La Cintica Enzimtica es una

aproximacin para conocer el

mecanismo de la reaccin
Para determinar el mecanismo de accin de
enzimas purificadas, se requiere conocer:
La estructura 3D de la Enzima (protena, RNA)
que se puede obtener a partir de la clsica
qumica de protenas, y por mutagnesis sitio
dirigida, que nos permiten examinar el rol de
c/AA en la estructura y accin enzimtica.
Y, el otro viejo parmetro an valido, es la
velocidad de la reaccin y como cambia ste
respecto a ciertos parmetros experimentales.

La concentracin de sustrato afecta la velocidad de las

reacciones catalizadas por enzimas
[S] = factor clave que afecta la V
su estudio es complicado por que [S] cambia durante la reaccin
Para simplificar se mide velocidad inicial V0
una enzima terica:
E
S
P
En la cual [E] es suficiente para
catalizar la reaccin a una Vmax. de 1
M/min y La Km es 0.5 M

Las curvas de [P] vs. t se han realizado para [S]: por arriba, en y por
debajo del Km, la V de una reaccin catalizada por una enzima declina
conforme la [S] es convertida a P, la Tangente de cada curva en t0 es V0.

En una reaccin tpica [E] est en [nM] mientras que [S] puede estar
en 5 o 6 ordenes de magnitud ms alta, si solo se monitorea el inicio
de la reaccin (los primeros 60 s o menos) los cambios en la [S]
constituyen un pequeo % y puede considerarse la [S] como
constante.
Cuando se evala V0 en funcin a [S]

En 1903 Henri y guiado por Wurtz propone que el complejo ES es

clave para entender este comportamiento cintico, estos conceptos
se expandieron en la teora de la accin enzimtica por: Mi Me 1913

Mi Me postulan dos pasos:

k1
E+S

ES
k-1
k2

ES

E+P

k-2
Esta ltima es lenta y limita la reaccin total. V a las
especies que actan en este segundo paso esto es ES
La E puede existir como E ES
A bajas [S] est como E, la V [S] debido al equilibrio de
su formacin. ES se incrementa conforme [S] aumenta.

La Vi max se observa cuando virtualmente toda la E est bajo

la forma ES y E es infinitamente pequea, la E esta saturada
con el sustrato de tal manera que mayores incrementos en
la [S] no tienen efecto en la V. Esto ocurre cuando [S] es tan
alta que toda E esta como ES.
Despus que ES se rompe para dar P y E, E est libre para
reaccionar con otra molcula de S.(y puede hacerlo
rpidamente bajo condiciones saturantes). La saturacin es
caracterstica de los catalizadores enzimticos y
responsable de la asntota plato (plateau) en la grfica.
Cuando la E es mezclada con excesos de S hay un periodo
inicial pre estado estacionario durante el cual se incrementa
la [ES] este periodo es muy corto para ser observado
( microsegundos) y no es evidente.

La reaccin llega rpidamente

al estado estacionario en el
cual [ES] (y la todos los
[Intermediarios] ) se mantienen
constantes por un buen tiempo
Birggs y Haldane 1925.
La V0 medida generalmente
refleja el estado estacionario,
Se cree que V0 est limitado a
la primera parte de la reaccin,
el anlisis de esta V0 se
conoce como cintica del
estado estacionario.

La relacin entre Concentracin de sustrato y velocidad

de reaccin puede ser expresada cuantitativamente
La relacin V0 vs, [S] para la mayora de las enzimas,
presenta una grfica similar a una hiprbola rectangular,
expresada algbricamente por la ecuacin de Mi Me.

Ellos parten de su hiptesis que el paso que limita la V es

el paso que rompe ES para dar P + E.
Los trminos: [S], V0, Vmax y Km (constante de Michaelis)
son medibles experimentalmente.

Desarrollo de la base lgica y algebraico de la

Ec. de Mi Me, incluye la asuncin del Estado Estacionario de
Briggs y Haldane.
La derivacin comienza con los pasos de formacin y
ruptura de ES. En la reaccin temprana [P] es despreciable
y se puede simplificar ignorando la reaccin de P
S
descrita por k-2
k1
k2
E+S
ES
E+P
k-1
V0 esta determinada por la ruptura de ES para formar P, que
a su vez esta determinado por la [ES]:
V0 = k2 [ES]

[ES] no es medible, se puede medir [S] (o P) y [Et]

[Et] = [E] + [ES], por lo que [E] = [Et] [ES]
Por lo general [S] >>> [Et] , por lo que la cantidad de S
unido a E es despreciable comparado a [S] total. Con
estas consideraciones veamos algunos pasos para medir
V0 :
Paso 1:
Velocidad de formacin de ES = k1 ([Et]-[ES]) [S]
Velocidad de ruptura de ES = k-1[ES] + k2 [ES]
Paso 2: Otra asuncin importante es que la V0 ,refleja un
Estado Estacionario en el cual [ES] es constante, Vformacin
= Vruptura . k1 ([Et]-[ES]) [S] = k-1 [ES] + k2 [ES]

Paso 3: resolviendo la ecuacin para ES: multiplicando el

primer termino y factorizando el segundo:
k1 ([Et]-[ES]) [S] = k-1 [ES] + k2 [ES]
k1 [Et] [S] - k1 [ES] [S] = ( k-1 + k2 ) ( [ES] )
Sumando k1[ES] [S] a ambos trminos y factorizando
k1 [Et] [S] = (k1 [S] + k-1 + k2 ) [ES] ; Despejando [ES]
k1 [Et] [S]
[ES] =

; Dividiendo entre k1
(k1 [S] + k-1 + k2 )
[Et] [S]

[ES] =
[S] + (k + k )/k

Donde (k + k )/k = K

Remplazando
[Et] [S]
[ES] =
Km + [S]
Paso 4: Expresando V0 = k2 [ES]
k2 [Et] [S]
V0 =
Km + [S]
An ms, la velocidad mxima ocurre cuando la enzima est
saturada con el sustrato esto es [ES] = [Et] , Vmax = k2 [Et]
Simplificando la expresin a:
Vmax [S]
V0 =
Km + [S]
Esta es la ecuacin de Mi Me. La ecuacin de la velocidad para una
reaccin catalizada por una enzima sobre un sustrato que relaciona
.
Km tiene unidades de concentracin molar

La ecuacin obedece las leyes experimentales

Qu ocurre cuando V0 =
Vmax/2

Los parmetros cinticos son usados para comparar

actividades enzimticas
Hay que distinguir entre la ecuacin de Mi Me. Y
Mecanismo cintico especfico, el cual se basa en la
cintica, la ecuacin describe el comportamiento cintico
de una gran mayora de enzimas, todas las que muestran
un comportamiento hiperblico de V0 vs. [S] se dice que
siguen la cintica de MI Me.
La regla prctica donde Km = [S] cuando V0 = Vmax se
cumple para todas las enzimas que siguen la cintica de
Mi Me. La excepcin son las enzimas regulatorias.
Sin embargo la ecuacin de Mi Me. No depende del
mecanismo simple de dos pasos propuesto inicialmente.

Muchas enzimas que siguen la cintica de Mi Me. Tienen mecanismos

de reaccin completamente diferentes y enzimas que catalizan
reacciones con 6 8 pasos identificables exhiben el mismo
comportamiento cintico estado estacionario.
La relacin Km = [S] cuando V0 = Vmax se cumple para muchas
enzimas, la magnitud y el comportamiento real de Vmax y Km pueden
diferir de una enzima a otra. Esta es una importante limitacin del
estado estacionario, es una aproximacin a la cintica de las enzimas.
Vmax y Km pueden medirse experimentalmente algunas veces proveen
poca informacin sobre el nmero velocidad o naturaleza qumica de
los pasos discretos en la reaccin, la cintica del St. St. es el lenguaje
estndar con el cual los bioqumicos comparan y caracterizan la
eficiencia de las enzimas.

Interpretando Vmax y Km a travs del mtodo grfico

Una de la formas ms usadas es el grfico de doble recproca,

tambin llamado grfico de Lineweaver Burck (o inversas)
1
Km
1
=
+
V
Vmax[S]
Vmax
ver interceptos.
Este grfico facilita la evaluacin de las constantes y permite la
discriminacin entre los diferentes tipos de inhibidores.
La desventaja es que la determinacin de Km requiere largas
extrapolaciones que pueden originar error.

El Km puede variar de una enzima a otra y an para diferentes sustratos

con la misma enzima (el termino es usado a veces inapropiadamente
como un indicador de afinidad de E por S)

La medida en tiempo real del Km depende de aspectos

especficos del mecanismo de reaccin tal como el
nmero y velocidades relativas de los pasos individuales,
para reacciones con dos pasos: Km = (k-1 + k2 )/k1
Cuando k2 limita la velocidad k2 <<< k-1 y la expresin Km,
se reduce a k-1/k1 que se define como constante de
disociacin Kd del complejo ES, bajo estas condiciones
Km representa una medida de la afinidad de E por S en el
complejo ES, esto no necesariamente se cumple para
todas las enzimas, algunas veces k2 >>> k-1 y Km se
reduce a k2/k1 en otros casos k2 y k1 son comparables a
Km mantenindose una funcin ms compleja de las tres
constantes de velocidad.

La ecuacin de Mi Me y el comportamiento de saturacin

caracterstico de la enzima an se aplica. pero Km no
puede ser considerado como una como una simple
medida de afinidad por el sustrato. Aun hay casos
comunes en los cuales la reaccin va a travs de varios
pasos despus de la formacin de ES, Km puede ser
entonces una funcin muy compleja de muchas
constantes de velocidad.
La Vmax vara grandemente de una enzima a otra
Si una enzima reacciona por los dos pasos del mecanismo
de Mi Me, Vmax = k2 [Et] donde k2 es la velocidad limitante
sin embargo el nmero de pasos de la reaccin y la
identidad de los paso(s) limitantes puede variar de una
enzima a otra.

Por ejemplo cuando la liberacin de P, ES

P es el paso limitante,
al principio de la reaccin cuando P es bajo la reaccin total puede ser
descrita como:
k1
k2
k3
E+S
ES
EP
E+P
k-1
k-2
En este caso la mayora de la enzima esta como EP en saturacin y
Vmax = k3 Et
Esto es til para definir una constante de velocidad mas general, kcat
para describir la velocidad limitante de cualquier reaccin catalizada
por enzima en saturacin.
Si la reaccin tiene varios pasos y uno claramente limita la velocidad,
kcat es equivalente a la constante de velocidad para aquel paso
limitante, para nuestra reaccin ms simple kcat = k2 para esta ltima
kcat = k3

Cuando varios pasos parcialmente limitan la velocidad kcat es una

funcin compleja de varias constantes de velocidad que definen cada
paso de la reaccin individual.
En la ecuacin de Mi Me kcat = Vmax / [Et] ( recordar que Vmax = k2 [Et] ) y
la ecuacin se expresa:
kcat [Et] [S]
V0 =
Km + [S]
kcat es una constante de velocidad de primer orden y tiene unidades
inversas de tiempo tambin se le conoce como nmero de recambio o
nmero de molculas de sustrato convertidas a producto en una
unidad de tiempo por una simple molcula de enzima cuando esta
esta saturada de sustrato

Experimentalmente el Km de una enzima tiende a ser similar a la

concentracin celular de su sustrato, una enzima que acta a una
concentracin de sustrato muy baja en la clula, tiene un bajo K m
comparado con otra que acta a concentraciones mas altas.
La mejor manera de comparar la eficiencia cataltica de diferentes
enzimas o el recambio de diferentes sustratos es comparar la relacin
kcat/Km
constante de especificidad, es la constante de conversin de E+S a
E+ P cuando [S] << Km, reduciendo nuestra ecuacin a
kcat
V0 =
[Et][S]
Km
Como se ve V0 es de segundo orden y la constante tiene unidades de
M-1 y s-1
Hay un lmite superior para esta relacin impuesta por la velocidad de
difusin de S y E en solucin acuosa cuyo limite esta entre 10 8 y 109
M-1 y s-1

Supongamos que una enzima puede elegir entre dos sustratos A B

presentes en igual concentracin.
VA

(kcat / Km)A [E] [A]

=

VB

(kcat / Km)A
=

(kcat / Km)B [E] [B]

(kcat / Km)B

Preferencias de la quimiotripsina en la hidrlisis de varios

N-acetil aminocidos metil esteres, medido por kcat/Km

variaciones de un milln X
preferencia por residuos
hidrofbicos.

Triosa fosfato isomerasa tiene kcat/Km = 2.4 x 108 (mol/l) -1 seg-1 se

sabe que es una enzima casi perfecta casi con un mximo de
eficiencia, por eso se cree que se ha conservado evolutivamente de
levaduras a vertebrados con muy pocos cambios en su estructura

REACCIONES MULTISUSTRATO
La mayora de las reacciones bioqumicas enzimticas
tienen dos ms sustratos y muchas veces con varios
productos, (hexokinasa HK)
Las V de estas reacciones bisustrato tambin pueden
analizarse por la aproximacin de Mi Me. HK tiene un Km
para cada S, ATP = 0,4; Glucosa 0,05; Fructosa=1,5 mM.
Este tipo de reacciones involucran la transferencia de un
tomo grupo funcional de un S a otro. Y pueden
proceder por una de las sgtes. vas.

E es una forma modificada de la enzima, que a menudo lleva un

fragmento de S1

Un ejemplo es la reaccin de la Serin proteasa, donde S

es el Polipptido A .B en el cual A y B son las porciones
C y N terminal de la cadena en el punto de clivaje.
S1
E

A
ES

H 2O
E*.B

B
E*. B . H2O

Donde E*.B y E*. B . H2O indican el acil intermediario

A
B
E*B
E*B.H2O

La cintica St. St. Puede ayudar a

distinguir entre estas
posibilidades.
Anlisis de la Cintica St. St. De
reacciones bisustrato.
Grficas de L&B, variando la [S1] y
manteniendo la [S2] cte.
Repitiendo para diferentes valores
de [S2], generan varias lneas que:
Si se intersectan indican la
formacin de un complejo ternario
en la reaccin.
Si se mantienen paralelas indican
una va ping pong (mecanismo de
doble desplazamiento )

Estudios Cinticos pre-estado estacionario pueden dar evidencias

para los pasos especficos de una reaccin
El mtodo primario para estudiar una reaccin enzimtica es la
cintica y los parmetros cinticos vistos presentan limitaciones para
ofrecer esta informacin. Una figura completa requiere de metodos
cineticos ms sofisticados, un o es la cintica pre-estados
estacionario.
Una completa descripcin de una reaccin catalizada por enzima
requiere mediciones directas de las velocidades de los pasos
individuales de reacciones, por ejemplo:
la asociacin de la E y S para formar ES esto es durante el preestado estacionario,
que la velocidad de muchos pasos de las reacciones puedan ser
medidos independientemente
y eventos durante la reaccin de una simple molcula de sustrato
puedan ser observados,

debido a que la fase pre estado estacionario es muy corta los experimentos
requieren tcnicas especializadas para un muestreo y mezcla muy rpido,
Un objetivo es tener una figura completa y cuantitativa de los cambios de
energa durante la reaccin , como ya se conoce las velocidades de reaccin
y equilibrio estn relacionados a los cambios de energa libre durante una
reaccin .
Otro objetivo es medir la velocidad de pasos individuales de la reaccin , se
han podido registrar las velocidades de cada paso individual de una reaccin
enzimtica de mltiples pasos .

referencias
Capitulo de
cinetica de los
libros:
Mathews y
lehninger