BIOTECNOLOGIA DE ALIMENTOS

ENZIMOLOGIA Y BIOCATALISIS

Profesor Dr. Pedro Peláez Sánchez

http://pedro-pelaez.blogspot.pe/
pedro.pelaez@unas.edu.pe
2016
 INTRODUCCIÓN A LA ENZIMOLOGÍA
1. Introducción
2. Historia de la Enzimología
3. Descripción general de las enzimas
4. Factores que afectan la actividad enzimática
5. Actividad enzimática
6. Cinética enzimática
7. Nomenclatura - Clasificación
1. INTRODUCCIÓN

* La vida depende de una serie de reacciones

químicas perfectamente organizadas. Sin
embargo, muchas de estas reacciones, por sí
mismas, tienen lugar a una velocidad demasiado
lenta como para dar respuesta a los diversos
procesos vitales
 HISTORIA ENZIMAS

•Catálise biológica  início siglo XIX

– digestión de carne: estomago;
– digestión de almidón: saliva.
•Década de 50
– Louis Pasteur - concluiu que a fermentação do açúcar em
álcool pela levedura era catalisada por “fermentos” = enzimas.
•Eduard Buchner (1897)
– extratos de levedo podiam fermentar o açúcar até álcool;
– enzimas funcionavam mesmo quando removidas da célula
viva.

5
 HISTORIA ENZIMAS
•James Sumner (1926)
– Isolou e cristalizou a urease;
– Cristais eram de proteínas;
– Postulou que “todas as enzimas são proteínas”.

•John Northrop (década 30)

– Cristalizou a pepsina e a tripsina bovinas;

•Década de 50 – séc. XX
– 75 enzimas  isoladas e cristalizadas;
– Ficou evidenciado caráter protéico.

•Atualmente + 2000 enzimas são conhecidas.

6
 ENZIMAS – PROTEÍNA

Classificação proteínas

Proteínas globulares Proteínas fibrosas

Estrutura das proteínas

Primaria Secundaria Terciária Quaternária

ENZIMAS
Proteínas globulares
Estrutura terciária
Proteínas com alto peso
molecular, maioria entre 15 a
1000 Kilo Daltons Unit (KD)
OBS: 1 Dalton = 1 unidade de
peso molecular (AMU)
7
 ENZIMAS – ESTRUTURA

Estrutura Holoenzima
Enzimática

Proteína Cofator

Ribozimas
Apoenzima ou Pode ser:
Apoproteína • íon inorgânico
• molécula orgânica
RNA
Coenzima
Se covalente
Grupo Prostético
8
• La Naturaleza ha diseñado los catalizadores biológicos,
o biocatalizadores.

* Los biocatalizadores pueden

ser de:
- naturaleza proteica:
 enzimas (proteína),
 abzymas (anticuerpos catalíticos),
- naturaleza no-proteica:
 ribozimas (RNAs catalíticos)
* De todos ellos, los más abundantes son las
enzimas.
* Estos biocatalizadores son capaces de acelerar la
velocidad de reacción, varios órdenes de magnitud,

104 – 1018.
 -Veamos algunos ejemplos:
Velocidad Velocidad
sin enzima con enzima
CO2 + H2O  HCO3- + H+ 1 107
(Anhidrasa carbónica)

H2O2  H2O + O2 1 109

(Catalasa)
12
G-1-P  G-6-P 1 10
(Fosfoglucomutasa)
14
Urea + 2H2O  NH4 + 2CO2+
1 10
(Ureasa)

* Este poder catalítico de las enzimas es el que hace

posible que los diferentes procesos vitales, en todas
las formas de vida -desde los virus al hombre-,
tengan lugar de manera eficiente.
 ¿Cuáles son las propiedades especiales de las enzimas que
las hacen catalizadores tan eficientes?

-La respuesta a esta pregunta no es fácil:

* Este es uno de los aspectos, más importantes, de la

Enzimología que intentaremos estudiar a lo largo del curso.

* E intentaremos, siempre cuando sea posible, justificarla a

nivel molecular.

Pero antes, comencemos fijando ciertas ideas, a nivel formal,

tales como definiciones, símbolos, nomenclaturas, etc.
Las enzimas como catalizadores biológicos

Las enzimas son proteínas, producidas por los seres vivos

que tienen capacidad para catalizar con gran eficiencia
procesos muy específicos.
* Los seres vivos tienen enzimas multitud de Enzimas
diferentes
Ej. Escherichia coli 4288 proteínas
2658 (62%) Caracterizadas
1701 (64%) Enzimas
 Eucariotas todavía es superior

Naturaleza proteica de las enzimas, apunta a las cuestiones

básicas de la Enzimología:

- Mecanismo catalítico,
- Especificidad.
- Regulación
Definición de catalizador
* Un catalizador es una sustancia que aumenta la velocidad de una
reacción, sin verse alterada en el proceso global.
* La mayor parte de los catalizadores biológicos (aunque no
todos ellos) son enzimas.
* La sustancia sobre la que actúa una enzima se
denomina sustrato de esa enzima.

-Veamos todo esto en un

ejemplo:
H2O2 ------- H2O + O2
* Esta reacción, aunque fuertemente favorecida
termodinámicamente, es muy lenta, a menos
que sea catalizada.
 Velocidad de Reacción
Sin catalizador 1 100
Con catalizador químico (FeCl3) 1.000 103
En presencia de Hb 1.000.000 106
En presencia de catalasa 1.000.000.000 109

* Este ejemplo nos muestra que la velocidad de una reacción

termodinámicamente favorable depende en gran medida de que exista o
no un catalizador y de la naturaleza del mismo.

* Los catalizadores biológicos, entre ellos las enzimas,

se encuentran entre los más eficaces y específicos que se
conocen.
* En este punto, nos conviene resaltar dos hechos importantes:

1. Un catalizador verdadero, aunque participa en el proceso

de reacción, no se modifica a lo largo de ella.
2. Los catalizadores modifican la velocidad de los procesos,
pero no afectan la posición de equilibrio de una
reacción.

Ya que en el equilibrio:

V1  =  V2
 Factores
•Fatores que Alteram a Atividade
de Enzimas
•Cinética Enzimática
–Michaeliana
–Não-Michaeliana
 Importância Biomédica
Princípio Fundamental da Homeostase
estabelece que
Saúde Normal

Composição do meio interno deve ser mantida dentro

de limites relativamente estreitos

Centenas de reações enzimáticas

Velocidades das reações sejam apropriadas

AlteraçõesPerturbações no equilíbrio homeostático

 Importância Biomédica

• Fatores que alteram a velocidade de

reações enzimáticas:
– concentração das enzimas
– concentração dos substratos
– temperatura
– pH
– presença de inibidores
 Introdução à Cinética
Enzimática
Estudo da velocidade da reação (V): S  P

Quantidade de produto formado

V
Quantidade de substrato transformado

(em unidade de tempo)

Atividade enzimática pode ser medida pela

velocidade da reação catalisada
 Fatores que alteram a atividade
de uma enzima
E + S ES E+P

• Fatores decorrentes da natureza protéica das enzimas

- pH
- temperatura
• Fatores decorrentes da formação do complexo ES
- concentração do substrato
- concentração da enzima
• Presença de inibidores
 Influência do pH do meio sobre a
atividade enzimática
• Mantidas fixas as condições de
-temperatura
-concentração de substrato
-concentração de enzima

pH ótimo pH
 Influência do pH do meio sobre a
atividade enzimática
pH ótimo varia para
diferentes enzimas

a) fosfatase ácida
resíduo de aa envolvido na catálise
aspartato - pH ótimo  4,5

b) fosfatase alcalina
resíduo de aa envolvido na catálise
lisina - pH ótimo  9,5
 Influência do pH do meio sobre a
atividade enzimática
FOSFATASES
RO-PO3-2 + H2O RO-H + HO- PO3-2
Fosfatase alcalina (pH ótimo ~9,5)
Presente em vários tecidos
Fígado -  na concentração na doença hepática obstrutiva
Osso - papel provável na deposição de fosfato de cálcio
 na concentração em distúrbios ósseos
Invasão do osso por câncer de um tumor primário - metástase
 fisiológico durante a adolescência - crescimento ósseo

Fosfatase ácida (pH ótimo ~4,5)

Enzima lisossômica
Carcinoma metastásico de próstata libera  quantidades
desta enzima no sangue
 Influência da temperatura do meio
sobre a atividade enzimática
•Mantidas fixas as condições de
-pH ótimo Temperatura ótima
-concentração de substrato
-concentração de enzima

Ativação
térmica Desnaturação
térmica
 Influência da concentração da enzima
sobre a atividade enzimática

•Mantidas fixas as condições de

- temperatura ótima
- pH ótimo
- [substrato] em excesso

[E]
 Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
•Mantidas fixas as condições de
- temperatura ótima
- pH ótimo
- [enzima]

Cinética de
ordem zero

Cinética de
1a ordem

[S]
 Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
Baixa concentração de substrato

E E S
S + E E E E
P
E E E E E E
+
P

Formação do produto é PROPORCIONAL à

concentração de substrato
Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
3/4 de saturação do centro ativo da enzima

S S S P
E E E E E E P
S + + P
E E E E E E P
S S P
P

Formação do produto é PROPORCIONAL à

concentração de substrato
 Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática

100 % de saturação do centro ativo da enzima

S S S P P
E E E E E E
S P
+ E E + P
S E E E E
S S P P
S
P
P

Formação do produto é PROPORCIONAL

à concentração de substrato
 Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
[Substrato] em excesso

S
S S
E E S S E E P P
S S + E E
S E E E E E E + P P
S S S S P P
P
S S P
S S
S S
S
Velocidade da reação independe da [S] S
Influência da concentração de substrato
sobre a atividade enzimática
Quando a
formação de P for
proporcional à [S] Quando a velocidade
a velocidade da da reação independe
reação é de da [S] a reação é de
1a ORDEM ORDEM ZERO

[S]
 Actividad Enzimática
• Depende também:
– presença e concentração do cofator
– poder catalítico da enzima
• capacidade da enzima de transformar o substrato ligado ao
complexo ES em produto por unidade de tempo
ES  E + P
– afinidade da enzima pelo substrato (Km)
• maior ou menor capacidade da enzima de se ligar ao
substrato
E + S  ES
 Enzimas Poder catalítico
• Capacidade de converter substrato em
produto em unidade de tempo
– QUIMIOTRIPSINA - 1,9 x 102 móis/s
– ANIDRASE CARBÔNICA - 1 x 106móis/s

NÚMERO DE RENOVAÇÃO
(TURNOVER NUMBER)
nº de mols de substrato convertido em
produto por mol de enzima em unidade de
tempo
 Unidades Enzimáticas
• Unidade Internacional
– nº de mols de substrato transformado ou
produto formado por mL de solução por minuto
em pH e temperatura padronizados
UI= M/mL/min ou UI= M mL-1 min-1
• Katal
– nº de mols de substrato transformado ou produto
formado por L por segundo em pH e temperatura
padronizados
K=M/L/s ou K=ML-1 s-1
• Arbitrária
– estabelecida pelo pesquisador
 Enzimas
Poder catalítico

nº de renovação Poder catalítico

Velocidade máxima da reação

 Cinética enzimática
1913
Leonor Michaelis -Enzimologista
Maude Menten - Pediatra

Representaram uma reação

enzimática em 2 etapas
K1 K3
E+S ES E +P
K2 K4

[produto]
K= constante de velocidade=
[substrato]
 Enzimas
Cinética enzimática
K1 K3
E+S ES E +P
K2 K4

Estabilidade do complexo ES pode ser

expressa pela relação entre as velocidades
de dissociação e de formação do complexo

K2+ K3 Específico
Km = para cada
K1
enzima
Enzimas - Cinética enzimática

Km
Constante de Michaelis

Medida da afinidade do complexo

enzima-substrato (ES)

Específico para cada enzima

 Cinética enzimática
Michaelis e Menten expressaram matematicamente a
velocidade da reação pela fórmula:

Onde Vm é
Vm . [S]
V= velocidade máxima da
Km +[S] reação

Km+ [S]= [S]. Vm Quando V =Vm

V 2

Km= [S] . Vm . 2 S Km= [S]

Vm
 Cinética enzimática
V

V máx

Vmax
2

[S]
Km= [S]

Numericamente, Km pode ser expresso como a

[substrato] necessária para que a velocidade da
reação seja metade da velocidade máxima
 Conclusões sobre Km

Pequena [substrato] é
Km necessária para a reação
atingir metade da Vmáxima

Afinidade da enzima pelo substrato

 Conclusões sobre Km

Grande [substrato] é
Km necessária para a reação
atingir metade da Vmáxima

Afinidade da enzima pelo substrato

 Conclusões sobre Km
Km Afinidade da enzima pelo substrato

Km Afinidade da enzima pelo substrato

v
V

Vmáx
V

V/2
V/2
1/V

Km Km
Km Km s
[s] -1/Km -1/Km
1/s
 Conclusões sobre Km

• Característico de cada enzima

• Reflete a afinidade da enzima pelo seu
substrato
• É numericamente IGUAL a [substrato]
na qual a velocidade da reação é
metade da Vmáxima
Conclusões sobre a Cinética Michaeliana
Quando a Quando a [S] é muito maior
[S] for menor que o Km (até que Km a velocidade da
atingir a saturação da enzima) reação é constante e
a velocidade da reação é igual a Vmax
proporcional à [S] Reação é de ORDEM ZERO
Reação de 1a ORDEM

[S]

Gráfico característico é uma hipérbole

 Cinética Enzimática
Devido à ascenção
gradual da curva
hiperbólica é Não se pode
difícil determinar calcular com
quando foi atingida a exatidão os valores
Vmáx de Km e Vmáx

[S]
 Cinética Enzimática
Lineweaver e Burke Curva DUPLO-RECÍPROCA

1
= Km . 1 + 1
V Vmax [S] Vmax
1
V
Equação da reta
y= ax + b
a= inclinação da reta 1
b= intercepto em y Vmax

-1 1
Km [S]
 Cinética Enzimática
Importância de conhecer o Km das enzimas

• Hexoquinase
• Glicoquinase
Presente em todas as
Presente no fígado
células
Km=10mM
Km=30M
Capaz de
metabolizar mais
glicose conforme o
Saturada
aporte
Após refeições [glicose] na veia porta
hepática é da ordem de mM
Cinética Enzimática
 Cinética Enzimática

• Enzimas Michaelianas
• Enzimas Alostéricas
 Cinética Enzimática
Não-Micheliana Enzimas ALOSTÉRICAS

Curva sigmóide
Característica das
enzimas alostéricas

Afinidade da enzima Modifica com a variação da

pelo substrato concentração do substrato
 Enzimas Alostéricas
Oligômero

Formado por
subunidades idênticas

Protômeros (cada subunidade)

Centro Ativo Centro Alostérico

Moduladores ou Efetores Positivos

Substrato Negativos

Mudança de conformação

Alteração na atividade
 Enzimas Alostéricas
[Efetor positivo] Todas as moléculas da
enzima na forma R

[substrato]

Curva
hiperbólica
CINÉTICA
MICHAELIANA
Curva
sigmóide
 ENZIMAS –
NOMENCLATURA

Século XIX - poucas enzimas identificadas

- Adição do sufixo ”ASE” ao nome do substrato:

* gorduras (lipo - grego) – LIPASE

* amido (amylon - grego) – AMILASE

- Nomes arbitrários:
* Tripsina e pepsina – proteases

57
 ENZIMAS –
NOMENCLATURA

1955 - Comissão de Enzimas (EC) da União

Internacional de Bioquímica (IUB)  nomear e classificar.

Cada enzima  código com 4 dígitos que caracteriza o

tipo de reação catalisada:
1° dígito - classe
2° dígito - subclasse
3° dígito - sub-subclasse
4° dígito - indica o substrato

58
 ENZIMAS –
CLASSIFICAÇÃO
Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.

1. Oxido-redutases (reações de oxidação-redução ou transferência de elétrons)

1.1.atuando em CH-OH
1.2.atuando em C=O
1.3.atuando em C=O-
1.4.atuando em CH-NH2
1.5.atuando em CH-NH-
1.6.atuando em NADH, NADPH
2.Transferases (transferem grupos funcionais entre moléculas)
2.1.grupos com um carbono
2.2.grupos aldeído ou cetona
2.3.grupos acil
2.4.grupos glicosil
2.7.grupos fosfatos
2.8.grupos contendo enxofre
3.Hidrolases (reações de hidrólise)
3.1.ésteres
3.2.ligações glicosídicas
3.4.ligações peptídicas
3.5.outras ligações C-N
3.6.anidridos ácidos 59
 ENZIMAS –
CLASSIFICAÇÃO
Classificação das enzimas segundo a Comissão de Enzimas.

4.Liases (catalisam a quebra de ligações covalentes e a remoção de moléculas de água,

amônia e gás carbônico)
4.1. =C=C=
4.2. =C=O
4.3. =C=N-
5.Isomerases (transferência de grupos dentro da mesma molécula para formar isômeros)

5.1.racemases

6.Ligases (catalisam reações de formação de novas moléculas a partir da ligação entre

duas pré-existentes, sempre às custas de energia)
6.1. C-O
6.2. C-S
6.3. C-N
6.4. C-C

60
 ENZIMAS –
CLASSIFICAÇÃO
 Subclasses

Exemplos de Tipo de reação catalisada Classe

Subclasses
Hidratases Adicionam H2O à ligas duplas Liases
Quinases Transferem fosforilas do ATP Transferase
Mutases Movem fosforilas dentro da Isomerase
mesma molécula
Sintases Síntese independente de ATP Transferases
Sintetases Síntese dependente de ATP Ligases

61
 ENZIMAS –
NOMENCLATURA

ATP + D-Glicose ADP + D-Glicose-6-fosfato

IUB - ATP:glicose fosfotransferase

E.C. 2.7.1.1
2 - classe - Transferase
7 - subclasse - Fosfotransferases
1 - sub-subclasse - Fosfotransferase que utiliza grupo hidroxila
como receptor
1 - indica ser a D-glicose o receptor do grupo fosfato

Nome trivial: Hexoquinase 62