Fluorimetría y sus

aplicaciones en el
Laboratorio Clínico”

Análisis Químico Instrumental

Aspectos importantes de Fluorimetría:
Técnica espectrofotométrica que se basa en la absorción de
radiación por parte del analito a medir en una muestra y su posterior
emisión. Su fundamento es la fluorescencia que es la emisión de
radiación por electrones excitados.
En el fenómeno de fluorescencia, una molécula absorbe radiación
electromagnética y debido a ello los electrones pasan de un estado
basal a otra fase de excitación.

Fig. 1: Esquema de la dirección de la energía

radiante incidente, transmitida y emitida en una
cubeta de muestra.
Algunos de tales electrones perderán energía y
caerán en una orbita energética inferior a la que
habían alcanzado, antes de volver definitivamente a
su orbita energética basal.

La energía emitida al volver al estado basal es inferior

a la absorbida.

La longitud de onda de la luz emitida será más larga

que la absorbida para la excitación debido a que la
energía emitida es menos que al absorbida.

El tiempo que transcurre entre la absorción de

energía y la de su liberación en forma de luz, es
aproximadamente 10-8s.
Un gran número de compuestos presentan el
fenómeno de fluorescencia.

Es posible transformar los compuestos no

fluorescentes o con fluorescencia espontánea débil
en derivados con alta fluorescencia, a través de
reacciones químicas

La intensidad de la fluorescencia es directamente

proporcional a la concentración de sustancias
fluorescentes en soluciones diluidas.

La fluorescencia es emitida por los compuestos en

todas direcciones, pudiendo cuantificarse.
Tipos de Fluorímetros y sus partes ópticas:

-Fluorímetros de Filtro:
Fuentes de luz de excitación: la fuente de radiación en los
instrumentos de fluorescencia es una potente fuente de
radiación ultravioleta.
-Lámpara de vapor de mercurio:
Es un dispositivo sencillo alimentado a voltaje constante, de bajo
costo y de larga duración.
Proporciona varias líneas de emisión intensas superpuestas a un
espectro continuo débil.
Los peaks de emisión de esta lámpara son: 313, 365, 405 y 436
nm.
-Fuente de arco de xenón:
Esta fuente se alimenta a voltaje constante, es de mayor costo y
menor duración.
Proporciona una intensa radiación en al región visible y UV,
produciendo una emisión entre 200 y 700 nm.
Selector de longitud de onda primario:
Se utiliza un filtro primario, generalmente es de vidrio o de cuarzo
y en algunos modelos, filtros de interferencia.
Se usa para:
Suministrar a la muestra una energía de excitación
monocromática adecuada.
Permitir la disminución de la fotodescomposición de un analito

Cubetas:
Las cubetas que se utilizan son de cuarzo, ya que Muchos de los
analitos a leer en fluorimetría se excitan antes por radiación UV

Selector de longitud de onda secundario :

El filtro secundario es de corte de vidrio.
Selecciona la longitud de onda de emisión que será captada
por el detector.
Debe absorber cualquier radiación dispersada primaria, pero
transmitir la luz fluorescente.
Detector:

Utiliza como detector un tubo fotomultiplicador.

Es muy sensible y posee gran rapidez en su respuesta.
Amplifica de modo significativo la intensidad de una corriente,
Es capaz de absorber luz y emitir electrones en proporción a la
energía radiante que
incide en la superficie del material sensible a la luz.
Algunos modelos utilizan fotocélulas o fototubos.
- Fluorímetro de haz sencillo:

Utiliza monocromadores del tipo rejillas de difracción, para la

selección de longitud de onda.

El monocromador primario selecciona la longitud de onda de

excitación que llegará a la muestra y el monocromador
secundario selecciona la longitud de onda de emisión que se
detecta.

Estos monocromadores aportan al instrumento una gran

versatilidad y selectividad.
-Fluorímetro de doble haz:

Ocupa doble haz de luz, donde la fuente y el monocromador

primario suministran luz incidente a un espejo desdoblador de
haz que envía radiación alternativamente a la cubeta de la
muestra y a la cubeta de referencia.

La señal de fluorescencia de cada cubeta se detecta por

separado en el fotomultiplicador, primero la de la muestra y
luego la de referencia.

La gran ventaja de este instrumento es que nos entrega una

mayor precisión en las lecturas ya que se puede colocar el
blanco de reactivos y la muestra, leyéndose así la diferencia
entre ambas señales de fluorescencia.
Aplicaciones Fluorimetría en Laboratorio Clínico:

Las mediciones de iones inorgánicos tales como: Magnesio,

Calcio, Cobre, Hierro, Zinc

Determinación de aminoácidos y sustancias relacionadas con

los mismos, tales como: fenilalanina, tirosina, triptófano,
creatina, histidina, urobilina y bilirrubina.

Medición de nucleótidos como: ATP, ADP, NADH y NADPH.

Medición de esteroides tales como: cortisol, aldosterona,

progesterona, testosterona, estrógenos, colesterol y ácidos
biliares.
Determinación de drogas, entre las que se incluyen: antibióticos,
salicilatos, sulfonamidas, anticoagulantes, barbituratos,
quinidina, antipalúdicos, antihistamínicos y alcaloides.

Otras mediciones, como: triglicéridos y vitaminas.

Determinación de enzimas, tales como: deshidrogenasa láctica,

transaminasas, alcoholdeshidrogenasa, fosfatasas ácidas y
alcalinas, lipasa, colinesterasa, entre otras.
Precauciones frente a posibles fuentes de error en
Fluorimetría:
Los solventes que se utilicen no deben ser fluorescentes ni
deben absorber radiación del espectro que se
ocupe para la determinación.

Se debe utilizar cubetas de cuarzo, porque el vidrio blanco

tiene una fluorescencia elevada. Las cubetas deben
estar limpias, sin ralladuras para no aumentar la dispersión de
la luz. La limpieza debe realizarse con detergentes
no fluorescentes.

El agua y los reactivos que se utilicen en estas

determinaciones no deben estar en contacto con tapones de
goma negra, polietileno o baquelita, porque les pueden
transmitir cierto grado de fluorescencia.
Es necesario controlar el pH, porque este tiene influencia sobre
la fluorescencia que puedan presentar algunas
sustancias.

La temperatura es un factor importante que debe ser

controlado, ya que al aumentar la temperatura disminuye
la fluorescencia.

Las muestras que van a ser leídas no deben presentar burbujas

de gas, sólidos suspendidos o enturbiamiento.

Un exceso en la dispersión de la luz provocado por partículas o

burbujas dará lecturas bajas de la radiación
fluorescente.
D.1.-UniCAP 100:

Este instrumento realiza lecturas fluorimetricas en el ámbito de

la inmunología, tales como:

IgE total, Anticuerpos antigladinicos, IgA e IgG especificos,

Enfermedades Celiacas, Proteína Eosinofílica Cationica,

Anticuerpos antitiorideos: antipiroxidasa, TPO y

antitiroglobulina
Conclusiones

La fluorimetría es una técnica que posee gran sensibilidad y

especificidad, pero el uso de fluorímetros es escaso y solo se
realiza en laboratorios que poseen recursos suficientes para
poner en marcha un método basado en este principio, debido
al alto costo de los reactivos y de los instrumentos.

Los laboratorios que poseen fluorímetros, generalmente están

orientados para realizar mediciones inmunológicas.

Finalmente como en toda técnica de alta especificidad y

sensibilidad, deben controlarse adecuadamente todas las
variables que puedan dar resultados erróneos.