Para trabajar en un laboratorio de Microbiologa se requieren

unas tcnicas especficas y diferentes de las que se utilizan

en otras disciplinas. Es imprescindible trabajar en condiciones
aspticas: el material e instrumental que se va a utilizar, as
como los medios de cultivo, deben ser sometidos a algn
procedimiento de esterilizacin, eliminndose de ellos
cualquier posible microorganismo. Para mantener
las
condiciones de esterilidad, debemos trabajar en campana de
flujo laminar o en la proximidad de la llama de un mechero
Bunsen.

 El medio de cultivo y el recipiente que lo contiene deben estar estriles.

Los tubos o matraces deben ser tapados con algodn hidrfobo estril
o cubiertos con un capuchn metlico, para impedir la entrada de
microorganismos. Si se usan placas de Petri deben mantenerse
tapadas mientras no se estn manipulando.

Los instrumentos que van a entrar en contacto con el medio de cultivo, con
los distintos recipientes o con los microorganismos en estudio (asa de
siembra, pipetas, etc.) deben ser previamente esterilizados.

MATERIALES EMPLEADOS Y FORMA DE USO

Instrumentos Para Siembra de Microorganismos

A.- Asa de Siembre.

B.- Hilo de Siembra.
C.- Pipeta de Pasteur.
D.- Cayado.

PIPETAS
A.- Pipeta automtica de 0,2 - 1ml.
B.- Pipeta automtica de 0,02 - 0,2ml.
C-- Pipeta de vidrio de 10m.
D.- Pipeta de vidrio de 1ml.

MANEJO DEL ASA DE SIEMBRA DURANTE UNA INOCULACIN

PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DEL MATERIAL

En Microbiologa se define esterilizacin como la destruccin o eliminacin

total de todos los microorganismos vivos en un objeto o material, incluidas
las endosporas bacterianas. La esterilidad es un estado absoluto, no hay
grados de esterilidad.
El material que se va a esterilizar debe prepararse de tal manera que se
conserve sin contaminar una vez esterilizado:

El material de vidrio, como tubos, matraces, frascos, etc., se cierran con

algodn graso o tapones metlicos para evitar la entrada o salida de los
microorganismos.
Adems, cuando se usa algodn, a de cubrirse ste con un papel
impermeabilizado. En el caso de las pipetas, se les coloca en la
boquilla un trocito de algodn que actuar como filtro, evitando la
contaminacin del operario con los microorganismos de la muestra y que
ste a su vez contamine la muestra. Una vez preparadas, se introducen
en estuches o cajas metlicas, o bien se envuelven individualmente en
papel satinado para ser posteriormente esterilizadas. Todo el material de
vidrio se esteriliza con calor seco, generalmente en un horno Pasteur.
El material de plstico desechable ya se suministra estril y listo para su
uso. Por ejemplo, las placas de Petri se introducen en bolsas de plstico
selladas y se esterilizan con xido de etileno o radiaciones.
Las soluciones y medios de cultivo lquidos se envasan en matraces o
tubos y se esterilizan, generalmente, en autoclave.

TCNICAS
El mtodo ms comnmente empleado para destruir los microorganismos
es el calor, entre otras razones porque es el ms econmico y el ms fcil
de controlar. El calor utilizado con este fin puede aplicarse en forma de
calor seco o de calor hmedo. El calor seco destruye los microorganismos
por efectos de oxidacin y se requieren temperaturas muy elevadas. El calor
hmedo elimina los microorganismos a temperaturas menores, ya que la
presencia de agua acelera la rotura de los puentes de hidrgeno
responsables de la estructura tridimensional de las protenas, haciendo que
stas se desnaturalicen y pierdan por tanto su funcionalidad.

CALOR SECO
La esterilizacin por calor seco puede hacerse por flameado o mediante
estufas de aire caliente.
Flameado: Se emplea para esterilizar asas e hilos de siembra, pinzas,
esptulas, etc. Consiste en someter directamente a la accin de la llama
de un mechero Bunsen los utensilios que se vayan a esterilizar. Este
mtodo es rpido y su eficacia es altsima, sin embargo no se puede
aplicar a objetos termolbiles.

Esterilizacin por aire caliente: Se lleva a cabo en estufas de aire caliente

y consiste en colocar los objetos que se van a esterilizar, debidamente
protegidos para que no se contaminen una vez esterilizados, en el interior
de una estufa. Este procedimiento se utiliza para esterilizar material de
vidrio: pipetas, matraces, tubos, etc. U otros materiales termorresistentes.
Las temperaturas a las que se someten estos materiales son muy elevadas
(160 - 180C durante cerca de 2 horas).

ESTERILIZACIN POR AIRE CALIENTE

Estas temperaturas no pueden utilizarse para esterilizar lquidos (como

medios de cultivo), ya que al llegar a los 100C comenzaran a hervir y
continuaran hirviendo sin elevar su temperatura por encima del punto de
ebullicin del agua a presin atmosfrica, y a esta temperatura las
endosporas bacterianas pueden sobrevivir durante horas. Pero incluso en
muestras en las que supisemos que no existen endosporas, esta
metodologa puede implicar cambios en la concentracin de los
componentes del medio, a causa de la fuerte evaporacin sufrida.

CALOR HMEDO
El calor hmedo tambin se utiliza para la destruccin de los microorganismos
siendo, como ya se ha comentado, a igual temperatura, mucho ms eficaz que
el calor seco; con este tratamiento las enzimas se desnaturalizan rpidamente,
al igual que las membranas celulares. Adems, el vapor de agua, especialmente
si se genera a sobrepresin, es un eficaz transmisor de calor al interior de la
clula microbiana. Se puede aplicar utilizando varios mtodos: ebullicin, vapor
fluente y vapor saturado a presin:

EBULLICIN:
Ebullicin: El agua hirviendo (100C) tiene accin limitada, ya que aplicada
durante 10 minutos va a destruir las formas vegetativas de los
microorganismos, pero las endosporas bacterianas pueden sobrevivir
incluso a tratamientos prolongados. Se podra utilizar el bao Mara o bao
de agua hirviente (slo con fines de desinfeccin en el laboratorio), cuando
no se necesita alcanzar la esterilidad o cuando no se dispone de otros
mtodos mejores, tanto para material (pinzas, tijeras, escalpelos, etc.) como
para medios de cultivo que no puedan esterilizarse en autoclave.

VAPOR FLUENTE
Vapor fluente: Esta tcnica se emplea con frecuencia para esterilizar
medios de cultivo que no se puedan someter a una temperatura superior
a 100C sin que pierdan alguna de sus propiedades, como leche, azcares,
suero, etc. Se utiliza un autoclave a presin atmosfrica, con la espita
abierta, donde nunca se superan los 100C, y se realiza el proceso durante
tres das consecutivos, dejndose a temperatura ambiente en los intervalos
entre dos tratamientos. La muestra se somete a calentamiento (100C)
durante 30-45 minutos destruyndose en este proceso las formas vegetativas
pero no las endosporas termorresistentes. Si stas se encuentran presentes
en la muestra germinan despus del calentamiento y estas formas
vegetativas sern destruidas en los siguientes ciclos. Este mtodo de
esterilizacin se denomina tambin esterilizacin fraccionada o tindalizacin.

Clula Vegetativa
Germinacin de
la Espora

Clula Esporulando

Crecimiento

Clula
Espora

VAPOR SATURADO A PRESIN

Vapor saturado a presin: La esterilizacin por esta tcnica utiliza vapor de
agua saturado que se somete a una atmsfera extra de presin sobre la
presin atmosfrica normal, elevndose con ello el punto de ebullicin del
agua de 100C a 121C y consiguindose la destruccin de todos los
microorganismos (salvo los termfilos extremos) en un tiempo de 15 a 20
minutos. Esta temperatura es tambin necesaria para la destruccin de las
endosporas bacterianas, que presentan una alta resistencia trmica y que
pueden sobrevivir, como ya se ha indicado, a 100C durante horas. El vapor
de agua difunde por smosis a travs de las membranas de las esporas,
coagulando su protoplasma, fenmeno que se acenta si el vapor es
saturado y a sobrepresin. Esta tcnica de esterilizacin requiere el uso del
autoclave.

Para la esterilizacin de materiales lquidos sensibles al calor, como

algunos medios de cultivo, soluciones de antibiticos, enzimas, vacunas,
etc. o tambin para gases, se utiliza la filtracin. En la esterilizacin por
calor se destruyen los microorganismos del medio, mientras que la
filtracin los retira de una forma mecnica, en lugar de destruirlos.

LA FILTRACIN

La filtracin es el paso de un lquido o gas a travs de un material filtrante,

con poros lo suficientemente pequeos como para retener clulas
microbianas. Los filtros que se utilizan en la actualidad son, generalmente,
los denominados filtros de membrana y estn integrados por pequeas
piezas de material sinttico, generalmente acetato de celulosa o
policarbonato, que pueden tener poros con tamaos de 0,22 y 0,45 m,
diseados para retener bacterias. La accin combinada de los poros, la
trama del filtro y la naturaleza qumica del material utilizado retiene los
microorganismos, pero no el fluido. Los fluidos que se van a filtrar pasan
a travs de la membrana con la ayuda del vaco generado, por ejemplo,
con una bomba de vaco. Tanto los filtros de membrana como los equipos
de filtracin con los que stos se usan deben ser esterilizados por otros
mtodos, generalmente el autoclave.
Los virus y algunas bacterias de tamao muy pequeo como, por ejemplo,
los micoplasmas, no son retenidos por los filtros habituales.

MATERIALES QUE SE PUEDEN ESTERILIZAR CON VAPOR

Material textil
Material de vidrio
Material de goma
Instrumental Quirrgico de acero inoxidable
Soluciones acuosas
Todo aquel material cuyo fabricante certifique pueda ser esterilizado por vapor
MATERIALES QUE NO SE PUEDEN ESTERILIZAR CON VAPOR
Sustancias oleosas
Sustancias grasas
Polvos
Instrumental Quirrgico cromado o niquelado
Artculos elctricos sin cobertura especial
Todo material que no tolera la exposicin al calor y a la humedad

MATERIALES QUE PUEDEN ESTERILIZARSE POR CALOR SECO

Instrumental Quirrgico cromado
Materiales de vidrio, aluminio o porcelana
Aceites, parafina, sustancias grasas, vaselina
Polvos (talco)
MATERIALES QUE NO SE PUEDEN ESTERILIZAR POR CALOR SECO
Material textil (algodn, sedas, lino, etc.)
Gomas
Materiales sintticos
Todo material que se altere a la temperatura de trabajo
NOTA: cuando el material a esterilizar sea mal conductor trmico (talco),
deber disponerse en capa delgada.

LA LIMPIEZA GENERALMENTE COMPRENDE:

Una accin mecnica: como frotar, cepillar, lavar con agua bajo presin
o uso de aire comprimido.
Una accin qumica: detergente, detergente enzimtico y agua que son
usados para inhibir y eliminar a los microbios, residuo orgnico y el polvo.
El calor (agua caliente) mejora las propiedades de disolucin del agua, el
detergente y enzimas.