Knockout of Endothelial Cell-Derived Endothelin-1

Attenuates Skin Fibrosis but Accelerates

Cutaneous Wound Healing

Katsunari Makino1, Masatoshi Jinnin1, Jun Aoi1, Ikko Kajihara1, Takamitsu Makino1,Satoshi
Fukushima1, Keisuke Sakai1, Kazuhiko Nakayama2, Noriaki Emoto2, Masashi
Yanagisawa3,4, Hironobu Ihn1
DRA. FABIANA ORTEGA
Mayo 2014
Introduccin
Pptido vasoconstrictor ms potente por accin sobre el musculo liso vascular, y
puede estimular la proliferacin del msculo liso.
Induce la expresin de protooncogees como Myc
En cultivo induce la expresin de colgeno en fibroblastos de corazn, piel o rin
In vitro e in vivo: efecto profibrtico (mecanismo detallado desconocido)
Liberado principalmente por clulas endoteliales
Acciones biolgicas mediadas por dos receptores ETA y ETB
Supresin de ET-1 en ratones produce muerte postnatal por anormalidades
craneofaciales

Endotelina 1:
Mtodos y materiales
Protocolos animales aprobados por el Comit para la investigacin en
animales en Universidad de Kumamoto
8 semanas
Heterocigotos ET-1 ; Tie -2.Cre (+), control ET-1 Tie -2-Cre (-) y
ratones salvajes (WT)
Mantenidos en aislamiento libre de patgenos, temperatura, dieta y ciclo de
luz/oscuridad controlados y agua libre.





Mtodos y materiales
Bleomicina: diluido en solucin salina buffer (PBS)
concentracin: 1 mg/ml, esterilizado por filtracin
Inyectado ID en la espalda, afeitada, de los ratones por 4
semanas.
La piel de la espalda se removi luego de la ltima inyeccin
de bleomicina.
Bajo anestesia local, punch de 8mm, luego enjaulados
individualmente.
Tejido de la herida y el rea alrededor fue recolectada a los
0,3,7,12 das
Mtodos y materiales
Tincin: Hematosilina-eosina o tricromo de Masson
Inmunotincin: anticuerpos para ET-1, myeloperoxidasa, CD3, F4/80 teidos con
hematoxilina de Mayer
Inmunofluorescencia: anticuerpos policlonales de conejo anti ET-1 e isolectina IB4
Medida del contenido de colgeno en los tejidos: kit microensayo cuantitativo , se
midi con espectofotmetro la absorbancia.
Aislamiento de ARN y PCR rt
Analisis estadstico: Mann-Whitney U para comparacin de medias. P 0,05 significativo
Resultados
Expresin de ET-1 en piel de ET1
f/f
; Tie-2-Cre (+):
Ratones ET-1 completos, murieron al nacer




Tie-2-Cre (+) se compararon con WT:
caractersticas macroscpicas y
microscpicas similares
Se confirma expresin de ET-1 por inmunohistoqumica
en Wt ms no en ET1
f/f
; Tie-2-Cre (+)
Inmunoflorescencia: expresin de cotincion de ET-1
e Isolectina IB4 ( marcador de clulas endoteliales)
WT KO
Resultados
Bleomicina induciendo fibrosis cutnea en ET1
f/f
; Tie-2-Cre (+):
PBS
BLEOMICINA
No
diferencia
en grosor
WT KO
Fibrosis y
engrosamiento
drmico
HE
Tricrmica de Mansson
Resultados
Infiltrado inflamatorio y expresin de genes relacionados con MEC
en ratones ET1
f/f
; Tie-2-Cre (+):
No hubo diferencia en neutrfilos mieloperoxidasa +, macrfagos F4/80 + o linf. T CD3 +
por inmunohistoqumica
Resultados
Cierre de herida, formacin de tejido de granulacin y
reepitelizacin en ET1
f/f
; Tie-2-Cre (+):
Resultados
Resultados
Discusin
Primer estudio en reportar el rol de endotelina-1 en fibrosis cutnea y reparacin
de heridas, regulando la expresin de citoquinas y MEC
La induccin de fibrosis cutnea por bleomicina es conocida por estudios murinos
para esclerosis sistmica.
El desarrollo de fibrosis cutnea inducida por bleomicina(FCIB), se acompaa de
evidencia de aumento de TGF- , pero se demostr que el desarrollo de FCIB se
inhibe en ratones sin endotelina-1 de clulas endoteliales.
Los niveles de ARNm de TGF y colgeno 2 disminuyen en piel, con bleomicina,
de ratones KO, sin haber diferencia en el numero de clulas inflamatorias, es decir
la disminucin de la fibrosis resulta en ratones KO, por niveles menores de TGF y
subsecuente menor expresin de colgeno
A pesar de estudios previos donde la expresin de ET-1 era regulada por TGF ,
nuestro estudia demuestra que in vivo puede ocurrir lo contrario

Discusin
La cicatrizacin de heridas en ratones ET-1 KO fue ms acelerada que en WT
La reduccin ms temprana del tejido de granulacin y reepitelizacin acelerada
fue vista en ratones KO, sin embargo no se observ diferencia en cuanto a clulas
inflamatorias
RNA_m de TNF- , citocina proinflamatoria, se observ significativamente ms
reducido en la herida de los ratones KO que en los WT. Se sabe que en ratones
deficientes del receptor de TNF- se acelera la cicatrizacin por disminucin de
infiltracin leucocitaria, por lo tanto este podra ser uno de los mecanismos por los
que se acelera la cicatrizacin
Los niveles de ARN_m de TGF- asi como colgeno 2 y CTGF se encontraban
reducidos en en la herida de los ratones KO. A pesar que segn estudios previos
TGF- induce fibrosis va sntesis de colgenos y CTGF, puede causar efectos
adversos en la curacin de las heridas. Por tanto este puede ser otro mecanismo
para la curacin de heridas, ms acelerada, en ratones KO


Conclusines
La endotelina 1 es un potencial blanco teraputico en fibrosis y
curacin de heridas.

Futuras investigaciones sobre los mecanismos reguladores de estas
condiciones patolgicas, pueden proporcionar una aproximacin
teraputica

Gracias!