PRODUCCIN DE PIGMENTOS POR CALLOS DE MAMMILLARIA CANDIDA SCHEIDWEILER (CACTACEAE)

INTRODUCCIN
Mxico es el pas con mayor riqueza y diversidad de cactceas en el mundo (Hernndez y Godnez, 1994). Sin embargo, su aprovechamiento industrial no ha excedido el mercado regional. Por ello, es conveniente implementar otras formas de obtener productos y sus derivados con alto valor agregado. El cultivo in vitro de cactceas es una alternativa para obtener compuestos, entre otros, los colorantes naturales.

INTRODUCCIN
El cultivo de tejidos se ha utilizado para obtener un gran nmero de metabolitos secundarios. La productividad de los cultivos puede incrementarse modificando las condiciones ambientales (temperatura, pH, luz), los componentes del medio (metales, sacarosa, aminocidos) o la densidad del inculo (Charlwood et al., 1990; Zhong y Yoshida, 1995; Luczkiewcz y Cisowski, 2001).

MATERIALES Y MTODOS
Los experimentos se realizaron en el laboratorio de Bioqumica, de la Facultad de Qumica, Universidad de San Luis Potos, Mxico. Se us el medio de Murashige y Skoog, MS (Murashige y Skoog, 1962) adicionado con mioinositol 116 M, tiamina-HCl 1.2 M y 30 g L1 de sacarosa. Para preparar el medio slido se aadieron 3.5 g L1 de Phytagel.

Despus de adicionar las auxinas y las citocininas el pH del medio se ajust a 5.7. Los medios se esterilizaron a 120 C por 20 min. Los callos y las suspensiones se mantuvieron a 25 C con fotoperiodo de 16 h de luz por 8 h de obscuridad.

Los callos se generaron en el medio MS con benciladenina 22.15 M y cido naftalenactico 5.37 M (Elas-Rocha et al., 1999). Se colocaron 3 g de tejido en medio MS con 3 mg L1 de cido 2, 4-diclorofenoxiactico (2,4-D), cido naftalenactico (ANA) o cido clorofenoxiactico (CFA), solos o en combinacin con 1 mg L1 de cinetina (C), cinetin ribsido (CR) o benciladenina (BAP).

Se midi el porcentaje de callos friables y pigmentados (ms de 50% de tejido pigmentado) despus de seis semanas.

El estrs abitico se indujo cultivando los callos en medio D3 con 50 g (50G), 100 g (100G) de glucosa, 50 g (50S) o 100 g (100S) de sacarosa L1. Para generar el estrs bitico se transfiri 1 g de callo a 10 ml de medio lquido 50G conteniendo 200 L de extracto del hongo Fusarium sp.

Los callos se mantuvieron con el potenciador durante 15 d. Fusarium se cultiv en agar-papa-dextrosa y se lis por adicin de 12 mL de Tris-HCl 200 mM, 0.2% de SDS, 1% de Triton X-100, pH 6.8 (amortiguador de extraccin, AE) por caja.

Despus de 15 min el extracto se centrifug a 4700 rpm por 30 min. La pastilla se resuspendi en 4 mL de AE y se congel a 10 C. La muestra someti a sonicacin tres veces (Sonicador Brown Sonic) 2 min y se centrifug a 4700 rpm por 30 min.

El sobrenadante se diluy con 2 mL de AE y se esteriliz en autoclave. En el extracto se midi el contenido de carbohidratos y se ajust la concentracin a un equivalente de glucosa de 5 mg mL1. Para extraer el pigmento se homogeneiz 1 g de callo en 20 mL de etanol-HCl 3 % (1:1) transfiriendo el material a tubos con tapn de rosca, que se agitaron a 1400 rpm por 24 h a 26C.

Como estndares se utilizaron betanina comercial (Warner Jenkinson) y un extracto de betabel purificado (Redibeets, Internatural Inc., lot No. 0760454). Se cuantific la absorbancia a 538 nm y 477 nm en los extractos etanlicos y en el medio de cultivo. El pigmento se analiz en un cromatgrafo de gases acoplado a un espectrmetro de masas (modelo HP 5890). Se us una columna de Ultra 1-metil silicn y helio como gas acarreador.

Se compararon los cromatogramas con los datos de un banco de datos de una biblioteca qumica Wiley 138.L (2 Wiley NBS LB, National Bureau of Standards Library No. G1035A) y NIST 98 (National Institute of Standards and Technology 98). Para el anlisis de los datos se utiliz un diseo completamente al azar, y stos se sometieron a un anlisis de varianza y a la prueba de Tukey (p0.05). Se emple el programa Instat 2 (Graphpad software Tm, V2.02) para comparar las medias de los datos.

RESULTADOS Y DISCUSIN

Efecto de las auxinas y las citocininas sobre la formacin de pigmentos

Los callos de M. candida se transfirieron a medios con 3 mg L de ANA (N3), CFA (C3) 2, 4-D (D3) para determinar el tipo de auxina que indujera los callos ms friables y pigmentados. Aproximadamente 80% de los callos mantenidos en medios con auxinas fueron friables y pigmentados en comparacin con los cultivados en el medio MS (20%).

No se presentaron diferencias entre las auxinas (p>0.05) y, en general, los callos fueron moderadamente pigmentados. Dado que los callos presentaron mejor aspecto en el medio con 2,4-D, se utiliz ste para propagar el material. La friabilidad fue similar en los medios con citocininas; sin embargo, la pigmentacin fue menor.

Las citocininas tuvieron un efecto antagnico, ya que su adicin al medio redujo la sntesis del pigmento. La adicin de auxinas indujo la sntesis del transcrito p48h-10 a las 24 h; sin embargo, en presencia de citocininas se observ un retraso en la transcripcin del ARNm.

INDUCCIN DEL PIGMENTO POR ESTRS

BITICO Y ABITICO Para inducir mayor pigmentacin en los callos, se indujo estrs osmtico aumentando la concentracin de glucosa o sacarosa en el medio. As, se espera que un aumento en la concentracin de azcares genere un incremento proporcional en la biomasa o en los metabolitos.

para inducir un estrs osmtico se utiliz el medio D3 con 30 gL1 (testigo), 50 g L1 o 100 gL1 de sacarosa o con 50 gL1 o 100 g L1 de glucosa. No se observaron diferencias estadsticas (p>0.05) en cuanto a la friabilidad de los callos en los medios con diferente fuente de carbono

Se calcul la relacin 538/477 nm en el medio (pigmento liberado) y en los extractos etanlicos (pigmento en el tejido). La cantidad de pigmento liberado al medio en presencia de 2, 4-D, en los medios con altas concentraciones de glucosa y con glucosa-potenciador fue tres, siete y nueve veces mayores, respectivamente, en comparacin con el medio MS No hubo diferencias entre los medios 50G y 100G (p>0.05). La cantidad de pigmento liberado del tejido por extraccin alcohlica fue superior en los callos mantenidos en medios conglucosa y potenciador

ANLISIS DEL PIGMENTO

El anlisis del extracto mostr la presencia de un pico a 300 nm que tambin estuvo presente en el estndar de betanina y en el extracto de betabel

Nuestros datos indican que las tres muestras contienen betalanas aciladas. La betanina y el extracto de betabel presentaron el pico a 533 nm (caracterstico de betacianinas). El extracto de betabel present adems un pico a 474 nm, que corresponde a betaxantinas.

El pico a 420-450 nm en el extracto de M. candida podra corresponder a un derivado del cido betlamico. Para tratar de dilucidar la estructura qumica del pigmento se analiz el extracto por cromatografa de gases-masas

Los compuestos fenlicos en plantas son precursores de una gran cantidad de metabolitos, entre ellos los pigmentos (Piatelli, 1976), por lo que es probable que el MPF sea precursor del cido betalmico. Adems, la correlacin obtenida para el pico 7.58 fue 33% y el mejor ajuste correspondi al razoxano

CONCLUSIONES
Se obtuvieron callos de M. candida cuatro veces ms pigmentados que el testigo modificando las condiciones de cultivo. Por tanto, el cultivo in vitro de cactceas puede ser una alternativa biotecnolgica para obtener productos de alto valor agregado (colorante natural en alimentos) sin deterioro del medio ambiente. Puesto que se ha descrito que las betalanas tienen actividad antiviral, ste podra ser otro uso del pigmento, con mucho potencial.