Biología sintética

La Biología sintética se define como la síntesis de

biomoléculas o ingeniería de sistemas biológicos con
funciones nuevas que no se encuentran en la naturaleza.

Se trata de una disciplina que, a diferencia de otras, no se

basa en el estudio de la biología de los seres vivos, sino que
posee como objetivo el diseño de sistemas biológicos que no
existen en la naturaleza.

La Biología Sintética busca la creación de nuevos organismos

programables, es decir, la creación de microorganismos a la
carta que se comporten como pequeños ordenadores.
• diseño y fabricación de componentes y sistemas biológicos que no existen
en la naturaleza

• técnicas que permiten introducir modificaciones en los diseños de los

sistemas biológicos ya existentes.

• El objetivo final es la creación de nuevos organismos capaces de responder a

determinados estímulos de una forma programada, controlada y fiable.

• Esto es posible mediante la introducción de secuencias de ADN que

codifican nuevos ya sean estos procedentes de virus, otras bacterias o
humanos.

• Estos nuevos genes y las nuevas regulaciones genéticas asociadas a ellos son
capaces de inducir nuevos comportamientos (funciones) en las células que
los reciben, permitiendo su reprogramación.
 Biología sintética
• Circuitos genéticos (basada en la ingeniería
genética, pero utilizando principios de
ingeniería reales)
• Genomas mínimos (o células mínimas)
• Protocélulas (o células sintéticas)
• La biología sintética química (o xenobiología)
• La síntesis de ADN (o la genómica sintética)
El operon Lac. Arriba:Reprimido, Abajo:Activo.

1: RNA Polimerasa, 2: Represor, 3: Promotor, 4: Operador, 5: Lactosa, 6: lacZ, 7: lacY, 8:

lacA.
La lógica «O»:
Si la señal A o B están presentes, entonces resultará en el producto génico
deseado. Todos los promotores que se muestran son inducibles. Cualquier señal
es capaz de activar la expresión de salida del producto del gen, y sólo se requiere
la acción de un único promotor para la expresión génica. Los Mecanismos de
regulación post-transcripcional pueden evitar la presencia de ambas entradas
produciendo una salida alta, tal como la implementación de un sitio de unión de
baja afinidad al ribosoma.
La lógica «Y».
Si la señal A y la señal B están presentes, entonces resultará en el producto génico
deseado. Todos los promotores mostrados son inducibles, activados por el producto del
gen. Cada señal activa la expresión de un gen por separado (en azul claro). Las proteínas
expresadas entonces, pueden o bien formar un complejo completo en el citosol, que es
capaz de activar la expresión de salida (como se muestra en la figura), o pueden actuar
por separado para inducir la expresión, tales como remover por separado una proteína
inhibidora e inducir la desinhibición del promotor.
La lógica Negativa «Y»:
Si la señal A y la señal B están presentes, entonces el producto génico deseado no dará lugar.
Todos los promotores mostrados son inducible. El promotor activo para el producto del gen
es constitutivo, y por lo tanto no se muestra. El promotor constitutivo para el producto del
gen lo mantiene «encendido" y sólo se desactiva cuando (similar a la lógica «Y») un
complejo resultante de dos señales de entrada para productos génicos bloquean la
expresión del gen de salida.
 En busca del
GENOMA MÍNIMO
El concepto de genoma mínimo

Genoma mínimo (Koonin, 2000):

Grupo más pequeño de genes que debe ser suficiente para mantener
en funcionamiento una forma de vida en las condiciones más
favorables imaginables
• en presencia de todos los nutrientes esenciales
• en ausencia de estrés ambiental

– Funciones esenciales:
• mantenimiento de estructuras celulares
• Reproducción
• evolución
El poder de la genómica comparativa
•Mushegiany Koonin, 1996

• Haemophilus influenzae (G-, 1703 genes codificantes de proteínas)

Mycoplasma genitalium (G+, 470 genes codificantes de proteínas)

• Conjunto mínimo de genes: 256 genes

Si aumentamos el número de genomas utilizados en la comparación podemos

disminuir significativamente el número de genes considerados como esenciales

Pero...•Hutchison et al.,1999
• Mutagénesis global (Tn) sobre M. genitalium y M. pneumoniae

Muchos genes presentes en el “conjunto mínimo” pueden ser interrumpidos

 Comparación con M. genitalium
Cinco endosimbiontes vs Mycoplasma genitalium

281 genes codificantes de proteínas comunes

96 genes de endosimbiosis 185 genes “housekeeping”

Las aproximaciones experimentales
Tres formas de identificar genes esenciales bajo unas determinadas condiciones de
cultivo:

• Mutagénesis masiva con transposones

􀂾 genes no esenciales que reducen el crecimiento
􀂾 genes esenciales que toleran inserciones

• RNA antisentido
􀂾 sólo válido si hay una expresión adecuada del RNA antisentido

• Inactivación sistemática de cada gen individual

􀂾 genes esenciales redundantes
􀂾 genes no dispensables simultáneamente
¿Y si las juntamos?

1. Comparación de genomas reducidos

• además el genoma de Phytoplasma asteris

2. Datos experimentales
a) M. genitalium y M. pneumoniae (mutagénesis masiva, HutchisonIII et al., 1999)
b) Bacillus subtilis (inactivación sistemática, Kobayashiet al., 2003)
b) Escherichia coli (mutagénesis masiva, Gerdeset al., 2003)
c) Staphylococcus aureus (RNA antisentido, Forsythet al., 2002)

3. Revisar el sistema metabólico

• Rutas alternativas
• Rutas incompletas
• Homeostasis metabólica
 Células artificiales

Celular estándar artificial (arriba) y la célula artificial de

administración de fármacos (abajo)
Representative types of artificial cell
membranes

Schematic representation of encapsulated cells

within artificial membrane
Registry of Parts.
Se trata de una colección de cientos de piezas
biológicas que pueden ser ensambladas
siguiendo un procedimiento estándar para la
creación de nuevos dispositivos.

Multitud de grupos investigadores de todo el

mundo utilizan esta colección de piezas en sus
investigaciones, a la que a su vez contribuyen con
nuevas aportaciones, en un ejemplo de
cooperación científica internacional.
 Tecnologías de Biología sintética
Expansión del código genético
• El ADN está compuesto por 4 pares de bases nucleotídicas:
A (adenina), T (timina), C (citosina) y G (guanina).

• Mediante un proceso denominado "Transcripción" las

bases nucleotídicas del ADN se transforman en ARN, que a
su vez está compuesto por A (adenina), C (citosina), G
(guanina) y U (uracilo) en lugar de timina.

• A continuación tiene lugar la "Traducción" de ARN a

proteínas. En este proceso, mediante combinaciones de 4
bases nucleotídicas del ARN se obtienen 64 posibles
combinaciones de tres bases llamadas codones, que son
específicos de un aminoácido. 61 de estos codones se
corresponden con los 20 aminoácidos naturales,
• Debido a que existen duplicaciones que provocan que
más de un codón codifique para un mismo aminoácido.

• Los otros tres codones restantes se denominan codones

de terminación y constituyen señales de terminación
que interrumpen la síntesis de proteínas.

• Los primeros pasos en el diseño de nuevas formas de

vida consisten en el diseño de microorganismos que
utilizan un código genético diferente al que actualmente
emplean todas las formas de vida existentes en la tierra.

• Mediante la introducción de nuevas unidades sintéticas

en su ADN, estos organismos poseerían proteínas
sintéticas.
Circuitos genéticos
• El circuito genético consiste en un conjunto de genes que participan en la
digestión de la lactosa en la bacteria E. coli. Un gen regulador denominado
represor se encuentra normalmente encendido, manteniendo el metabolismo
de la digestión de la lactosa inactivo. Cuando la lactosa está presente en el
medio, la bacteria apaga el represor.

• Los circuitos genéticos formados por genes y sus reguladores se comportan de

forma equivalente a circuitos electrónicos realizando operaciones Booleanas o
lógicas.

• En concreto, los circuitos genéticos se describen mediante diagramas

semejantes a los que se emplean en los circuitos eléctricos, con nodos que
representan a determinados genes y flechas que indican otros genes a los que
regulan los primeros.

• La activación de estos genes oscila entre los estados de encendido y apagado a

medida que la señal se propaga por el circuito, produciendo a su vez
oscilaciones periódicas en la concentración de las proteínas que codifican. La
arquitectura de estos circuitos es cíclica y en ellos cada gen inhibe al siguiente
y es inhibido por el anterior, razón por la cual a este tipo de circuitos se les
denomina osciladores
Evolución dirigida
• El diseño de circuitos genéticos se realizaba en sus comienzos
por medio de estrategias combinatorias en las cuales los
componentes individuales del circuito se ensamblaban in vitro,
y posteriormente se introducían en una célula para observar su
comportamiento.

• Un método alternativo que no necesita de un conocimiento

previo acerca de los detalles de la función del circuito es la
evolución dirigida.

• Este es un proceso que se aprovecha de la habilidad de las

células para sobrevivir frente a una presión selectiva.

• Una de las técnicas que emplea esta estrategia es el

denominado “DNA shuffling” o “molecular breeding”.
• El DNA shuffling consiste en la recombinación de secuencias
múltiples de ADN para crear librerías de genes quiméricos.

• Los genes quiméricos posteriormente se insertan en vectores

de expresión y se transfieren a una célula huésped, con el
objetivo de seleccionar aquellas secuencias quiméricas que
posean las características deseadas.

• La principal ventaja de esta técnica radica en que permite

diseñar circuitos complejos que posean múltiples interacciones
entre sí.

• Esta estrategia ha sido empleada en el diseño de redes

sintéticas a partir de mutaciones conocidas, que
posteriormente se mejoran mediante evolución dirigida.
Ingeniería genética in silico
• Hasta la fecha, se ha conseguido diseñar circuitos
genéticos simples empleando diversas estrategias in
vivo tales como la expansión del código genético, la
evolución dirigida o la identificación y síntesis de
genomas mínimos.

• Sin embargo, el principal factor limitante de estas

estrategias radica en la imposibilidad de predecir el
comportamiento de un circuito en su medio natural.

• La verdadera biología sintética tiene como objetivo la

construcción de modelos que puedan predecir de
forma precisa cómo se comportaría este circuito
genético en el interior de las células.
• Las células están sujetas a cambios constantes que
incluyen estrés del medio y mutaciones genéticas
que afectan a su habilidad para crecer y propagarse.

• Las simulaciones realizadas mediante Ingeniería

Genética in silico, deben tener en cuenta este tipo de
circunstancias para dotar de realismo a los modelos
que se creen.

• Las simulaciones por ordenador son una herramienta

básica de la biología sintética, siempre y cuando
mantengan los principios de estandarización de los
componentes del modelo y optimización de los
circuitos diseñados.
Un chip de ADN (del inglés DNA microarray) es una superficie sólida a la cual se une
una colección de fragmentos de ADN. Las superficies empleadas para fijar el ADN
son muy variables y pueden ser de vidrio, plástico e incluso de silicio.
Los chips de ADN se usan para analizar la expresión diferencial de genes,
monitorizándose los niveles de miles de ellos de forma simultánea.
Su funcionamiento consiste, básicamente, en medir el nivel de hibridación entre la
sonda específica (probe, en inglés), y la molécula diana (target), indicándose
generalmente mediante fluorescencia y analizándose por análisis de imagen, lo cual
nos indicará el nivel de expresión del gen.
Complejidad Transcriptómica en una Bacteria de Genoma reducido

Para el estudio de los principios básicos de la organización del transcriptoma en las bacterias,
se analizó uno de los más pequeños organismos auto-replicantes, Mycoplasma pneumoniae.

Combinando matrices con secuencias específicas , complementados con la secuenciación del

transcriptoma, con más de 252 puntos matrices .

Se detectaron 117 transcripciones no descritos con anterioridad, en su mayoría

transcripciones no codificantes, 89 de ellos en la configuración antisentido de genes
conocidos.

Se identificaron 341 operones, de los cuales 139 son policistrónicos, casi la mitad de este
último de expresión decadente de una manera similar a una escalera.

Bajo condiciones distintas, los operones se podrían dividir en 447 unidades de transcripción
más pequeñas, resultando en muchas transcriptos alternativos.

Estas Transcripciones frecuentes antisentido, transcripciones alternativas, y múltiples

reguladores por gen implican un transcriptoma muy dinámico, más parecido de lo que se
pensaba a la de los eucariotas.
Genoma mínimo
• Para lograr construir microorganismos artificiales es necesario un requisito
previo, identificar la configuración mínima de genes necesarios para permitir
a las células artificiales replicarse de manera autónoma, es decir, su genoma
mínimo teórico.

• Estos hasta ahora hipotéticos microorganismos podrían derivarse de

microorganismos naturales con una mínima colección de genes
(microorganismos mínimos) o podrían ser generados de un modo totalmente
sintético usando un grupo de genes esenciales (microorganismos sintéticos).

• El proceso necesario para identificar el genoma mínimo de los

microorganismos sintéticos se puede realizar por diversos métodos, que van
desde la identificación de genes esenciales por mutagénesis hasta el análisis
de homología de secuencias génicas mediante herramientas bioinformáticas.

• Una tercera alternativa consiste en el estudio de sistemas biológicos que, de

forma natural, han experimentado una reducción de su material genético.
Genoma-Célula Mínima

485 genes codificantes

Experimentos
de mutagénesis
con transposones

100 genes no esenciales

Genoma mínimo de una bacteria
Mycoplasma genitalium tiene el genoma más pequeño de organismo que se puede
cultivar en cultivo puro.

Tiene un metabolismo mínimo y poca redundancia genómica. En consecuencia, se espera

que su genoma para ser una buena aproximación para el conjunto mínimo de genes
necesarios para sostener la vida bacteriana.

Con el uso de mutagénesis global con transposones, hemos aislado y caracterizado

mutantes con interrupción génica en 100 diferentes genes codificadores de proteínas no
esenciales.

No se interrumpieron ninguno de los 43 genes de codificación de ARN.

Con esto, identificamos 382 de los 482 genes codificadores de proteínas esenciales de M.
genitalium , además de cinco conjuntos de genes alterados que codifican proteínas con
funciones esenciales potencialmente redundantes, como el transporte de fosfato.

Los genes que codifican proteínas de función desconocida constituyen el 28% de los genes
codificantes de proteínas esenciales establecidas. La alteración de algunos genes aceleró
el crecimiento de M. genitalium.
Genoma-Célula Mínima
Genoma-Célula Mínima
Hemos sintetizado 582.970 pares de bases de genoma de Mycoplasma genitalium.

Este genoma sintético, llamado M. genitalium JCVI-1.0, contiene todos los genes del tipo
salvaje M. genitalium G37 excepto MG408, que fue interrumpido por un marcador de
antibióticos para bloquear la patogenicidad y para permitir la selección.

Para identificar el genoma sintético, insertamos "marcas " en los sitios intergénicos
conocidos que toleran inserciones de transposones.

Se ensamblaron "Cassettes" de 5-7 kilobases (kb) superpuestos, obtenidos a partir de

oligonucleótidos sintetizados químicamente, que se unieron por recombinación in vitro
para producir ensamblajes intermedios de aproximadamente 24 kb, 72 kb ("1/8 genoma"),
y 144 kb (" cuarto genoma "), todas las cuales fueron clonados como cromosomas
artificiales bacterianos en Escherichia coli. La mayoría de estos clones intermedios se
secuenciaron, y se identificaron los clones de todos los cuatro cuarto genomas con la
secuencia correcta.

El genoma sintético completo fue ensamblado por clonación mediante recombinación

asociada a transformación en la levadura Saccharomyces cerevisiae, luego aislada y
secuenciada. Se identificó un clon con la secuencia correcta.

Los métodos descritos aquí serán útiles para la construcción de grandes moléculas de ADN
a partir de piezas sintetizados químicamente y también a partir de combinaciones de
segmentos de ADN naturales y sintéticos.
 Genoma-Célula Mínima

Sólo se habian sintetizado genomas de virus.

Mycoplasma genitalium: bacteria con el genoma más pequeña de las que se han
conseguido hacer crecer en cultivo puro. (582.970bp)

Aproximadamente 100 de sus 485 de sus genes son no esenciales en condiciones

óptimas de crecimiento en el laboratorio.

No se sabe si todos estos genes pueden ser eliminados simultáneamente.

Proponen la producción de genomas reducidos de forma sintética, introducirlos en

células y ver si son viables.
 Genoma-Célula Mínima

Synthetic DNA cassetes: 5-7Kb

El método seguido para «edificar» por completo el cromosoma a
partir de elementos químicos arrancó con la síntesis de cada uno de
los nucleótidos por métodos estandarizados.

Con ellos, se sintetizaron después fragmentos de ADN denominados

cassettes, de entre 5 y 7 kb (kilobases o miles de pares de bases),
que luego eran ensamblados por medio de oligonucleótidos en
cassettes más largos, de 24 kb, de 72 kb -equivalentes a un octavo
del genoma- y finalmente de 144 kb; es decir, 144.000 pares de
bases, un cuarto del genoma completo.

Los cuatro segmentos obtenidos fueron clonados por separado,

ensamblados sobre la célula de una bacteria del tipo Escherichia
coli. Identificados en cada paso del proceso por medio de los
marcadores de tinta, los cuatro cuartos del genoma debían ser
ensamblados ahora en un cromosoma completo.
Genoma-Célula Mínima
Genoma-Célula Mínima
 ·APLICACIONES
Medicina
Fármacos inteligentes
Medicina personalizada
Terapia génica
Reparación y regeneración de tejidos
Reprogramación celular
Síntesis de fármacos

· Energía
Producción de hidrógeno
Biocombustibles
Pilas de combustible
· Alimentación
· Medio ambiente
Explotación de minas · Materiales
Bioremediación
Biosensores
· Nuevos tejidos

Etc…
 Biología sintética-Biología de sistemas

Establecer una jerarquía

Establecer límites

Reducir complejidad

Determinar conexiones

Estandarización
 Biología sintética: proyectos

· Registry of Standard Biological Parts :

Construir una biblioteca de partes que puedan ser usadas

conjuntamente utilizando bioinformática y herramientas de
simulación para producir nuevas funciones.

Registry of Standard Biological Parts  http://parts.mit.edu

Standardized part 1 + Standardized part 2  New function

Registry of Parts.

Se trata de una colección de cientos de piezas

biológicas que pueden ser ensambladas siguiendo un
procedimiento estándar para la creación de nuevos
dispositivos.

Multitud de grupos investigadores de todo el mundo

utilizan esta colección de piezas en sus
investigaciones, a la que a su vez contribuyen con
nuevas aportaciones, en un ejemplo de cooperación
científica internacional.
Biología sintética: proceso

Biotechnol. J. 2006, 1, 690–699

 Biología sintética: técnicas

· ADN recombinante
- Técnicas de clonaje, vectores...

· Síntesis de ADN

· Ingeniería de proteínas
- Diseño racional, evolución dirigida…etc.

· Herramientas bioinformáticas
- Previsión de estructuras, docking, redes…etc.
Biología sintética: ejemplos
· ADN sintético
Biología sintética: ejemplos

· ADN sintético: detección HIV

y hepatitis virus

Elbeik, T. et al. J. Clin. Microbiol. 42, 3120–3127 (2004).

Biología sintética: ejemplos
· Nuevos péptidos catalíticos
Biología sintética: ejemplos
· Artificial riboregulator system

Isaacs FJ et al, Nat Biotechnol 22: 841–847.

Biología sintética: ejemplos

· Protein switch

Prehoda, K. E., Scott, J. A., Mullins, R. D. & Lim, W. A. Science 290, 801–806 (2000).
Biología sintética: ejemplos

· Nuevos receptores

Looger LL et al, Nature 423: 185–190

Biología sintética: ejemplos

· Diseño de mecanismos

Hooshangi et al (2005)
Biología sintética: ejemplos

· Diseño de mecanismos complejos

Biología sintética: ejemplos

· Diseño de mecanismos complejos

Elowitz, M. B. & Leibler, Nature 403, 335–338 (2000)

Biología sintética: ejemplos

· Diseño de vías metabólicas

Martin, V. J, Keasling, J. D. et. al. NatureBiotech. 21, 796–802 (2003).

Biología sintética: ejemplos
· Diseño comunicación intercelular

(You et al., 2004)

Biología sintética: ejemplos
· Diseño comunicación intercelular
Biología sintética: ejemplos
· Diseño comunicación intercelular
 Futuro
· Desarrollo de nuevo software para trabajar con redes complejas.

· Crecimiento de la base de datos de partes.

· SintesiS de DNA / Genomas sintéticos.

· Aparición de ejemplos de aplicación interesantes.

· Es posible que en 10 años seamos capaces de rediseñar totalmente

células.