CARACTERÍSTICAS FÍSICAS Y

QUÍMICAS DE LOS
CARBOHIDRATOS

MONO Y DISACÁRIDOS
{
SOLUBILIDAD:
MUY SOLUBLES EN AGUA
MENOS SOLUBLES EN ETANOL
ALGO SOLUBLES EN ETANOL CON
AGUA CALIENTE
INSOLUBLES EN SOLVENTES
ORGÁNICOS (EXCEPTO PIRIDINA)
 IMPORTANCIA DE LA
SOLUBILIDAD DE LOS
CARBOHIDRATOS

 INFLUYE EN LA HABILIDAD PARA

REALIZAR DETERMINACIONES DE
DENSIDAD.

 EXISTE RELACIÓN ENTRE SU

DENSIDAD Y SU
CONCENTRACIÓN
ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE LOS
CARBOHIDRATOS

 MUY ÚTIL PARA DETERMINAR

SU CONCENTRACIÓN.
 EXACTO SÓLO PARA
SOLUCIONES DE PURA
SACAROSA.
 AMPLIAMENTE USADO PARA
APROXIMAR VALORES PARA
OTRAS SOLUCIONES
AZUCARADAS.
ROTACIÓN ÓPTICA DE LOS
CARBOHIDRATOS

 FACILITA AL MÉTODO PARA

MEDIR LA CONCENTRACIÓN DEL
AZÚCAR EN SOLUCIÓN.

 MÉTODO BASADO EN
MEDICIONES POLARIMÉTRICAS.

 GENERALMENTE UTILIZADO
CON SACAROSA Y ALMIDÓN.
PROPIEDADES REDUCTORAS
DEL GRUPO CETO O ALDEHÍDO

 EL GRUPO CETO O ALDEHÍDO

REDUCIRÁN SOLUCIONES
ALKALINAS DE SALES METÁLICAS
AL METAL ÓXIDO O LIBRE.

 LA REACCIÓN ENTRE EL AZÚCAR Y

EL SULFATO CÚPRICO NO ES
ESTEQUIOMÉTRICA Y
PROPORCIONA ÓXIDO CUPROSO
MUY DEPENDIENTE DE LAS
CONDICIONES DE LA REACCIÓN.
 REACCIONES DE
CONDENSACIÓN DE LOS
CARBOHIDRATOS

 MONOSACÁRIDOS + ÁCIDO FUERTE +

CALOR → SUBSTANCIAS QUE SE
CONDENSAN CON REACTIVOS (E.G.
FENOL) PARA PROPORCIONAR
COMPLEJOS COLOREADOS.

 PÉRDIDA DE AGUA Y FORMACIÓN DE

DERIVADOS DEL FURFURAL.
(SE DEBE CONTROLAR LA FUERZA DEL
ÁCIDO, EL TIEMPO Y LA VELOCIDAD
DE CALENTAMIENTO)
 REACCIONES DE SUSTITUCIÓN
DE LOS CARBOHIDRATOS

 FORMACIÓN DE ÉTER (E.G. METIL

ÉTERES)

 ESTERIFICACIÓN (E.G. ACETATOS DE

ALDITOL)

 IMPORTANTES EN LA PREPARACIÓN
DE DERIVADOS VOLÁTILES PARA LA
CROMATOGRAFÍA GAS-LÍQUIDO.
 PROPIEDADES DE LOS
POLISACÁRIDOS

 SOLUBILIDAD.- VARÍA
ENORMEMENTE
a) DEXTRINAS (ALMIDONES DE
VARIAS COMPOSICIONES
PARCIALMENTE
HIDROLIZADOS)

a) AMILOPECTINA Y GLUCÓGENO.-
SE DISPERSAN PARCIALMENTE
EN AGUA CALIENTE.
 SOLUBILIDAD DE LOS
POLISACÁRIDOS

 SUBSTANCIAS PÉCTICAS.- SOLUBLES

EN AGUA CALIENTE A MENOS QUE
CONSTITUYAN UN COMPLEJO CON Ca.

 GOMAS, MUCÍLAGOS,
ARABINOXILANOS, ß-GLUCANOS.-
SOLUBLES EN AGUA
 SOLUBILIDAD DE LOS
POLISACÁRIDOS

 CELULOSA, ALGUNOS MANANOS Y

XILANOS, HEMICELULOSA.-
INSOLUBLES EN AGUA.

 EN GENERAL LOS POLISACÁRIDOS

SON INSOLUBLES EN ALCOHOLES
ACUOSOS CON FUERZAS POR ARRIBA
DE 75 A 80% (v/v).
FORMACIÓN DE COMPLEJOS DE
LOS POLISACÁRIDOS

 EL ALMIDÓN FORMA UN COMPLEJO

INSOLUBLE CON EL YODO EN
SOLUCIÓN DE NaCl/KI.

 LOS POLISACÁRIDOS SULFATADOS DE

LAS ALGAS DE TIPO CARRAGENO
FORMAN COMPLEJOS CON LOS
COMPUESTOS CUATERNARIOS DE
AMONIO
 HIDRÓLISIS DE LOS
POLISACÁRIDOS

 LA MAYORÍA DE LOS POLISACÁRIDOS

SON SUJETOS A LA HIDRÓLISIS EN
PRESENCIA DE ÁCIDOS DILUIDOS.

 LA MAYORÍA DE LOS COMPONENTES

DE LA HIDRÓLISIS SON ESTABLES EN
LOS ÁCIDOS DILUIDOS (EXCEPTO LA
FRUCTOSA Y TAL VEZ LA ARABINOSA)
 SOLUBILIDAD DE LOS
POLISACÁRIDOS

 LA CELULOSA ES MUY ESTABLE A LA

HIDRÓLISIS ÁCIDA (SE NECESITAN 72%
(p/p) DE H2SO4 PARA DEGRADARLA)

 LOS RESIDUOS DE ÁCIDO URÓNICO DE

UN POLISACÁRIDO CONFIEREN
ESTABILIDAD EN EL ENLACE
GLUCOSÍDICO ADYACENTE.
 SOLUBILIDAD DE LOS
POLISACÁRIDOS

 LA MAYORÍA DE LOS RESIDUOS

DE ÁCIDO URÓNICO SE LIBERAN
EN COMBINACIÓN CON OTRO
RESIDUO, PRODUCIENDO UN
DISACÁRIDO EXTREMADAMENTE
RESISTENTE A LA HIDRÓLISIS
ÁCIDA.
 DETERMINACIÓN DE
AZÚCARES LIBRES

 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

 CUANDO LOS AZÚCARES ESTÁN

EN SOLUCIÓN

 GASES DISUELTOS.-
REMUÉVANSE DE LOS
PRODUCTOS CARBONATADOS O
FERMENTADOS MEDIANTE
VACÍO
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

 PIGMENTOS.- PUEDEN INTERFERIR

CON LAS REACCIONES. EXISTEN
MUCHAS MANERAS DE
ELIMINARLOS (E.G. CARBÓN O
SALES DE PLOMO)

 ACETATO DE PLOMO BÁSICO.-

INTERFERIRÁ CON LOS MÉTODOS
POLARIMÉTRICOS.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

 ACETATO DE PLOMO
NEUTRO.- FORMA
PREFERENTE DE USO. SE
UTILIZA COMO UNA
SOLUCIÓN ACUOSA
SATURADA. SE ELIMINA EL
EXCESO AÑADIENDO YA SEA
OXALATO DE SODIO O
POTASIO.
 PREPARACIÓN DE LA MUESTRA

DESPROTEINIZACIÓN


LAS PROTEÍNAS INTERFIEREN CON LAS

DETERMINACIONES REDUCTORAS Y
COLORIMÉTRICAS. EL USO DE TCA
(ÁCIDO TRICLOROACÉTICO) ES
DEMASIADO FUERTE PARA
DESPROTEINIZAR SI LA MUESTRA EN
SOLUCIÓN CONTIENE DISACÁRIDOS O
FRUCTOSA.
 DESPROTEINIZACIÓN DE LA
MUESTRA

 MÉTODOS ACEPTABLES:

a) AÑÁDASE ETANOL O ACETONA

AL 70% (v/v). LA MAYORÍA DE
LAS PROTEÍNAS COAGULARÁN
Y SE PODRÁN FILTRAR O
CENTRIFUGAR.
 DESPROTEINIZACIÓN DE LA
MUESTRA

b) PRECIPITACIÓN CON METALES

PESADOS BAJO CONDICIONES
ALKALINAS. EJEMPLO: LA
SOLUCIÓN CARREZ PRECIPITA
PROTEÍNAS, ABSORBE ALGUNOS
COLORES, Y ROMPE EMULSIONES.
 PROCEDIMIENTO
 SE AÑADE A LA MUESTRA
LÍQUIDA SOLUCIÓN CARREZ I
(HEXACIANOFERRATO DE
POTASIO, K4[Fe(CN)6]·3H2O),

 SE AÑADE A LA MUESTRA
SOLUCIÓN CARREZ II (SULFATO
DE ZINC (ZnSO4·7 H2O), Y
SOLUCIÓN DE NaOH.

 SE ENFRÍA, SE DILUYE A UN
VOLUMEN DETERMINADO Y SE
FILTRA.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN
DE AZÚCAR

 SE PUEDE REALIZAR MEDIANTE

UN EXTRACTOR SOXHLET

 SE AÑADE LA MUESTRA AL
ETANOL AL 80% (v/v,
CONCENTRACIÓN FINAL)
HIRVIENDO. LOS POLISACÁRIDOS
SON INSOLUBLES Y EL CALOR
INACTIVA A LAS ENZIMAS.
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN
DE AZÚCAR

 PUEDE AÑADIRSE CARBONATO DE

CALCIO PARA NEUTRALIZAR LOS
ÁCIDOS DEL ALIMENTO, YA QUE ÉSTOS
PUEDEN OCASIONAR LA HIDRÓLISIS
DE LOS POLISACÁRIDOS.

 TAMBIÉN SE DEBE USAR

EXTRACTANTE DE ALCOHOL EN
BUFFER PARA EVITAR LA HIDRÓLISIS
ÁCIDA
PREPARACIÓN DE LA MUESTRA
INCLUYENDO LA EXTRACCIÓN
DE AZÚCAR

 EN CASO DE QUE SE NECESITE

ELIMINAR EL ETANOL DEL
EXTRACTO PREVIO AL ANÁLISIS
SE PUEDE REALIZAR ESTE PASO
MEDIANTE VACÍO. TAMBIÉN SE
PUEDE REALIZAR CALENTANDO
LEVEMENTE EN BAÑO MARÍA
BAJO CAMPANA DE EXTRACCIÓN
O MEDIANTE UN ROTAVAPOR.
 MÉTODOS DE ANÁLISIS DE
CARBOHIDRATOS

 MÉTODOS QUÍMICOS

 MÉTODO FLUORIMÉTRICO

 MÉTODOS ENZIMÁTICOS

 CROMATOGRAFÍA DE GASES

 CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA

 MÉTODOS FÍSICOS
 MÉTODOS QUÍMICOS
 REACCIONES DEL H2SO4 Y
CARBOHIDRATOS

 ÁCIDO FENOL SULFÚRICO

 FUNDAMENTO.- PROVIENE DE
LOS PRODUCTOS DE REACCIÓN
Y DEGRADACIÓN DEL ÁCIDO Y
EL AZÚCAR.
 ÁCIDO FENOL SULFÚRICO

 EL AZÚCAR SE TORNA PRINCIPALMENTE

HIDROXIMETILFURFURAL (HMF) O
FURFURAL (F) LOS CUALES SON
REALMENTE DETERMINADOS LEYENDO
LA ABSORBANCIA A 490nm
H2SO4
CONC.
FENOL + CARBOHIDRATO → AMARILLO –
NARANJA
CALOR
ÁCIDO FENOL SULFÚRICO

H+ H+
 POLISACÁRIDOS → MONOSACÁRIDOS → F + HMF
∆ ∆
VENTAJAS DEL MÉTODO

 ES SENCILLO
 ES RÁPIDO

 SENSIBLE A MUY BAJOS NIVELES

DE AZÚCAR (E.G. 5μg)

 ESPECÍFICO PARA

CARBOHIDRATOS.
 NO EXISTE INTERFERENCIA CON

PROTEÍNAS
VENTAJAS DEL MÉTODO

 A MENUDO NO ES NECESARIA LA
CLARIFICACIÓN DE LA MUESTRA
 LOS REACTIVOS SON BARATOS Y

ESTABLES
 COLOR ESTABLE

 RESULTADOS REPRODUCIBLES

 RESULTADOS CONFIABLES
DESVENTAJAS DEL MÉTODO

 LOS CARBOHIDRATOS QUE NO

PROPORCIONAN HMF Y F EN
LA DESCOMPOSICIÓN ÁCIDA
RESULTAN EN UNA AMPLIA
GAMA DE COLORES. POR
TANTO EL MÉTODO NO MIDE
TODOS LOS CARBOHIDRATOS
DESVENTAJAS DEL MÉTODO

 MIDE LA MAYORÍA DE LOS

CARBOHIDRATOS PERO LA
INTENSIDAD DEL COLOR
VARÍA AMPLIAMENTE ENTRE
LOS CARBOHIDRATOS, POR LO
QUE SE DEBE SELECCIONAR
UNO DE ELLOS COMO
REFERENCIA
DESVENTAJAS DEL MÉTODO

 LA PROPORCIÓN DE H2SO4 ES MUY

IMPORTANTE YA QUE SE ADICIONA
H2SO4 COMO FUENTE DE CALOR A LA
MUESTRA ACUOSA.

 SE DEBE EVITAR LA
CONTAMINACIÓN PROVENIENTE
DEL PAPEL FILTRO O POLVO DE
CELULOSA
 ANTRONA – ÁCIDO SULFÚRICO
(9,10 DIHIDRO-9-OXOANTRACENO)
 FUNDAMENTO
EL MÉTODO ES BÁSICAMENTE IGUAL
AL DEL FENOL PERO EL COLOR QUE SE
OBTIENE ES AZÚL – VERDE Y SE LEE A
UNA ABSORBANCIA DE 620nm.

 TIENE LAS MISMAS VENTAJAS Y

DESVENTAJAS QUE EL MÉTODO
ANTERIOR.
 DETERMINACIONES DE
AZÚCARES REDUCTORES

AZÚCAR + ÁLKALI → FRAGMENTOS DE

AZÚCAR REDUCTOR
+
Cu(OH)2 ← COMPLEJO DE
COBRE DE
TARTRATO Y
CITRATO
↓
∆ OH
H2O + Cu2O ---- CuOH ---- Cu+ + MEZCLA DE
ÁCIDOS DE
AZÚCAR
SOLUCIÓN DE FEHLING
 FUNDAMENTO

DOS SOLUCIONES :
 SOLUCIÓN A: SULFATO DE COBRE
CRISTALINO

 SOLUCIÓN B: TARTRATO DE SODIO Y

POTASIO (O CITRATO DE SODIO) +
HIDRÓXIDO DE SODIO (O HIDRÓXIDO
DE POTASIO O CARBONATO DE SODIO)
SOLUCIÓN DE FEHLING
 FUNDAMENTO

EL CITRATO O TARTRATO EVITA LA

PRECIPITACIÓN DEL HIDRÓXIDO
CÚPRICO

EL ÁLKALI ENOLIZA A LOS AZÚCARES Y

PROVOCA SU ROMPIMIENTO EN
FRAGMENTOS REACTIVOS QUE PUEDEN
OXIDARSE INMEDIATAMENTE: Cu++
(CÚPRICO) ES REDUCIDO A Cu+ (EL IÓN
CUPROSO)
SOLUCIÓN DE FEHLING

 FUNDAMENTO
A MEDIDA QUE LOS IONES Cu++ SE
REDUCEN POR LOS FRAGMENTOS
DE AZÚCAR, LOS IONES Cu+ SE
COMBINAN CON LOS IONES
HIDROXILO PARA FORMAR
HIDRÓXIDO DE COBRE (DE COLOR
AMARILLO, Cu+).
SOLUCIÓN DE FEHLING

 FUNDAMENTO

EL CuOH REDUCIDO PIERDE

H2O EN PRESENCIA DE CALOR
PARA DAR COMO RESULTADO
ÓXIDO CUPROSO INSOLUBLE
(Cu2O)
SOLUCIÓN DE FEHLING
 FUNDAMENTO

LA DETERMINACIÓN DEL
COBRE REDUCIDO SE PUEDE
LLEVAR A CABO POR
GRAVIMETRÍA, VOLUMETRÍA, O
POR MÉTODOS ELECTROLÍTICOS.

EL PESO DEL Cu2O SÓLO ES

APLICABLE A MUESTRAS
RELATIVAMENTE PURAS.
 DESVENTAJAS DEL MÉTODO
DE FEHLING

 LA REDUCCIÓN DEL COBRE Y LA

OXIDACIÓN DE LOS AZÚCARES NO ES
ESTEQUIOMÉTRICA .

 LA PRODUCCIÓN DE ÓXIDO CUPROSO

VARÍA, DEPENDIENDO DEL REACTIVO
ÁLKALI, LA VELOCIDAD Y TIEMPO DE
CALENTAMIENTO Y LA
CONCENTRACIÓN DE AZÚCARES EN
LA MUESTRA
 DESVENTAJAS DEL MÉTODO
DE FEHLING

 LOS AZÚCARES DIFIEREN EN SU

HABILIDAD PARA REDUCIR LA
SOLUCIÓN CÚPRICA, POR TANTO, LA
TITULACIÓN (O PESO O
ABSORBANCIA) DEBEN SER
CONVERTIDOS EN (mg DE COBRE) Y
POSTERIORMENTE SE RECURRIRÁ A
TABLAS PARA DETERMINAR LA
CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR
PRESENTE EN LA MUESTRA
MÉTODO DE MUNSON WALKER

 FUNDAMENTO

NaOH + Cu++ + AZÚCAR REDUCTOR → Cu+ +

AZÚCAR
∆ (Cu2O)
OXIDADO
LA DETERMINACIÓN DEL Cu2O PUEDE
SER GRAVIMÉTRICA, PERO ES
GENERALMENTE MEJOR TITULAR EL
ÓXIDO CUPROSO. ESTO SE PUEDE
REALIZAR MEDIANTE UNO DE LOS
SIGUIENTES MÉTODOS (SE LLEVAN
MUCHO TIEMPO):
 TITULACIÓN DEL
PERMANGANATO DE POTASIO

 EL Cu2O REACCIONA CON EL IÓN

FÉRRICO (Fe+++) EL CUAL ES REDUCIDO
AL IÓN FERROSO (Fe++).
POSTERIORMENTE EL IÓN FERROSO ES
TITULADO (+2 →+3) CON
PERMANGANATO (+3, ROSA → +2,
INCOLORO)

1) Cu2O + Fe2(SO4)3 → 2FeSO4 + CuSO4 +

CuO
 TITULACIÓN DEL
PERMANGANATO DE POTASIO

2) 10 FeSO4 + 2KMnO4 + 8H2SO4 →

5Fe2(SO4)3 + K2SO4 + 2MnSO4 +

8H2O
TITULACIÓN DEL TIOSULFATO
DE SODIO
 SE OXIDA EL Cu+ A Cu++ CON
ÁCIDO NÍTRICO.
POSTERIORMENTE SE
HIERVE LA MUESTRA PARA
ELIMINAR EL EXCESO DE
HNO3

HNO3
Cu2O → Cu(NO3)2
∆
TITULACIÓN DEL TIOSULFATO
DE SODIO

 SE AÑADE UNA CANTIDAD

CONOCIDA DE SOLUCIÓN
DE KI

2I- + 2Cu++ → 2Cu+ + I2

TITULACIÓN DEL TIOSULFATO
DE SODIO

 SE TITULA EL I2 LIBERADO CON

UNA SOLUCIÓN ESTÁNDAR DE
TIOSULFATO DE SODIO (Na2S2O3)

S2O3-2
I2 + I - → I 3
- → S O -2 + 3 I-
(TRIIODURO) 4 6

SE USA ALMIDÓN COMO

INDICADOR: AZÚL → INCOLORO
DESVENTAJAS DEL MÉTODO

 NO SE PUEDE DISTINGUIR
ENTRE LOS DIFERENTES
AZÚCARES REDUCTORES.

 SE REQUIEREN MUESTRAS
RELATIVAMENTE GRANDES
(100 A 200mg DE GLUCOSA
POR DETERMINACIÓN.
MÉTODO SOMOGY I-NELSON

AZÚCAR REDUCTOR + Cu++

→ Cu+ + AZÚCAR

REDUCTOR
 MÉTODO SOMOGY I-NELSON

 PROCEDIMIENTO:
Muestra
Reactivo de Somogyi
(Azúcar reductor +) Cu+2

Calor

Azúcar Oxidante + Cu+ (Cu2O)

Cu+1red) AsMo (ox)

Cu+2(oxi) AsMo (red) Es de un fuerte color azul

Se lee la absorbancia a 500 nm. Se cuantifica con la curva estándar

Reactivos para el Método de Somogy i y
Nelson para azúcares reductores
 Reactivo de Somogy i
 NaCO3 - Carbonato de sodio

 NaHCO3 – Bicarbonato de Sodio

 KaNaC4H4O6 – Tartrato de Sodio Potasio

 CuSO4·5H2O –Sulfato de Cobre

 Reactivo de Nelson

 (NH4)6Mo7O24 - Molibdato de amonio

 Na2HAsO7·H2O – Arsenato de Sodio

 H2SO4 – Ácido Sulfúrico

 MÉTODO FLUORIMÉTRICO

 FUNDAMENTO
ESTE MÉTODO ES POSIBLE
CUANDO LOS COMPUESTOS
ABSORBEN RADIACIÓN A
LONGITUD DE ONDA CORTA
Y LUEGO EMITEN
RADIACIÓN A UNA
LONGITUD DE ONDA MÁS
LARGA.
 DETERMINACIÓN DE GLUCOSA
POR EL MÉTODO
FLUORIMÉTRICO
 EXTRACCIÓN CON ISO-BUTIL
METIL CETONA.
 REACCIÓN CON HIDRACIDA DE
ÁCIDO p-HIDROXIBENZOICO
 ADICIÓN DE REACTIVO Y
LECTURA A UNA EMISIÓN DE
470nm
 EXCITACIÓN A 454nm
 MÉTODOS ENZIMÁTICOS

 INFORMACIÓN GENERAL
REQUIEREN DE UN
EXTRACTO NEUTRO O
ÁCIDO LIBRE DE ALCOHOLES
Y METALES PESADOS (NO SE
PUEDEN USAR SALES DE
PLOMO PARA CLARIFICAR
LOS EXTRACTOS)
APLICACIÓN DE LOS MÉTODOS
ENZIMÁTICOS

 SON POSIBLES PARA UN GRAN

NÚMERO DE CARBOHIDRATOS
O COMPUESTOS
RELACIONADOS:
MONOSACÁRIDOS
DISACÁRIDOS
POLISACÁRIDOS
ALOCHOLES Y POLIOLES
ÁCIDOS
 FUNDAMENTO

 GLUCOSA

EXISTEN KITS QUE CONTIENEN LOS

SIGUIENTES REACTIVOS PARA LA
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA:
BUFFER,
o – DIANISIDINA · 2HCl (CROMÓGENO
REDUCIDO)
CATALASA
GLUCOSA OXIDASA
 REACCIONES

GLUCOSA
OXIDASA
H2O + O2 + GLUCOSA → LACTONA DE
ÁCIDO D-GLUCÓNICO + H2O

CATALASA
H2O2 → H2O + ½ O2

O2 + CROMÓGENO INCOLORO,
REDUCIDO → CROMÓGENO AZÚL
OXIDADO
DETERMINACIÓN ENZIMÁTICA
DE SACAROSA/GLUCOSA

LA CONCENTRACIÓN DE
GLUCOSA ES DETERMINADA
ANTES Y DESPUÉS DE LA
HIDRÓLISIS ENZIMÁTICA
DETERMINACIÓN DE LA GLUCOSA
ANTES DE LA INVERSIÓN

 A UN pH DE 7.6 LA ENZIMA
HEXOQUINASA (HK) CATALIZA LA
FOSFORILACIÓN DE GLUCOSA
MEDIANTE EL ADENOSIN TRIFOSFATO.
EN PRESENCIA DE GLUCOSA 6-
FOSFATO DESHIDROGENASA (G6P-DH)
LA GLUCOSA-FOSFATO PRODUCIDA ES
ESPECÍFICAMENTE OXIDADA POR EL
NADP A GLUCONATO-FOSFATO CON
LA FORMACIÓN DE NADP REDUCIDO.
 REACCIONES
HK
GLUCOSA + ATP → G6P + ADP
G6P-DH
G6P++ NADP+ → GLUCONATO-FOSFATO + NADPH +
H

EL NADPH FORMADO EN ESTA

REACCIÓN ES ESTEQUIOMÉTRICO
CON LA CANTIDAD DE GLUCOSA
Y SE MIDE MEDIANTE EL
AUMENTO EN ABOSROBANCIA A
334, 340 Ó 365 nm.
INVERSIÓN ENZIMÁTICA.

 A pH DE 4.6 LA SACAROSA ES
HIDROLIZADA POR LA ENZIMA ß-
FRUCTOSIDASA (INVERTASA) A
GLUCOSA Y FRUCTOSA:

ß-FRUCTOSIDASA
SACAROSA + H2O → GLUCOSA + FRUCTOSA
EL CONTENIDO DE GLUCOSA ES
CALCULADO DE LA DIFERENCIA DE
CONCENTRACIONES DE GLUCOSA
ANTES Y DESPUÉS DE LA INVERSIÓN
ENZIMÁTICA
CROMATOGRAFÍA DE GASES

 FUNDAMENTO
LOS AZÚCARES SON
COMPUESTOS POLIHIDROXI
UNIDOS FUERTEMENTE POR
HIDRÓGENO YA SEA A AGUA
O A ELLOS MISMOS EN
CRISTALES. POR TANTO,
TIENEN PUNTOS DE FUSIÓN
MUY ALTOS (200-300°C)
 CROMATOGRAFÍA DE GASES
FUNDAMENTO

LOS AZÚCARES SE PUEDEN

CONVERTIR EN DERIVADOS
VOLÁTILES POR MÉTODOS DE UN
PASO ANTES DE SER SUJETOS A
ANÁLISIS POR CG. LOS MÁS
CONVENIENTES PARECEN SER:
ACETATOS DE ALDITOL, METIL
ÉTERES, Y TRIMETISILIL ÉTERES.
 CROMATOGRAFÍA DE GASES
FUNDAMENTO
 LA ALTA TEMPERATURA PUEDE
OCASIONAR LA DEGRADACIÓN
TÉRMICA DE LOS AZÚCARES,
PARTICULARMENTE LA PÉRDIDA DE
AGUA PARA FORMAR DERIVADOS
ANHIDRO.

 LOS TRIMEISILIL ÉTERES TIENEN LA

VENTAJA DE LA COMBINACIÓN DE
ESTABILIDAD Y VOLATILIDAD QUE
PERMITEN LA DETERMINACIÓN POR CG
DE OLIGOSACÁRIDOS DE HASTA 7
CARBONOS
 CROMATOGRAFÍA DE GASES
PROCEDIMIENTO
 SE PREPARAN DERIVADOS VOLÁTILES
DE CARBOHIDRATOS

 SE INYECTAN EN LA COLUMNA
CALIENTE DEL CG

 LOS DERIVADOS VOLÁTILES PASAN A

DIFERENTES VELOCIDADES A TRAVÉS
DE LA COLUMNA CON UNA
CORRIENTE LEVE DE GAS
ACARREADOR
 CROMATOGRAFÍA DE GASES
PROCEDIMIENTO

 LOS COMPONENTES SEPARADOS

ALCANZAN EL FINAL DE LA
COLUMNA Y EL DETECTOR.

 LA SEÑAL GENERADA POR EL

DETECTOR CONDUCE A LA PLUMILLA
DE LA CARTA REGISTRADORA A
OBTENER UN PICO PROPORCIONAL A
LA CONCENTRACIÓN DE LA
SUBSTANCIA.
 MÉTODOS FÍSICOS
DENSIMETRÍA

 FUNDAMENTO

LA GRAVEDAD ESPECÍFICA DE UNA

SOLUCIÓN DE AZÚCAR ES UNA FUNCIÓN DE
LA CONCENTRACIÓN DE SOLUTO A UNA
TEMPERATURA DEFINIDA. LA PRESENCIA DE
OTROS MATERIALES SOLUBLES AFECTA LA
GRAVEDAD ESPECÍFICA DE LA SOLUCIÓN,
PERO ESTE MÉTODO PROPORCIONA UNA
APROXIMACIÓN A LA CANTIDAD DE AZÚCAR
PRESENTE EN SOLUCIONES DE AZÚCAR
RELATIVAMENTE PURA
 DETERMINACIÓN POR
DENSITOMETRÍA

 EL INSTRUMENTO DE MEDICIÓN
ES UN HIGRÓMETRO (TAMBIÉN
UTILIZADO PARA MEDIR SÓLIDOS
SOLUBLES TOTALES).

 SE HA DISEÑADO UN
HIGRÓMETRO ESPECIAL PARA
LEER EL % DE AZÚCAR
DIRECTAMENTE A 20°C (GRADOS
BRIX).
 ÍNDICE DE REFRACCIÓN
FUNDAMENTO

 EL ÍNDICE DE REFRACCIÓN DE
UNA SOLUCIÓN DE AZÚCAR ES
UNA MEDIDA DE SU
CONCENTRACIÓN.

 LAS SOLUCIONES DE DIFERENTES

AZÚCARES DE IGUAL
CONCENTRACIÓN TIENEN
APROXIMADAMENTE EL MISMO
ÍNDICE DE REFRACCIÓN
 ÍNDICE DE REFRACCIÓN
PROCEDIMIENTO
 SE DETERMINA EL ÍNDICE DE
REFRACCIÓN DE LA SOLUCIÓN
AZUCARADA A 20°C MEDIANTE UN
REFRACTÓMETRO ABBÉ O UN
REFRACTÓMETRO MANUAL.

 SE OBTIENE POR LECTURA DIRECTA EL

% DE SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES
(COMO SACAROSA) DE UNA TABLA DE
ÍNDICES DE REFRACCIÓN A % DE
SACAROSA COMO FACTORES DE
CORRECCIÓN.
 POLARIMETRÍA
FUNDAMENTO
 LA RADIACIÓN SE COMPORTA COMO SI
TUVIERA UN COMPONENTE ELÉCTRICO
Y UNO MAGNÉTICO. ACTÚAN COMO SI
ESTUVIERAN DISPUESTOS EN ÁNGULOS
RECTOS UNO CON RESPECTO AL OTRO.

 HAY MILLONES DE RAYOS QUE

PROVIENEN DE LA FUENTE LUMINOSA.

 LA DIRECCIÓN DE LOS COMPONENTES

ELÉCTRICOS Y MAGNÉTICOS ES
PURAMENTE ALEATORIA, ASÍ QUE SE
TIENE RADIACIÓN NO POLARIZADA.
 POLARIMETRÍA
FUNDAMENTO

 SI SE PUEDE HACER QUE TODOS

LOS RAYOS TENGAN ORIENTADOS
SUS COMPONENTES ELÉCTRICOS
Y MAGNÉTICOS EN LA MISMA
DIRECCIÓN, LA RADIACIÓN SERÁ
POLARIZADA EN PLANO. ESTO SE
PUEDE LOGRAR MEDIANTE EL
USO DE UN FILTRO
POLARIZADOR.
 POLARIMETRÍA
FUNDAMENTO

 CUANDO LA LUZ POLARIZADA BRILLA

EN UNA MOLÉCULA ASIMÉTRICA (UN
COMPUESTO QUE NO PUEDE
PRODUCIR UNA IMAGEN AL ESPEJO).

 LA LUZ ES ROTADA. ESTO ES

LLAMADO “COMPUESTO
ÓPTICAMENTE ACTIVO” (e.g.
GLUCOSA).

 SI UN COMPUESTO TIENE SIMETRÍA LA

LUZ POLARIZADA NO SERÁ
AFECTADA.
 POLARIMETRÍA
FUNDAMENTO

 EL SEGUNDO FILTRO ES ROTADO

MANUALMENTE PARA
COMPAGINAR VISUALMENTE LOS
MATICES DE UN COLOR. ESTO ROTA
AL RAYO DE LUZ POLARIZADA DE
REGRESO A SU POSICIÓN
ORIGINAL.

 SE MIDE EL GRADO DE ROTACIÓN

REQUERIDO.
 MAGNITUD DE LA
ROTACIÓN
DEPENDIENTE DE:

 LA LONGITUD DE ONDA DE LA LUZ

UTILIZADA.
 LONGITUD DE LA CELDA

 NATURALEZA DE LA SUBSTANCIA
ACTIVA Y SU CONCENTRACIÓN
 TEMPERATURA
 POLARÍMETROS vs
SACARÍMETROS

 POLARÍMETRO: USA LUZ

MONOCROMÁTICA Y LEE EN
GRADOS ANGULARES (SE DEBE
RELACIONAR CON LA
CONCENTRACIÓN DE AZÚCAR).

 SACARÍMETRO: USA LUZ BLANCA

Y LEE LA CONCENTRACIÓN DE
AZÚCAR DIRECTA.
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS
MÉTODOS

 SE UTILIZAN ESTOS MÉTODOS

PARA LA PRODUCCIÓN DE
ALIMENTOS O INGREDIENTES
DE LOS MISMOS.

 PARA PURIFICAR UNA

PROTEÍNA DE UN ALIMENTO
PARA POSTERIOR ESTUDIO EN
EL LABORATORIO.
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS
FUNDAMENTO GENERAL
 LOS MÉTODOS DE SEPARACIÓN DE
PROTEÍNAS EXPLOTAN LAS
DIFERENCIAS BIOQUÍMICAS EN LA
SOLUBILIDAD DE LAS MISMAS, SU
TAMAÑO, CARGA, CARACTERÍSTICAS
DE ADSORCIÓN, AFINIDAD
BIOLÓGICA POR OTRAS MOLÉCULAS.

 LAS TÉCNICAS SE UTILIZAN PARA

PURIFICAR PROTEÍNAS
INDIVIDUALES A PARTIR DE
MEZCLAS COMPLEJAS.
CONSIDERACIONES GENERALES

 ANTES DE EMPEZAR UNA SECUENCIA

DE SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS PARA
SU PURIFICACIÓN SE DEBE CONOCER:
SU PESO MOLECULAR, SU PUNTO
ISOELÉCTRICO, SUS PROPIEDADES DE
SOLUBILIDAD, SU TEMPERATURA DE
DESNATURALIZACIÓN, ALGUNA
CARACTERÍSTICA QUE LA DISTINGA
DE LAS DEMÁS PROTEÍNAS.
MÉTODOS DE PURIFICACIÓN DE
PROTEÍNAS

 LOS MÁS COMÚNES SON:

PRECIPITACIÓN
CROMATOGRAFÍA DE
INTERCAMBIO IÓNICO
CROMATOGRAFÍA DE AFINIDAD
CROMATOGRAFÍA DE EXCLUSIÓN
DE TAMAÑO
 SEPARACIÓN POR
CARACTERÍSTICAS DE
SOLUBILIDAD DIFERENCIAL
 FUNDAMENTO
LA SEPARACIÓN POR PRECIPITACIÓN
EXPLOTA LAS DIVERSAS DIFERENCIAS
EN SOLUBILIDAD DE LAS PROTEÍNAS
EN SOLUCIÓN.

LAS PROTEÍNAS SON

POLIELECTROLITOS Y SUS
CARACTERÍSTICAS DE SOLUBILIDAD
ESTÁN DETERMINADAS POR EL TIPO Y
CARGA DE AMINO ÁCIDOS EN LA
MOLÉCULA.
PRECIPITACIÓN DIFERENCIAL
DE LAS PROTEÍNAS

 CAMBIANDO EL pH DEL
BUFFER
 FUERZA IÓNICA

 CONSTANTE DIELÉCTRICA

 TEMPERATURA
 PROCEDIMIENTOS
 SALADO (SALTING OUT)
LAS PROTEÍNAS TIENEN
PERFILES DE SOLUBILIDAD
ÚNICOS EN SOLUCIONES DE
SAL NEUTRAS.

LAS BAJAS
CONCENTRACIONES DE SALES
NEUTRAS AUMENTAN LA
SOLUBILIDAD DE LAS
PROTEÍNAS.
 SALADO (SALTING OUT)
FUNDAMENTO
 SI SE AUMENTA LA FUERZA
IÓNICA DE LA SOLUCIÓN LAS
PROTEÍNAS SE PRECIPITAN.

 ESTE ES UNO DE LOS

PRIMEROS PASOS DE
SEPARACIÓN DE PROTEÍNAS.
ÉSTAS SE PUEDEN SEPARAR DE
UNA MEZCLA MUY COMPLEJA
CON ESTE MÉTODO.
 SALADO (SALTING OUT)
REACTIVOS

SULFATO DE AMONIO [(NH4)2SO4].

SE USA COMÚNMENTE DEBIDO A
QUE ES ALTAMENTE SOLUBLE.

 TAMBIÉN SE PUEDEN USAR: NaCl,

O KCl.
 PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA
FUNDAMENTO

 PUNTO ISOELÉCTRICO (pI). DEFINIDO

COMO EL pH AL QUE UNA PROTEÍNA
NO TIENE CARGA NETA EN SOLUCIÓN.

 LAS PROTEÍNAS SE AGREGAN Y

PRECIPITAN EN SU pI DEBIDO A QUE
NO EXISTE REPULSIÓN
ELECTROSTÁTICA ENTRE MOLÉCULAS.
PRECIPITACIÓN ISOELÉCTRICA
FUNDAMENTO

 LAS PROTEÍNAS TIENEN

DIFERENTES pI’S, POR TANTO,
PUEDEN SER SEPARADAS
AJUSTANDO EL pH DE LA
SOLUCIÓN.

 CUANDO SE AJUSTA EL pH DE UNA

SOLUCIÓN AL pI DE UNA PROTEÍNA
ÉSTA PRECIPITA. SI LAS DEMÁS
PROTEÍNAS TIENEN OTROS pI’S
ÉSTAS PERMANECERÁN EN
SOLUCIÓN
PRECIPITACIÓN DE PROTEÍNAS
POR TAMAÑO

 FUNDAMENTO
LOS PESOS MOLECULARES DE LAS
PROTEÍNAS SON DE 10 000 A MÁS DE
1 000 000. POR TANTO, EL TAMAÑO ES UN
PARÁMETRO A EXPLOTAR PARA SU
SEPARACIÓN.

LA SEPARACIÓN REAL OCURRE BASADA EN

EL LLAMADO RADIO DE STOKES, EL CUAL
ES EL RADIO PROMEDIO DE LA PROTEÍNA
EN SOLUCIÓN Y ES DETERMINADO POR LA
CONFORMACIÓN DE LA PROTEÍNA.
 LEY DE STOKES

Es la fuerza de fricción

experimentada por objetos
esféricos moviéndose en el
seno de un fluido viscoso.
La velocidad de los
movimientos de dichos
objetos es baja.
 PROCEDIMIENTOS
DIÁLISIS
 FUNDAMENTO

SE UTILIZA PARA SEPARAR

MOLÉCULAS EN SOLUCIÓN
MEDIANTE EL USO DE
MEMBRANAS
SEMIPERMEABLES QUE
PERMITEN EL PASO DE
PEQUEÑAS MOLÉCULAS
PERO NO DE LAS GRANDES.
 DIÁLISIS
PROCEDIMIENTO

 LA SOLUCIÓN PROTÉICA ES COLOCADA EN

UN TUBO O BOLSA DE DIÁLISIS QUE SE
AMARRA O SUJETA POR UN EXTREMO.

 EL OTRO EXTREMO SE SELLA O AMARRA UNA

VEZ QUE SE HA COLOCADO LA MUESTRA Y
SE COLOCA EL TUBO O BOLSA EN UN GRAN
VOLUMEN DE AGUA O BUFFER
(GENERALMENTE 500 A 1000 VECES MÁS
GRANDE QUE LA CANTIDAD DE MUESTRA EN
EL TUBO O BOLSA DE DIÁLISIS).
 DIÁLISIS
FUNDAMENTO

 LOS SOLUTOS DE BAJO PESO MOLECULAR

DIFUNDEN FUERA DEL TUBO DE DIÁLISIS.

 EL BUFFER O AGUA DIFUNDE HACIA

ADENTRO DEL TUBO.

 LA SOLUCIÓN PROTÉICA DE ADENTRO DEL

TUBO A MENUDO ES DILUIDA DURANTE LA
DIÁLISIS DEBIDO A DIFERENCIAS EN FUERZA
OSMÓTICA ENTRE LA SOLUCIÓN Y EL AGUA
O BUFFER DE LA DIÁLISIS
 APLICACIONES DEL MÉTODO
DE DIÁLISIS
 SE PUEDE UTILIZAR ESTE MÉTODO
PARA CONCENTRAR PROTEÍNA
ENVOLVIENDO LA BOLSA DE DIÁLISIS
CON POLIETILENGLICOL, EL CUAL
ABSORBE AGUA Y CONCENTRA LA
SOLUCIÓN DENTRO DE LA BOLSA DE
DIÁLISIS.

 EL EQUILIBRIO DE LA DIÁLISIS SE
PUEDE USAR PARA DETERMINAR LA
ESTEQUIOMETRÍA DE LA UNIÓN
PROTEÍNA-LIGANDO.
 GELIFICACIÓN DE LAS
PROTEÍNAS

 CASO DE LA CASEÍNA DE LA
LECHE

 FUNDAMENTO

EL QUESO ES LA CUAJADA DE
LA LECHE, BÁSICAMENTE UN GEL
DE CASEÍNA .
FORMACIÓN DE LA CUAJADA

 SE BASA EN LA ACIDIFICACIÓN DE
LA LECHE MEDIANTE ENZIMAS
PROTEOLÍTICAS.

 LAS ENZIMAS ACTÚAN EN UN

RANGO ÓPTIMO DE 36-39ºC.

 SE SUELEN UTILIZAR UNA MEZCLA

DE QUIMOSINA Y PEPSINA DE
CERDO CON UNA ENZIMA
COAGULADORA OBTENIDA DE UN
HONGO.
FORMACIÓN DE LA CUAJADA
 LA ENZIMA INICIA EL PRIMER PASO
EN LA CONVERSIÓN DE LAS
MICELAS DE FOSFOCASEINATO DE
CALCIO DISPERSAS EN FORMA
COLOIDAL EN EL QUESO.

 LAS MICELAS DE CASEÍNA EN LA

LECHE PUEDEN DESESTABILIZARSE
POR LA ENZIMA QUIMOSINA. ÉSTA
ES EL INGREDIENTE ACTIVO EN LAS
GOTAS O TABLETAS DE CUAJO.
 EFECTOS DE LA QUIMOSINA
EN LA FORMACIÓN DEL QUESO

 LA QUIMOSINA ES RESPONSABLE DE LA
PRIMERA ETAPA EN LA COAGULACIÓN DE
LA LECHE.

 CAUSA LA DIVISIÓN DE UN ENLACE

ESPECÍFICO, EL ENLACE PEPTÍDICO DE
FENIL-ALANINA-METIONINA.

 ROMPE LA PORCIÓN ÁCIDA RICA EN

CARBOHIDRATOS DE LA MOLÉCULA DEL
RESTO HIDROFÓBICO PRIMARIO O para-k-
CASEÍNA.
EFECTOS DE LA QUIMOSINA
EN LA FORMACIÓN DEL QUESO

 CON LA PÉRDIDA DE LA PORCIÓN

ÁCIDA DE LA MOLÉCULA, EL RESTO
DE LA k-CASEÍNA YA NO ESTABILIZA
LAS MICELAS. ÉSTAS SE APROXIMAN
UNAS A OTRAS Y SE UNEN,
PROBABLEMENTE POR ENLACES
HIDROFÓBICOS Y FORMAN UNA RED
TRIDIMENSIONAL QUE ATRAPA LA
FASE ACUOSA DE LA LECHE.
EFECTOS DE LA QUIMOSINA
EN LA FORMACIÓN DEL QUESO

 LA QUIMOSINA NO DESPLAZA AL
CALCIO DE LA MICELA. EL COAGULO
DE LA LECHE FORMADO POR LA
ACCIÓN DEL CUAJO ES EL
FOSOFOCASEINATO DE CALCIO.

 EL GEL FORMADO POR EL CUAJO ES

FIRME, ELÁSTICO.
 TEMPERATURA ÓPTIMA DE
FORMACIÓN DE LA CUAJADA

 39-40ºC

LA LECHE NO DEBE

SOBRECALENTARSE ANTES DE AÑADIR
EL CUAJO DEBIDO A QUE SI SE FORMA
GEL ÉSTE SERÁ DÉBIL DEBIDO, EN
PARTE, A UN COMPLEJO INDUCIDO
POR EL CALOR ENTRE LA
β-LACTOGLOBULINA Y LA k-CASEÍNA.
ÉSTA ÚLTIMA SE HACE RESISTENTE AL
EFECTO DE LA QUIMOSINA.