CONSERVACIN

DE

MICROORGANISMOS A
BAJAS T
Blacido Espinoza Leonardo
Graos Fernandez Aaron

Porque y para que conservar los cultivos ?

El cultivo (cepa microbiana o viral, linea celular, etc),
es el elemento vital de la investigacin o produccin
industrial
Conservar implica mantener la pureza, viabilidad y
propiedades genticas del cultivo durante un
determinado perodo de tiempo
Consecuencias de una adecuada conservacin:
estabilidad de las cepas de produccin,
reproducibilidad de la investigacin. Reposicin

Los tres objetivos de la conservacin:

1.-Mantenimiento del cultivo puro (PUREZA)

2.-Que este vivo (VIABILIDAD)
3.-gentica estable (ESTABILIDAD)

Historia y evolucin de las tcnicas de conservacin (1)

1677 van Leewenhoek (Holanda): animalculos en agua y cerveza
1830 Cagniard-Latour (Francia): alcohol es producido por bacterias
1860 Pasteur (Francia): fermentacin = microorganismos. Emplea
como medios slidos, papa y meln
1870 O. Brefeld emplea gelatina para solidificar los medios. Describe
el cultivo de P. Glaucum (cultivo monosprico micelio
conidios)
1881 Loeffler caldo nutritivo, Koch le incorpora agar (Mrs. Hesse)
1890 Hansen desarrolla la tcnica del cultivo puro con levaduras
1900 Cultivos puros de bacterias y levaduras de mantienen en medios
slidos a base de caldo nutritivo y extracto de malta y se propagan
peridicamente. Se requiere conservacin a largo plazo para
preservar las caractersticas de los cultivos

Historia y evolucin de las tcnicas de conservacin (2)

1907 Will preserva levaduras en 10 % sacarosa durante 8 aos, pero
hay prdida de actividad
1909-1911 Shackel; Hammer: primeros mtodos de liofilizacin
para bacterias y virus, empleo de suero y leche como protectores
1914 Lumiere y Cherrotier conserva cultivos de Gonococcus bajo
una capa de parafina lquida, el mtodo es perfeccionado por
Morton y Pulski (1938)
1945-1950 La produccin industrial de antibiticos estimula el
desarrollo de nuevas tcnicas. Liofilizacin, crio-conservacin,
adsorcin en suelo, etc; permite el mantenimiento de cultivos por 10
o 20 aos.
1950 Se descubre el efecto crioprotector de varios compuestos:
glicerol, dimetilsulfxido, sacarosa
1958 Sakane desarrolla la tcnica para el secado desde el estado
lquido (L-drying )

Historia y evolucin de las colecciones de

microorganismos
1890 Frantisek Kral genera la primera coleccin de bacterias y hongos en

Praga. Cepas de Mycobacterium (Koch). Cierra en 1911. Se pierden las

cepas
Desarrollo de colecciones privadas
1906 Se publica el primer catlogo de cepas de hongos de la International
Botany Association (Holland). Es el antecesor del CBS (Centraal Bureau
voor Schimmelcultures)
1911 Coleccin de bacterias en el National History Museum of New York
City. Es el antecesor del ATCC (American Type Culture Collection)
fundado en 1925
1944 Takeda Chemical Industries, Ltd. funda el Institute for Aerial
Fermentation para aislar, conservar y distribuir microorganismos, es el
antecesor del Institute for Fermentation (IFO, Osaka)
2003 23 instituciones internacionales autorizadas para recibir material
biolgico con una patente de aplicacin (Tratado de Budapest 1991)

Esquema del proceso de conservacin y sus etapas

crticas

Aislamiento primario

Microorganismo
viable
(gentica/fenotpo)

cultivo
Tipo de propgulo
Estado fisiolgico

Reactivacin

Almacenamiento

Proceso de conservacin

Mtodos de conservacin de cultivos

1. con crecimiento
transferencia seriada

2. con metabolismo limitado

agua destilada
bajo aceite mineral (control por O2)

3. con metabolismo detenido

3.1 Congelamiento (crioconservacin)
3.2 Deshidratacin
L-drying: secado desde la fase lquida,
silicagel, celulosa (papel),suelo, perlas de porcelana

Liofilizacin (freeze-drying)

CRIOCONSERVACIN
Crioconservacin es la conservacin de
material

biolgico

muy

bajas

temperaturas
Rango -20 C a -196 C (nitrgeno
lquido)
El nitrgeno lquido es la temperatura
prctica mas baja disponible. A la
temperatura de equilibrio, la difusin
molecular es extremadamente lenta y la
probablilidad de que ocurran reacciones
qumicas es prcticamente nula

CRIOINJURIA
El proceso de congelamiento y descongelamiento produce cambios
en las cluas que pueden resultar letales
Los procesos perjudiciales son: formacin de cristales de hielo,
exosmsis, aumento de la solubilidad de gases, deshidratacin,
aumento de la concentracin de osmolitos, disminucin del pH,
alteraciones

de

la

actividad

enzimtica,

acumulacin

de

metabolitos, incremento del contacto entre molculas, ruptura de

puentes de H, distorsin de macromolculas, solidificacin,
prdidad de la integridad de membranas, ruptura de emulsiones,
etc
La formacin de hielo intra o extracelular es quizs el evento mas
crtico de la crioinjuria.

INJURIA POR CONGELAMIENTO

Congelamiento lento (efecto soluto)
exosmsis
Hielo extracelular

shrinkage (efecto soluto)

Congelamiento rpido ( efecto hielo )

Hielo intracelular

Dao mecnico

CRIOPROTECCTORES(CPs)
Son sustancias que protegen a las bacterias que
se congelen lentamente mediante uno o mas de los
sig mecanismos:
Eliminando las elevadas concentraciones de
Reduciendo el encogimiento a una determinada t
Minimizando la formacin de hielo
La combinacin de varios crioprotecctores puede
producir un efecto sinrgico, provocando un
incremento de la viabilidad bacteriana.

CRIOPROTECCIN
El tipo de proteccin que ejerce el CPs depende de
su permeabilidad
Todos los CPs son altamente hidroflicos
CPs que permean totalmente ligan agua intracelular
y reducen el efecto soluto
CPs semipermeables; con bajo peso molecular,
forman entre la pared y la membrana celular una
capa que protejen la clula del dao mecnico.
Desplazan el agua intracelular evitando la formacion
de cristales de hielo.

CPs no permeables; con alto peso molecular y por lo

tanto no permeables a travs de la membrana,
promueven la rpida deshidratacin celular ,se
adsorben en la superficie celular incrementando la
viscosidad local lo cual manteniendo el hielo en forma
amorfa evitando dao mecnico
Incorporacin de crioprotectores (CPs)
CPs que permean la pared y membrana celular
Me2SO ( Tp < 30 min), Glicerol, Metanol
Cps que permean la pared pero no la membrana
mono y disacridos, aminocidos, polmeros de bajo PM(PEG 6001000)
Cps no permeantes
Polmeros de alto PM: protenas, polisacridos, PVP

Empleo de CPs en criopreservacin

Frecuencia de uso de CPs
Virus: Me2SO, Suero sanguneo, Sacarosa Glicerol
Bacterias: Me2SO, Suero sanguneo, Sacarosa, Glicerol, leche descremada
Hongos: Me2SO, Glicerol
Algas: Me2SO, metanol, Glicerol, PVP
Protozoarios: Me2SO, Suero sanguneo, Glicerol, Sangre desfibrinada

Rango de concentraciones de CPs

Me2SO: 1-32 % (media 10 %)
Glicerol: 5-50 %
Sacarosa: 1-68 % (media 10 %)
Metanol: 2-10 % (media 5 %)

Tiempos de contacto CPs-clula:

Glicerol, Metanol, Me2SO : 10-60 min a 0-10C

CONSERVACIN POR DESHIDRATACIN

Este mtodo implica la remocin de agua de las clulas (humedad final tpica:
0.06-5.0 % de agua).
La deshidratacin puede llevarse a cabo desde la fase lquida (L-drying) o por
sublimacin desde el estado congelado (liofilizacin)
Las prdida de viabilidad durante la deshidratacin es
atribuida a alteraciones de la membrana celular.

principalmente

Las clulas deshidratadas son susceptibles al deterioro causado por oxgeno

El deterioro de las clulas durante la deshidratacin puede ser controlado por
el agregado de aditivos. Algunos forman una matriz amorfa que dispersa los
componentes txicos que la clula puede liberar durante el secado. Otro
protectores interactan con las membranas, estabilizando su estructura en el
estado anhidro
Los aditivos mas comunes son: leche descremada, aminocidos (glutamato) y
azcares (sacarosa, trealosa)

Principios de la liofilizacin
muestra +
protectores
en ampollas

vaco 30-60 militorrs

manifold
-70 C - 5 C

congelamiento
etilenglicol + hielo seco (- 40 C)
etanol + hielo seco (-70 C)

trampa de agua

Bomba de vaco de aceite

La muestra colocada en una ampolla estril con un plug de algodn, se congela entre
- 40 C y -70 C. Una vez colocada la muestra en el manifold del equipo se comienza
con el vaco y se retira el enfriamiento. La temperatuyra sube hasta -5 C. A esta
temperatura y con un vaco entre 30 y 60 militorrs, el secado es rpido. El tiempo es
variable y depende del volumen de muestra. Al finalizar el proceso se sella la ampolla
al vaco

Los nuevos factores que influyen especficamente en la eficacia de la

liofilizacin como medio de conservacin son:
Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la
liofilizacin y lgicamente sern aquellos que contengan ms agua en su
interior. Algunos hongos filamentosos, especialmente los no esporulados, no
se pueden guardar liofilizados y hay que recurrir a otros mtodos.
Concentracin celular. Lo mejor es liofilizar suspensiones celulares con
una concentracin del orden de 10 8-109 clulas/ml en el caso de las bacterias
y algo inferior en el caso de hongos filamentosos y levaduras.
Temperatura durante la sublimacin. Debe ser lo ms baja posible, sin
subir por encima de 50C.
Grado de deshidratacin alcanzado. Debe ser lo ms alto posible, aunque
la concentracin de solutos puede conllevar una pequea cantidad de agua
remanente que no es perjudicial.
Atmsfera de oxgeno en el tubo. Las clulas liofilizadas se guardan en
tubos cerrados al vaco para evitar, tanto la rehidratacin como la presencia
de algn gas dentro del tubo, como el oxgeno que puede daar a las clulas.

L-Drying

Muestra

Impregnacin en
soporte

Secado sobre silicagel

perlas de porcelana, papel de filtro, suelo

Preservacin en suelo (sandy loam) para microorganismos filamentosos

Secar suelo 6 hs a 150 C
Tamizar suelo seco mesh 10 y 20. Conservar en recipiente tapados
Colocar en tubos Pyrex de 13 x 100 mm suelo seco tamizado hasta una altura de 20
mm y tapar con plug de algodn recubierto de gasa
Autoclar 60 min 3 das consecutivos y secar
Incorporar 1 ml de suspensin de esporos en agua ( no emplear caldo de cultivo)
Secar a temp ambiente (24 C) un mes
Conservar en fro

Consideraciones para la preservacin de cultivos

Debe definirse claramente el medio de cultivo y el tipo de agua
(destilada, deionizada, corriente) empleados.
Tener en cuenta el tipo de cultivo (agarizado, lquido, slido), el estado
fisiolgico de las clulas al momento de la cosecha (cultivos lquidos
cosechados en fase estacionaria suelen ser mas resistentes que los de fase
logartmica), si se emplean clulas con medio lavadas. Determinar si el
agente protector es txico.
Definir condiciones de proceso: concentracin de clulas, tiempo de
secado, agregado de protectores
En procesos industriales la viabilidad no es lo nico importante. La cepa
debe mantener sus propiedades productivas. Desarrollar un test de
produccin o bioensayo
Durante la recuperacin de la especie conservada deben determinarse:
viabilidad, pureza, morfologa, formacin de producto, rasgos
recombinates (plsmidos, resistencia a antibiticos, etc).

Comparacin de algunos mtodos de preservacin

Almacenamiento
(aos)

Ventajas

Desventajas

Agar

0.5-2

Simple, bajo costo,

equipamiento requerido bajo

Secado del agar, baja

estabilidad gentica, riesgo
contaminacin

Aceite mineral

2-20

bajo costo, equipamiento

requerido bajo

trabajo moderado, baja

estabilidad gentica

Mtodo

Congelamiento

4-5

Equipamiento requerido bajo,

buena estabilidad gentica

Requiere protectores, Alto

costo de freezer (-80C).
Clulas pueden ser sensibles al
O2

N lquido

infinito

Preparacin rpida, buena

estabilidad gentica

Suministro regular de N
lquido

Liofilizacin

15-20

Bajo riesgo de contaminacin,

buena a regular estabilidad
gentica

Alto costo de equipamiento

Agua

1-5

Simple , bajo costo, bajo

equipamiento requerido

Estabilidad gentica regular

L-drying

3-10

Simple , bajo costo, bajo

equipamiento requerido

estabilidad gentica?