ESPECTROSCOPIA DE

FLUORESCENCIA Y
FOSFORESCENCIA
 DIAGRAMA DE JABLONSKI (1898-1980)

relajación vibracional

S2 conversión interna IC

relajación vibracional
cruce intersistemas ISC

S1 T1
kNR IC
kNR ISC
hA hF hP

S0
fluorescencia fosforescencia
LUMINISCENCIA emisión de luz desde un estado electrónicamente excitado

 Se alcanza el estado excitado por absorción de luz en:

FLUORESCENCIA estado singulete excitado, transición permitida, ns

FOSFORESCENCIA estado triplete excitado, transición prohibida, ms

 Se alcanza el estado excitado por una reacción química:

QUIMIOLUMINISCENCIA
 10-8 s
10-15 s

10-3 s
OBSERVAR: la escala de tiempo de los procesos:

• ABSORCION: ~ 10-15 seg

• CONVERSION INTERNA: ~ 10-11-10-9 seg
• FLUORESCENCIA: ~ 10-10 a 10-7 seg
• FOSFORESCENCIA: ~ 10-6 a 1 seg (es una transición “prohibida” )
• RELAJACION VIBRACIONAL: ~ 10-12-10-10 seg

Los pasos propiamente dichos de absorción y de emisión son extremadamente

rápidos, tanto que los núcleos no llegan a moverse ( principio de Franck-Condon).
La absorción sólo da información del entorno inmediato a la molécula que
absorbe.
La relajación vibracional por lo general es mucho más rápida que la fluorescencia,
entonces la molécula se relaja completamente y (en general) sólo vemos la
emisión desde el estado S1.
La escala de tiempo de fluorescencia es la misma que la escala de tiempo de
movimientos moleculares, por eso el espectro de fluorescencia posee
información de un entorno más amplio que el de absorción.
FLUORESCENCIA

 1er. paso: absorción o excitación

energía suficiente para llegar a nivel
electrónico superior S1 o S2 λexc

ESTADO EXCITADO

 2do. paso: emisión de luz

energía radiativa emitida menor que la
absorbida, λem > λexc
Corrimiento de Stokes
 RENDIMIENTO CUANTICO DE FLUORESCENCIA (Q):

Rendimiento (Q) = fotones emitidos <1

fotones absorbidos

en términos cinéticos de cada proceso:

= constante de velocidad de emisión

= constante de velocidad de decaimiento no radiativo

TIEMPO DE VIDA: tiempo promedio que un fluoróforo pasa en el
estado excitado antes de volver al estado basal (por cualquier vía)

= tiempo de vida medida

TIEMPO DE VIDA NATURAL: es el tiempo de vida si sólo volviera al

estado basal por fluorescencia

= tiempo de vida intrínseca o natural,

sin ningún proceso no radiativo

Se relacionan:
Parámetros a medir en
fluorescencia

 Intensidad de fluorescencia (ISS)

 Espectros de excitación y emisión (IF vs λ)
 λmax(ex), λmax(em)
 Rendimiento cuántico de fluorescencia (Q)
 Vida media del fluoróforo ()

 Anisotropía (r) (tiempo de correlación rotacional)

 Eficiencia RET (E) (distancia de Föster)
 Intensidad de fluorescencia
(estado estacionario) ISS
Intensidad resuelta en el tiempo ()

Iluminación continua Pulso de luz

ESPECTROFLUORÍMETRO
 ESPECTROFLUORÍMETRO

FUENTE DE LUZ Xe, Hg-Xe, Hg (high- low-P), Diodo (lase, LED)

MONOCROMADORES excitación y emisión vs FILTROS

ancho de banda
polarizadores

DETECTOR tubo fotomultiplicador (PMT)

MUESTRA geometría de iluminación de la muestra

La medida de IF es relativa
a la geometría del equipo
Intensidad de Fluorescencia y
concentración del fluoróforo

Efecto de filtro interno

Cuantificación del fluoróforo
midiendo Intensidad de fluorescencia IF
IF (λex, λem) = IA Φ Z Z = factor instrumental

Φ= rendimiento cuántico de F

IA = IT - I0 = I0 (1 – exp(-2.3 ε c l)
ε = coef. Absortividad a λexc
c = concentración del fluoróforo

Si Aλ << 1  IA = I0 (2.3 ε c l)

IF (λex, λem) = I0 Φ Z 2.3 ε c l

IF es proporcional a la conc. Si trabajamos con conc. diluidas

 Usar soluciones diluidas A < 0..05

Control con solo solvente

Usar adecuada λexc, filtro, conc. fluoróforo

Filtrar la solución
Fluoróforos en
bioquímica
 Fluorescencia intrínseca fluorescencia natural,
propia del sistema

 Fluorescencia extrínseca agrego a la

muestra un fluoróforo externo (sonda
fluorescente)
Fluorescencia en:

 Proteínas, fluorescencia intrínseca debido a residuos

aminoacídicos aromáticos, predomina el triptofano.
Además marcado con sondas fluorescentes (FITC, DNS). GFP
y derivados.

• Ácidos nucleicos, sin fluorescencia intrínseca,

se agregan sondas fluorescentes catiónicas planares (EtBr, DAPI)

•Membranas, no fluorescentes, se agregan sondas

liposolubles con baja fluorescencia en agua (DPH, ANS) o
fosfolípidos marcados
Fluorescencia en:
 NAD(P)H

 FAD, FMN
 Piridoxal fosfato (PLP)

 Clorofilas

 Indicadores fluorescentes (pH,

Na+, Cl-, Ca2+, O2)
 4.7 ns en solución
(2.3 ns FMN)
0.3-1 ns unido a prot.

0.4 ns en solución
1-5 ns unido a DH
 Phe Abundancia: 3.5%
ex = 260 nm, em= 282 nm
(Q. ~ 5)
Insensible al entorno

Tyr Abundancia: 3.5%

ex = 275 nm, em= 303 nm
(Q. ~ 220)
Insensible al entorno,
quencheable
Ionizable, tirosinato emite (<Q)

Trp Abundancia: 1.1%

ex = 295 nm, em= 350 nm (Q.
~ 770)
Sensible al entorno, quencheable
Varias 
 Sondas fluorescentes para proteínas

Fluoresceína (y Rodaminas) absorbe

y emite en el visible, alto rendimiento,
ε=80.000 M-1cm-1

DNS-Cl sensible a
polaridad del entorno,
fluorescencia polarizada
Compuestos de B (BODIPY) absorben y emiten en el visible, alto
rendimiento, ε=80.000 M-1cm-1, fotoestables, insensible al solvente y pH
 Sondas fluorescentes para ácidos nucleicos

Bases modificadas fluorescentes

 GFP = Green Fluorrescent Protein

Formación espontánea del fluoróforo al plegarse

¿Qué le puede suceder al estado excitado del fluoróforo antes de emitir y volver
al estado basal?

Relajación por solvente

Transferencia de energía

hν Quenching
X X* Transferencia de carga
hν’ Disociación de H+

 (ns) Formación de complejos

Formación de oligómeros
10-10 s
 Efectos del solvente y del entorno local sobre la
fluorescencia

HO

Acido dimetilamino naftalen sulfónico

(dansilo)

H = hexano
CH = ciclohexano
T = tolueno
EA = acetato de etilo
Bu = butanol
 Efectos del solvente y del entorno

k >> 1/ k  1/

Corrimientos de Stokes dinámicos

Cambio en la emisión por cambio de
solvente
o cambio del entorno (ej. unión a proteína)

Miro la fluorescencia de la sonda fluorescente, el TNS

Cambio en la emisión por cambio de
solvente
o cambio del entorno (ej. unión a proteína)

HSA = albúmina humana

ANS = Anilinonaftalensulfonato (fluoróforo muy sensible a la polaridad entorno)
Determinar constantes de unión de un ligando si
este es fluorescente y su fluorescencia cambia
con la unión o si la fluorescencia intrínseca
cambia por efecto de la unión de un ligando
Emisión del triptofano es sensible al entorno
(ej. desnaturalización de proteína)

N = nativa
U = desplegada “unfolded”
Usos de fluorescencia en bioquímica

 Localización subcelular
 Cambios en la concentración
 Interacciones moleculares
 Cambios conformacionales
 Distancias intra/intermoleculares
 Difusión rotacional
 Caracterización estructural
 Actividad enzimática
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