CROMATOGRAFIA HPLC

(CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN)

 CROMATOGRAFA DE LQUIDOS DE ALTA RESOLUCIN, EFICIENCIA, O RENDIMIENTO

ES UN MTODO DE SEPARACIN ANALTICA, QUE SE LLEVA A CABO GRACIAS A LA AFINIDAD

QUE TIENE UN COMPUESTO (ANALTO), POR UNA FASE FIJA O ESTACIONARIA, O POR UNA FASE
MVIL.
 FENMENOS POR LOS CUALES OCURRE UNA SEPARACIN EN HPLC

ADSORCIN. FENMENO DE SUPERFICIE QUE OCURRE POR LA INTERACCIN FSICA O QUMICA DE UN ADSORBENTE
DE UN ADSORBATO.

PARTICIN. ES EL FENMENO DE REPARTO DE UN SOLUTO EN 2 FASES DISTINTAS.

INTERCAMBIO INICO. ES UN FENMENO GENERADO POR LA INTERACCIN ELECTROSTTICA ENTRE MOLCULAS

CARGADAS ELCTRICAMENTE.

EXCLUSIN. ES UN FENMENO FSICO QUE CONSISTE MS QUE NADA EN SEPARAR MOLCULAS EN BASE A SU
TAMAO MOLECULAR.

AFINIDAD. SE COMBINA LA ALTA ESPECIFICIDAD DE CIERTAS MOLCULAS POR UN SUSTRATO, TALES COMO AB,
ENZIMAS, RECEPTORES, ETC.
 CROMATOGRAFA POR PARTICIN

FASE ESTACIONARIA [FE]. SU NATURALEZA QUMICA DEBE SER NO POLAR. LA FASE

ESTACIONARIA A BASE DE SLICE (SIO2) DEBE ESTAR RECUBIERTA CON C6, C8, C12, C18 , Y
ADEMS PUEDE TENER UN SEGUNDO RECUBRIMIENTO CON GRUPOS FENILO, CIANO, U
OTROS QUE HACEN A LA FE MS RESISTENTE A SOLVENTES POLARES COMO H2O, METANOL,
ETC. (FASE ENLAZADA).

FASE MVIL [FM]. SU NATURALEZA QUMICA DEBE SER POLAR O MS POLAR QUE LA FE, LOS
DISOLVENTES PUEDEN SER H2O, METANOL, ETANOL, ETC.

ANALTO. DEBE SER NO POLAR O NO TAN POLAR COMO LA FM PARA PODER SER RETENIDO
POR LA FE.
Instrumentacin

Reservorio. Contiene a la Fase Mvil.

Bomba. Impulsa a la Fase Mvil dentro del sistema de elucin de HPLC.
Inyector (Automuestrador o Manual). Permite introducir la muestra al sistema.
Columna (Precolumna, Guardacolumna y Horno). Sistema de anlisis.

Columna Microboro o Brownlee microbore

 DETECTOR. ES UN TRANSDUCTOR QUE TIENE COMO FUNCIN EL REGISTRO DEL PASO DE
COMPONENTES DE UNA MUESTRA EN EL ORDEN EN EL QUE ELUYEN.

COLECTOR DE FRACCIONES. SIRVE PARA RECIBIR O CONTENER POR SEPARADO LOS

COMPONENTES QUE YA ELUYERON POR SI SE REQUIERE UN ANLISIS POSTERIOR DE ALGUNO
DE ELLOS.

COMPUTADOR. SISTEMA DE ALMACENAMIENTO.

Consideraciones del Reservorio

Frasco cerrado de vidrio o de algn polmero resistente al disolvente con paredes

homogneas.
Contiene un filtro de metal poroso que ayuda a retener partculas de tamao mayor
a 10m.
Previo al bombeo del disolvente hacia el sistema de HPLC, se realiza un
tratamiento por desgasificacin por ultrasonicacin o un burbujeo con un gas inerte
(He excelencia).

Consideraciones del Disolvente

El disolvente debe ser de alta pureza (grado HPLC).

Disolver el analto.
Tener baja viscosidad.
No debe reaccionar con el empaque de la columna.
Debe ser voltil
Polaridad adecuada para el tipo de anlisis que se lleve a cabo.
Bombas

Impulsan a la FM hacia el sistema de HPLC.

Generan presiones de hasta 6000 psi (lb/in2).
Tienen flujo libre de pulsaciones, evitando as la variacin de presin dentro del sistema.
Tienen intervalos caudal de 0.1 a 10 ml/min.

Tipos de bombas

Binarias: Impulsan un solo disolvente hacia el sistema.

Secundarias: Impulsan 2 disolventes hacia el sistema.
Terciarias: impulsan 3 disolventes hacia el sistema.
Secundarias: impulsan 4 disolventes hacia el sistema.
 Elucin isocrtica

Se mantiene la misma proporcin de disolventes durante todo el proceso.

Elucin en gradiente

La proporcin de la mezcla de disolventes cambia en algn punto del proceso.

Este tipo de elucin se utiliza cuando se tiene una mezcla compleja de componentes con polaridad diferente.

UM 7 % O UM 7 % 2O 5 80% O
A 2 A 3 0%HMetOH mi 2
20%HMetOH
3 0%HMetOH
0 n
0

1 40 t(min 1 1 t(min
0 ) 0 5 )
Mtodo Isocrtico Mtodo en Gradiente
 Inyector

Permite introducir la muestra al sistema de HPLC para su anlisis sin despresurizar el sistema y sin interrumpir el caudal.

La muestra se introduce en el loop, el cual se encarga de introducir la muestra al sistema.

Tiene una posicin de carga y otra de inyeccin.

Septum Microjeringas de Inyeccin

Sistema de Inyeccin