FAC

L U

DD TA

E CI EN CIAS Q UI M

I
CA
S

J E D

Bronquiolitis severa por virus sincitial respiratorio en lactantes, asociada con la reduccin de Interfern Gamma y la sustancia P en las vas respiratorias
MALCOLM G. SEMPLE, HINKE M. DANKERT, BAHRAM EBRAHIMI, JAILSON B. CORREIA, J. ANGELA BOOTH, JAMES P. STEWART, ROSALIND L. SMYTH, C. ANTHONY HART

Introduccin
2
La infeccin por virus sincitial respiratorio (HRSV), est en todas partes

y es la causa ms importante de la infeccin del tracto respiratorio bajo severa en nios pequeos de todo el mundo.
En pases industrializados, este virus es la causa de que aproximadamente 2,5%

de los nios sean hospitalizados en su primer ao de vida.

Aproximadamente el 50% de los nios ingresados en el hospital con

bronquiolitis, sufren de sibilancias recurrentes en la infancia tarda.

En

este amplio y pragmtico estudio clnico observacional, cada mecanismo en la va patgena se ensay midiendo factores representativos (IFN-c, la carga viral, la sustancia P y la IL-9) en las secreciones respiratorias recogidas de los nios ingresados en el hospital.

Hiptesis
3

' Cuando la variacin en un mecanismo patognico se asocia con una enfermedad grave, los factores representativos (citocinas y la carga viral) varan de acuerdo con la severidad de la enfermedad''.

Metodologa
4

Seleccin de los participantes

Recoleccin de aspirados nasofarngeos (ANF)

Recoleccin de lavado bronquioalveolar (LBA)

Medicin de Urea

Procesamiento de muestras

Deteccin de hRSV

Medicin de citocinas en MAN y en MLB

Medicin de la carga viral libre

Tratamiento estadstico y tico

Seleccin de los participantes

5

Pacientes peditricos con bronqueolitis internados

en el Hospital infantil Alder Hey en Liverpool durante las estaciones invernales de 2002, 2003 y 2004. La bronqueolitis fue diagnosticada por los pediatras en infantes (nios < 2 aos) que presentaban:

Taquipnea Recesin subcostal Crepitante inspiratorio bilateral durante la auscultacin Deteccin de hRSV por mtodos inmunolgicos

Metodologa
6

Seleccin de los participantes

Recoleccin de aspirados nasofarngeos (ANF)

Recoleccin de lavado bronquioalveolar (LBA)

Medicin de Urea

Procesamiento de muestras

Deteccin de hRSV

Medicin de citocinas en MAN y en MLB

Medicin de la carga viral libre

Tratamiento estadstico y tico

Recoleccin de aspirados nasofarngeos (ANF)

7

Las muestras de ANF fueron recolectadas por el

personal de enfermera durante el proceso de admisin.

Los bebs fueron envueltos en una manta pequea

y se colocaron en posicin decbito supino en una cuna.

Recoleccin de aspirados nasofarngeos (ANF)

8

Las secreciones nasales de ambas fosas fueron

aspiradas sin lavado, con un catter de tamao de F , el cual con posee dos ojos laterales distales y un puerto del lado proximal con control de succin en la punta del dedo.

El recipiente fue llevado al laboratorio y conservado

a 4 C durante el tiempo de procesamiento.

Metodologa
9

Seleccin de los participantes

Recoleccin de aspirados nasofarngeos (ANF)

Recoleccin de lavado bronquioalveolar (LBA)

Medicin de Urea

Procesamiento de muestras

Deteccin de hRSV

Medicin de citocinas en MAN y en MLB

Medicin de la carga viral libre

Tratamiento estadstico y tico

Recoleccin de lavado bronquioalveolar (LBA)

10

Las muestras de LBA fueron recolectadas de los pacientes

ventilados por uno de los investigadores o por un fisioterapeuta con experiencia de acuerdo con la gua de la European Respirtatory Society 2000.

Ajustaron un volumen de solucin salina al 0,9% a razn de 1

ml/kg.

Se instil dos veces por un tiempo mnimo a fin de evitar

cualquier efecto de dilisis de urea.

No fue posible muestrear a los pacientes no intubados debido

a que no se puede justificar una anestesia solo para recoleccin de muestras.

Metodologa
11

Seleccin de los participantes

Recoleccin de aspirados nasofarngeos (ANF)

Recoleccin de lavado bronquioalveolar (LBA)

Medicin de Urea

Procesamiento de muestras

Deteccin de hRSV

Medicin de citocinas en MAN y en MLB

Medicin de la carga viral libre

Tratamiento estadstico y tico

Deteccin de hRSV
12

Los ANF fueron diluidos en 3 ml de solucin

fisiolgica estril y mezclado vigorosamente antes de ser sometido a un ELISA para buscar el antgeno hRSV.

Metodologa
13

Seleccin de los participantes

Recoleccin de aspirados nasofarngeos (ANF)

Recoleccin de lavado bronquioalveolar (LBA)

Medicin de Urea

Procesamiento de muestras

Deteccin de hRSV

Medicin de citocinas en MAN y en MLB

Medicin de la carga viral libre

Tratamiento estadstico y tico

Procesamiento de muestras
14

Las muestras de LBA y las restantes de ANF fueron

filtradas a travs de un monofilamento de nylon con poro de 60 mm para eliminar el moco ms grueso.
El filtrado fue centrifugado a 300 g por 5 min a 4C. Se elimin el sobrenadante, se separ en alcuotas y

fue almacenado a 70C.

Metodologa
15

Seleccin de los participantes

Recoleccin de aspirados nasofarngeos (ANF)

Recoleccin de lavado bronquioalveolar (LBA)

Medicin de Urea

Procesamiento de muestras

Deteccin de hRSV

Medicin de citocinas en MAN y en MLB

Medicin de la carga viral libre

Tratamiento estadstico y tico

Medicin de urea
16

El mtodo de dilucin de urea para la estimacin de

la dilucin de muestras respiratorias ha sido validado recientemente en los estudios de gatos y perros.

La medicin fue llevada a cabo mediante el uso de un

mtodo de uresasa en las muestras respiratorias.

Metodologa
17

Seleccin de los participantes

Recoleccin de aspirados nasofarngeos (ANF)

Recoleccin de lavado bronquioalveolar (LBA)

Medicin de Urea

Procesamiento de muestras

Deteccin de hRSV

Medicin de citocinas en MAN y en MLB

Medicin de la carga viral libre

Tratamiento estadstico y tico

Medicin de citosinas
18

El interfern y la sustancia P fueron medidas

mediante elisa.

La IL-9 fue medida por un mtodo de ELISA

validado de manera interna

Metodologa
19

Seleccin de los participantes

Recoleccin de aspirados nasofarngeos (ANF)

Recoleccin de lavado bronquioalveolar (LBA)

Medicin de Urea

Procesamiento de muestras

Deteccin de hRSV

Medicin de citocinas en MAN y en MLB

Medicin de la carga viral libre

Tratamiento estadstico y tico

Medicin de la carga viral

20

El cido nucleico se extrajo de 140 ml del filtrado

respiratorio libre de clulas.

Se procesaron las muestras de 1ml de cDNApor

duplicado durante 35 ciclos de RT-PCR.

Los

oligos fueron diseados de acuerdo a la estructura del gen N ultraconservado.

Metodologa
21

Seleccin de los participantes

Recoleccin de aspirados nasofarngeos (ANF)

Recoleccin de lavado bronquioalveolar (LBA)

Medicin de Urea

Procesamiento de muestras

Deteccin de hRSV

Medicin de citocinas en MAN y en MLB

Medicin de la carga viral libre

Tratamiento estadstico y tico

Tratamiento estadstico
22

Los anlisis estadsticos fueron llevados a cabo

utilizando el software SPSS v13.0.1.

Las caractersticas clnicas de los pacientes fueron

comparadas utilizando la chi cuadrada.

Los datos no paramtricos de las citosinas se

compararon mediante la U de Mann-Whitney

El valor de significancia fue p<0,05

tica
23

Cartas de consentimiento informado firmadas por

los padres.

Resultados
24

Caractersticas clnicas: 198 pacientes estudiados de los cuales se excluyeron 12 por presentar concentraciones de urea <0,1mm/l.

Caractersticas de los participantes

25

Resultados
26

Medicin de urea:

No se encontraron diferencias significativas entre la severidad de la enfermedad, por lo que se concluye que los niveles de urea se pueden considerar normales y no existen fallas renales.

Resultados
27

Medicin de citosinas

Resultados
28

Carga Viral 104 pacientes en rango de 4,3 X10 4 copias/ml y 2 X 1011 copias/ml

Las muestras se analizaron por duplicado

Resultados
29

Las bajas concentraciones de interfern y sustancia P

en los ANF, resultaron ser predictores independientes significativos de enfermedad severa y con necesidad de aplicacin de oxgeno suplementario.

Discusin
30

La enfermedad severa puede ser asociada a bajas

concentreaciones de interfern ysustancia P en las vas respiratorias.

Una

elevada carga viral, junto con una alta concentracin de IL-9, no implica diferencias entre las fases de la enfermedad.