ácido bórico al 4 % con un dosificador de 25 mL en erlenmeyer y se coloca un
exceso para que reaccione completamente con el amoniaco, se colocan gotas de indicador shiro
tashiro. Luego se adiciona hidróxido sódico encendiendo la unidad de destilación. Se recogieron en el
erlenmeyer 150 mL de condensado y se realizó la valoración con ácido clorhídrico al 0,25 M
3. Desnaturalización
3.1. Pruebas caseras con vinagre .

Para empezar se vertió una cantidad de leche a un vaso de cristal, luego adicione el vinagre en
volúmenes iguales, deje reposar por 30 minutos. Después en otro vaso de cristal vierte la clara de huevo
y adicione vinagre en volúmenes iguales, dejar reposar por 2 horas. Por último, en otro vaso de cristal
agrega yema de huevo y adicione vinagre en volúmenes iguales y deje reposar por 2 horas.

3.2. Pruebas caseras con alcohol etílico.

Primeramente agrega en un vaso de cristal cierta cantidad de leche, luego adicione alcohol etílico en
volúmenes iguales y dejar reposar por 30 minutos. Después en otro vaso de cristal se adicione la clara de
huevo y alcohol etílico en volúmenes iguales, deje reposar por 2 horas. Por ultimo, en un vaso de cristal
agrega una yema de huevo y alcohol etílico en volúmenes iguales y finalmente deje reposar por 2 horas.
 Resultados.

1. Identificación cualitativa de aminoácidos y proteínas

Tabla 1. Resultados de las pruebas cualitativas aplicadas a las muestras

Muestra Prueba de Prueba de Prueba de Prueba

Biuret ninhidrina Millón Xantoproteica

Caseína + + - +

Gelatina + + + -

Leucina - + - -

Metionina - + - -

Prolina - + - -

Tirosina - + + +

Valina - + - -

Agua - - - -
(blanco)
La reacción de biuret es un método general para la determinación de proteínas y péptidos y se basa en
la reacción de sulfato de cobre con compuestos que tengan dos o más enlaces peptídicos en un medio
alcalino. (Mora, 2007). En la figura 5 se ilustra el complejo de cobre formado en la reacción de biuret.

Figura 1. Complejo de cobre formado en la reacción de biuret.

Tomado y modificado de (Anderson Guarnizo Franco, 2009)

Las pruebas positivas fueron para la gelatina y caseína pues estas proteínas reaccionaron con el reactivo
de biuret y formaron el complejo de cobre teniendo como producto de la reacción una coloración purpura.
Los aminoácidos y la muestra blanco dieron negativo a la prueba tornando de color azul correspondiente a
la adición del reactivo de biuret.
La ninhidrina en presencia de compuestos que poseen al menos un grupo amino y carboxilo reaccionan
formando un derivado de color, generalmente azul y con desprendimiento estequiométrico de dióxido de
carbono. La presencia de color permitirá la detección cualitativa de aminoácidos, no todos los aminoácidos
expresan igual tonalidad de color con este reactivo, la prolina y hidroxiprolina desarrollan una coloración
amarilla en vez de azul (Calás, 2020). En la figura 6 se ilustra la reacción de ninhidrina con aminoácidos.

Figura 2. Reacción de ninhidrina con aminoácidos (Calás, 2020)

De manera experimental se obtuvo una coloración purpura-azulada que indicaba la presencia de

aminoácidos a excepción de la prolina que presento una coloración amarilla esto debido a que no todos los
aminoácidos presentan la misma coloración, el agua destilada dio negativo a la prueba por la no presencia
de aminoácidos.
Según (Linstromberg, 1977)“Cualquier compuesto fenólico da positiva a la reacción de Millón cuando se
calienta, dando una coloración roja”. La pruebas positivas fueron gelatina y tirosina por su coloración roja
indicándonos que posee un grupo fenólico tal como menciona (Ordorica) “La Tirosina nitrada forma
complejos con los iones Mercurioso Hg (I) y Mercúrico Hg(II) del reactivo produciendo un precipitado rojo”.
En la figura 7 se ilustra principio de reacción de millón.

Figura 3. Principio de reacción de Millón. Fuente:

https://upload.wikimedia.org/wikipedia/commons/t
humb/d/d7/Millon_Reaction_Principle_V.1.svg/460
px-Millon_Reaction_Principle_V.1.svg.png
La reacción xantoproteica es un procedimiento químico utilizado para determinar presencia o ausencia de
aminoácidos aromáticos, que pueden estar de forma libre o constituyendo proteínas solubles, péptidos o
polipéptidos. La coloración amarilla es debida a la formación de compuestos nitrogenados derivados de la
nitrificación de los grupos bencénicos (Gil, s.f.). Esta reacción se implementó para cada muestra de
aminoácidos, proteínas y agua, la coloración amarilla la obtuvo el aminoácido tirosina y caseina indicando que
presenta o es un aminoácido aromático, según (Puig, s.f.) “En el caso de la tirosina, este grupo consiste en un
anillo aromático asociado con un grupo hidroxilo (OH)”. En la figura 8 se ilustra la reacción xantoproteica

Figura 4. Esquema de la reacción xantoproteica. Tomado y modificado de

(Anderson Guarnizo Franco, 2009)
El método Kjeldahl.
 
1. Digestión.
 
El objetivo de la digestión es romper todos los enlaces de nitrógeno de la muestra y convertirlo en iones amonio
(NH4+), formando dióxido de carbono y agua; dando lugar a la formación de una espuma negra, que al
descomponerse se convierte en un líquido claro.

Muestra Catalizador
Proteína (-N) + H2 SO4 → (NH4 ) 2 SO4 + CO2 + H2 O
2. Destilación.

Se deja enfriarla muestra, para luego diluir con agua y se trasvasa a la unidad de destilación, en donde los iones
amonio (NH4 +) se convierten en amoniaco (NH3 ) mediante la adición de un álcali (NaOH). El amoniaco (NH3 )
es arrastrado al vaso receptor por medio de una corriente de vapor de agua.
 
(NH4 ) 2 SO4 + 2NaOH ↔ 2NH3 (gas) + Na2 SO4 + 2H2
 
Para capturar el amoniaco en forma de iones amonio solvatados se pueden utilizar ácidos dosificados como el
ácido sulfúrico o clorhídrico.
  
H2 SO4 (total) + 2NH3 → SO4 2- + 2 NH4 +
3. Valoración
 
La concentración de los iones amonio capturados puede determinarse por medio de dos tipos de valoración:
Cuando se utiliza el ácido bórico como solución absorbente, se lleva a cabo una valoración ácido-base utilizando
una solución estandarizada de ácido sulfúrico o clorhídrico y una mezcla de indicadores. El rango de
concentración de la solución utilizada varía dependiendo de la cantidad de iones amonio presentes. El punto final
de la valoración también se puede determinar con un electrodo de pH (valoración directa).
 
B(OH) O 4 - + HX ↔ X- + B(OH)3 + H2O
HX= ácido fuerte (X= Cl- , etc.)
Cuando se utiliza una solución valorada de ácido sulfúrico como solución absorbente, el ácido sulfúrico residual
se valora con una solución estándar de hidróxido sódico y la cantidad de amoniaco se calcula por diferencia
(valoración indirecta).(Determinación de Nitrógeno por el Método Kjeldahl, 2009)
 
H2 SO4 (residual) + 2NaOH → SO4 2- + 2Na+ +2H2 O
3. Desnaturalización.

3.1. Pruebas caseras con vinagre.

En la prueba del vinagre y la leche se logró apreciar que pasado las dos horas se formaron dos capas, una
liquida y la otra un poco sólida con muchos coágulos. En la parte de abajo se encuentra la proteína de leche, la
caseína que se ha desplazado hacia el fondo, en cambio en la parte superior se puede observar un líquido
transparente que es el suero de la leche y el vinagre (figura 5).

Figura 5. Vinagre con leche

En la prueba casera de vinagre con clara de
huevo se pudo apreciar que pasado las horas
se formaron dos capas, una liquida y otra
sólida, observando un cambio de color en la
clara de huevo y una tonalidad amarillenta
debido al pH del vinagre (figura 6).
Figura 6. Vinagre con clara huevo
En la prueba casera de vinagre con yema de huevo se
observó que con el tiempo la muestra se formaron dos capas
de diferente color, en la parte de arriba transparente liquida
se encuentra el vinagre y en la parte de abajo amarillenta
sólida encontramos el precipitado de la yema de huevo
(figura 7).
Figura 7. Vinagre con yema de huevo
Pruebas caseras con alcohol etílico.
En este experimento se pudo evidenciar un
cambio en la concentración de la leche, pues se
En el experimento de alcohol etílico con clara de observó un líquido aguado de color blanco con
huevo se pudo apreciar cómo cambio el aspecto al precipitado en el fondo del mismo color, (figura 9).
cabo de unas horas, en donde la clara se va
volviendo blanca y sólida con coágulos, quedando en
la superficie del vaso y posterior a esto los residuos
del vinagre en el fondo (figura 8) .

Figura 9. Alcohol etílico y leche.

Figura 8. Alcohol etílico y clara de huevo
En esta prueba se observó en el alcohol etílico junto a la yema de huevo al cabo de unas horas un cambio en la
textura y color de la yema de huevo obteniendo un color amarillo pálido con algunas partes blancas producto de
residuos de clara de huevo (figura 10).

Figura 10. Alcohol etílico con yema de huevo.

La desnaturalización se provoca por medio de cambios en el PH en las proteínas debido a que las moléculas
involucradas adquieren cargas, lo cual genera repulsión siendo difícil mantener su estructura, como se
observo en las muestras. En primero lugar la mezcla de vinagre con leche, se puede evidenciar la disminución
del pH de la leche producida por la adición de un ácido, así como el vinagre, afecta la solubilidad de una de las
proteínas presentes (la caseína), causando que estas proteínas en condiciones ácidas, pueda formar
coágulos.
El mecanismo de este proceso puede ser explicado de la siguiente manera: la caseína, es una proteína que
tiene la propiedad de coagular, y consiste de varios componentes que se enlazan entre sí dando origen a las
“miscelas”, sub-unidad de proteína que estabiliza cada una de las miscelas y las mantiene distanciadas unas
de otras. Durante la acidificación, la sub-unidad protectora de la proteína, es inactivada, lo que permite que
las micelas puedan juntarse originando la coagulación de la leche. Químicamente, la miscela de caseína es
desestabilizada, produciéndose su aglomeración debido a la disminución de su carga isoeléctrica hasta llegar
a la del punto isoeléctrico. Al mismo tiempo, la acidez del medio aumenta la solubilidad de los minerales, por
lo que el calcio y el fósforo orgánicos contenidos en la miscela gradualmente se van volviendo solubles en la
fase acuosa. Finalmente, las micelas se desintegran y la caseína precipita, resultando en la formación de
coágulos. (Ramos, 2018)
Seguidamente el experimento de clara de huevo en vinagre, se pudo observar la desnaturalización de
proteínas que se da en la clara de los huevos, en los huevos frescos, la clara es transparente y líquida; pero
al cocinarse se torna opaca y blanca, formando una masa sólida intercomunicada. Esa misma
desnaturalización puede producirse a través de una desnaturalización química como en este caso el vinagre,
las cadenas de proteínas que hay en la clara de huevo se encuentran enrolladas adoptando una forma
esférica, estas se denomina proteínas globulares. El vinagre al estar en contacto con la clara de huevo crea
una reacción en la cual la clara cambia de color, esto gracias al pH del vinagre. (Ortiz, 2010)

Posteriormente se realizó el ensayo de alcohol y clara de huevo, donde se comprobó que el alcohol va
desnaturalizando las proteínas del huevo, principalmente en la clara. Cuando las proteínas se desnaturalizan
pierden parte de su estructura molecular y de ahí su aspecto. Casi inmediatamente observamos que la clara
se va volviendo blanca y sólida. La agregación de disolventes menos polares generan disminución de la
polaridad, lo cual crea una disminución del grado de hidratación de los grupos iónicos superficiales de la
molécula de proteína. Los disolventes orgánicos interactúan con el interior hidrofóbico de las proteínas
desorganizando su estructura terciaria modificando la constante dieléctrica del medio de hidratación de las
proteínas provocando su desnaturalización y finalmente precipitación. (Odeon , 2012)
 Conclusiones y recomendaciones
La identificación de aminoácidos y proteínas se puede realizar mediante pruebas cualitativas de manera
experimental, aplicando la prueba de biuret para la determinación de proteínas y péptidos, la prueba de ninhidrina
para determinar aminoácidos, la prueba de millón para determinar compuestos fenólicos y por último la prueba
xantoproteica para determinar la presencia de aminoácidos aromáticos. El resultado de estas pruebas depende de
las características y composición de las muestras y por lo general se evidencian en el viraje del color. Cabe
destacar que en algunas pruebas no todos los aminoácidos expresan igual su tonalidad en las pruebas.

Al mezclar los diferentes compuestos de huevo, leche, vinagre, todos reaccionan desnaturalizando los solutos,
uniendo las reacciones o se separan los componentes moleculares, por las características atómicas observando
los cambios visibles, que a la vez son moleculares y físicos, comprobando la dicotomía de las proteínas, grasas,
lípidos, alcohol, etc.

Se puede concluir que si generamos cambios a los compuestos, si se le agrega sustancias que difieren con la
solubilidad, obtenemos resultados llamativos para la experimentación, donde podemos estudiar fenómenos y
condiciones aptas para el desarrollo de un determinado componente, la formación de nuevas estructuras
atómicas, comprobando las cualidades de diferentes compuestos que reaccionan generando enlaces por la
atracción electrónica de los átomos, donde se genera el caos para la reorganización que se aprecia tanto
microscópicamente o visiblemente.
 Referencias
• Anderson Guarnizo Franco, P. N. (2009). Experimentos de Quimica Orgánica con enfoque en ciencias de la
vida. Armenia, Quindio, Colombia: Elizcom S.A.S.
• Calás, M. A. (06 de abril de 2020). Manual de practicas de bioquímica para instrumentacion quirúrgica.
Obtenido de https://www.coursehero.com/file/41034478/manual-de-prscticas-quirurpdf/
• Douglas A. Skoog, D. M. (1996). Fundamentos de química analítica (4 ed., Vol. 1). Reverte.
• Gil, M. (s.f.). Reacción xantoproteica: fundamento, procedimiento, uso. Recuperado el 06 de abril de 2020, de
https://www.lifeder.com/reaccion-xantoproteica/
• Linstromberg, W. W. (1977). Curso breve de química orgánica. Barcelona: Reverte.
• Mora, S. Q. (2007). Manual de experimentos de laboratorio para bioquímica. San Jose , Costa rica: Euned.
• Odeon , A. (2012). Laboratorio de bioquimica desnaturalizacion de proteínas. Obtenido de
https://www.academia.edu/25976542/Laboratorio_de_bioquimica_desnaturalizacion_de_prote%C3%ADnas
• Ortiz, L. (2010). Proteinas. Obtenido de http://proteinas-ob.blogspot.com/2010/06/experimento-2.html
• Puig, R. P. (s.f.). Tirosina: características, estructura, funciones, beneficios. Recuperado el 06 de abril de 2020,
de https://www.lifeder.com/tirosina/#Caracteristicas
• Ramos, M. (2018). Cuando la leche se acidifica, se forman coágulos. ¿Cómo ocurre este fenómeno? Obtenido
de http://www.food-info.net/es/qa/qa-fp27.htm
Gracias.