Universidad Nacional Pedro Ruiz Gallo

Facultad De Medicina Humana

SEMINARIO DE GENTICA
TEMA : Mtodos de diagnostico gentico de enfermedades genticas Dr. Jorge Ortiz Millones
Burga Cueva, Jonathan Javier. Cabanillas Ventura Jorge Carrin Arcela Fiorela Daz Mino Marlon Zuiga Callacn Gustavo

DOCENTE:

ALUMNOS:

La gentica clnica toma parte de todas las aplicaciones de la gentica en la parte mdica. Por tanto, incluye los estudios de la herencia de las enfermedades en las familias, el mapeo de los genes patolgicos en sus localizaciones especificas en los cromosomas, el anlisis de los mecanismos moleculares mediante los cuales los genes provocan la enfermedad, y el diagnostico y el tratamiento de la enfermedad gnica. Por el rpido progreso de la gentica molecular, se utilizan mtodos de diagnostico gentico de enfermedades genticas. La gentica mdica tambin incluye el asesoramiento gentico, la informacin de informacin relativa a los riesgos, el pronstico y el tratamiento de sus pacientes y sus familias.

La medicina moderna est poniendo nfasis creciente en la importancia de la informacin y la gentica proporciona una base para el conocimiento de la constitucin biolgica fundamental del cuerpo, alcanzando con ella de una forma natural un conocimiento ms preciso del proceso patolgico y en muchos casos este conocimiento puede dar lugar a la prevencin real de la enfermedad, as como un tratamiento ms efectivo de esta.

Conocer que con los mtodos diagnostico gentico podramos: Ayudar la reproduccin ya que con estos mtodos tambin se podran seleccionar embriones ms adecuados. Evitar el nacimiento de nios con enfermedades, se pueden evitar enfermedades genticas como Hemofilia, Cncer, Sndrome De Down, etc.

Clasificacin de enfermedades complejas.

Identificar genes con expresin diferenciada.

Extraccin Resultados

Lquido Amnitico (14-16 semanas de gestacin) Anomalas genticas Defectos del tubo Neural Edad materna avanzada Problemas cromosmicos familiares Antecedentes de hijos con anom. genticas Abortos espontneos Triple marcador en suero materno positivo

Entre 7 y 10 das hbiles

Diagnosticar

Condiciones

Actualmente La HIBRIDIZACIN IN SITU FLUORESCENTE o FISH: permite evaluar clulas de lquido amnitico directamente sin cultivar (24-48 horas)

Extraccin

1 o 2 clulas de un embrin Micromanipulacin Realizar un pequeo orificio en la cubierta externa (zona pelcida). Introducir una micropipeta (35 micras) Aspirar la clula embrionaria La clula extrada es procesada para el anlisis gentico, y el embrin sigue su desarrollo normal

Tcnica Proceso

Extracci n Resultado Disponibles en 72 horas Evaluacin Evaluacin (Ultrasonido) (Ultrasoni

Sangre fetal, a travs del cordn umbilical (20 semanas de gestacin)

Tamao y estructuras del beb Cantidad de lquido amnitico Posicin de la placenta

Insercin de una aguja muy delgada a travs del abdomen materno hasta llegar al cordn umbilical

Proceso

Aplicable entre 8 y 12 semanas de gestacin

Diagnostico temprano

Sndrome de Down Trisomas 13 y 18 Sndrome de Turner y Klinefelter Anemia Falciforme Fibrosis Qustica Enfermedad de Tay-Sachs

Descarte temprano de enfermedades Resultados Disponibles en 2 semanas

De los embarazos reconocidos clnicamente

15 25%: terminan en aborto espontaneo (60% de los abortos son cromosmicamente ANORMALES)

Instancias Importantes:
Cuanto ms temprano es el aborto, mayor es la frecuencia de anomalas cromosmicas

Cuanto mayor es la edad materna, mayor es la frecuencia de abortos

espontneos y de anomalas cromosmicas El estudio de material de aborto permite identificar alteraciones cromosmicas heredables y contribuir as a futuros embarazos

Objetivo

Clulas en reproduccin de sangre comn (rigurosa asepsia): Linfocitos Se detiene en METAFASE(mx. condensacin) Evidencia bandas a lo largo de cada cromosoma, tienden a repetirse en forma constante (PATRN DE BANDAS)

Tcnica de Bandeo

Condiciones: Individuos con sospecha de anormalidades cromosmicas Parejas con prdidas mltiples, durante la gestacin Mujeres de corta estatura o amenorrea primaria Varones con esterilidad Pacientes con genitales ambiguos Pacientes con enfermedades hematolgicas

Realiza

Observacin de la presencia de GANANCIAS, PERDIDAS O FUSIONES en los genes

Semejante que el usado para sangre perifrica, excepto: NO ES NECESARIO ESTIMULAR LA DIVISIN (sus cells lo hacen regularmente) Hemopatas de alteracin caracterstica: t(9,22): en la leucemia mielide crnica t(15,17): en la leucemia aguda promieloctica

Cultivo

Diagnostico

Sub-unidades de cromosomas con propiedades diferentes de coloracin y periodos de replicacin diferente. Sensibles a la radiacin. Tipos: Bandas Q: quinacrina (colorante fluorescente que tie zonas intercalares. Son por tanto bandas intercalares. Bandas G: giemsa, son bandas intercalares. Estas bandas coinciden con las Q (son las mismas) aunque estas requieren de un tratamiento previo de proteasas. Bandas C: giemsa, se tien pero con un tratamiento previo de soluciones alcalinas y salinas. Son regiones que limitan con el centrmero. No desaparecen en la interfase porque estn formadas por heterocromatina constitutiva. Bandas R: se tien con naranja de acridina. Son bandas entre las Q y las G: Bandas N: giemsa, pero con tratamiento previo de impregnacin argntica, se dan en los telmeros. Bandas G y R y su relacin con la estructura y el enrollamiento del cromosoma.

Conjunto de tcnicas, para aislar un gen de un organismo, manipularlo e insertarlo en otro diferente . Finalidad: Lograr que un organismo produzca un protena que le sea totalmente extraa

Utilidad: La produccin a gran escala de protenas , por medio de una bacteria, levadura, csmido, etc; ejemplo: Insulina Humana producida por bacterias.
Pasos:

Corte de fragmentos de ADN ,mediante enzimas de restriccin, en el genoma humano. Insercin de los fragmentos en un VECTOR DE CLONACIN, unindolos usando ADN ligasas (Fago T4) Propagacin del nuevo fragmento recombinante dentro del husped

I.- INSERTO: Fragmento de ADN de otro organismo clonado en un vector. Es conseguido gracias a la Enzima de Restriccin, presenta extremos pegajosos: Se va a unir al plsmido de la bacteria.

II.- VECTOR: Molcula de ADN en la que se clona el gen o una secuencia de DNA inters; la molcula de DNA recombinante que resulta es capaz de replicarse en un husped determinado. III.- HUESPED: El organismo en el que se asla y crece una molcula de ADN recombinante, generalmente una cepa de bacteria E. Coli.

Son enzimas, presentes en muchas especies de bacterias, con carcter defensivo. Restringen el crecimiento de virus (ADN exgeno) parsitos de las bacterias (bacterifagos)

NOMENCLATURA: Trmino: ENDONUCLEASA DE RESTRICCIN, refiere a aquellas enzimas que pertenecen a un sistema de restriccin-modificacin. El nombre abreviado se deriva del organismo del que se ha aislado tal enzima, ejemplo: Eco (Escherichia coli) Sal (Streptomyces albus) Otras veces es necesario aadir la cepa de la que se extrae: Hinc (Hemophilus infleunzae cepa c) Hind (Hemophilus infleunzae cepa d)

Otras veces es necesario aadir el orden cronolgico de aislamiento: AccI y AccII (Acinetobacter calcoaceticus)

PROPIEDADES: Las enzimas de restriccin reconocen una secuencia especfica de bases de ADN que es palindrmica. Propiedades esenciales de estas secuencias: Posee un eje de simetra en cada hlice, lo cual hace que cada hlice tenga autocomplementeridad en su secuencia; as, ese segmento palindrmico puede escribirse en formato cruciforme. Pueden adoptar ms de una forma espacial cuando se encuentran en una molcula de ADN y en ciertas condiciones se su entorno.

MECANISMO DE ACCIN: 1. La EcoRI :constituida por dos subunidades simtricas, cada una de las cuales tienen un sitio de reconocimiento- secuencia especfica- y un sitio activo de corte (catlisis). 2. Cada subunidad lleva a cabo un corte (ruptura de una unin fosfodiester), -en conjunto se realizan dos cortes-, los que en el caso de la enzima EcoRI y de otras enzimas se realiza en diferentes niveles pero en forma simtrica. 3. Estos cortes dejan un fosfato sobre un C-5 y un hidroxilo en el sitio 3 del extremo de cada cara del corte. 4. Cada pedazo queda con un extremo colgante de cuatro nucletidos en una de las dos cadenas; son fundamentales porque permiten la unin especifica con un extremo complementario (llamado tambin extremo pegajoso por su afinidad por extremos similares). 5. Por lo cual, las enzimas de restriccin no solo cortan especficamente sino que adems dejan un puente especfico y articulado para repegarse cuando se agrega una ligasa.

CLASIFICACIN: I.- Tipo 1: Complejos multiprotecos, reconoce secuencia de ADN simtricas. Cortan y metilan el ADN, Requiere la presencia de ATP II.- Tipo 2: Son de mayor inters en la ingeniera gentica. Actuan en forma de dmeros, Su corte tiene lugar dentro de la misma secuencia de reconocimiento por la que se une al ADN. No requiere ATP y generamente deja extremos de corte pegajoso. III.- Tipo 3 especficas reconocido por Complejos multiproteicos que reconocen secuencias de ADN simtricas. Cortan el ADN en las cercanas del lugar la enzima pero poseen accin metilante y requieren ATP

Molcula de ADN , capaz de replicarse autnomamente dentro de un husped (clulas de levadura o bacterias), para luego ser aislado en forma pura y analizarlo. UTILIDAD: El ADN recombinante puede ser introducido en un husped bacteriano para la propagacin del fragmento insertado junto con la molcula vector. Plsmidos: Primeros vectores utilizados. Son elementos bacterianos extra cromosmicos, circulares, que se replican con independencia de la replicacin del cromosoma bacteriano. Permiten albergar insertos de unas 5 10 kilobases de tamao, como mximo.

Bacterifagos lambda: Es un vector derivado del genoma del bacterifago lambda. Este vector tiene una capacidad mayor a la de los plsmidos, permitiendo insertos de tamao entorno a las 15 kilobases. Csmidos: Son vectores artificiales con caractersticas de plsmidos y de fagos, y tienen una capacidad de unas 40 kilobases.

Cromosomas artificiales de la levadura (CAL): Son vectores derivados de los cromosomas de levaduras, incluyendo secuencias necesarias para la replicacin y la estabilidad de los brazos cromosmicos. Albergar insertos de hasta 2 megabases (2000 kilobases) Cromosomas artificiales del fago P1 (CAP) o del mismo cromosoma bacteriano (CAB): Crecen tambin dentro de bacterias y son capaces de albergar insertos de tamaos entre 100 150 kilobases.

CLONACIN DE ADN Y GENOTECAS

Clonacin de ADN: Los fragmentos de ADN producidos por enzimas de restriccin pueden ser vehiculizados en plasmados, fagos o CAL y por medio de cualquiera d esos vehculos o vectores es posible introducirlos en clulas (bacterianas o de levaduras) con el fin de multiplicarlos hasta obtenerlos en cantidades suficientes para estudiarlos.

Genotecas (biblioteca genmica): Son colecciones de fragmentos de ADN presentes en colecciones de plasmados o e fagos, que a su vez estn contenidas en cultivos bacterianos. Se considera que con 1/10 de mg de ADN es factible construir una genoteca genomita.

LA ERA DE LA INSULINA PRODUCIDA POR LA INGENIERA GENTICA El gen para la insulina, se introduce en clulas distintas a donde es producida en la naturaleza (en las clulas Beta del pncreas). Comnmente se emplean bacterias (siendo la ms usada E. coli) o levaduras, usando un plsmido o vector. Mediante control de las condiciones de crecimiento de estos microorganismos, los mismos pueden reproducirse en grandes cantidades y producir abundante cantidad de insulina recombinante. De esta manera las insulinas de origen animal prcticamente han desaparecido del mercado dando lugar a las insulinas recombinantes, constituyendo actualmente el 93 % de la demanda mundial.

La insulina fue el primer producto, derivado de la tecnologa de ADN recombinante, comercializado para salud humana. Despus de su comercializacin en 1982, la insulina humana recombinante ha reemplazado gradualmente a la insulina animal, siendo actualmente el tratamiento ms frecuente elegido en pacientes con diabetes insulinodependientes o con requerimientos de insulina.

Nomenclatura para cromosomas normales y aberraciones cromosmicas constitucionales

Los 46 cromosomas que posee el hombre estn como 23 pares. Los primeros 22 pares estn etiquetados de ms largos a ms cortos. El ltimo par es llamado el cromosoma del sexo etiquetado X Y.

Si un cromosoma o pieza de un cromosoma se pierde o se duplica hay prdidas o ganancia de genes respectivamente. Los cromosomas necesitan estar teidos para ser vistos con un microscopio. Cuando estn teidos los cromosomas se ven como cadenas con bandas claras y oscuras. Cada brazo del cromosoma es definido adems por el nmero de bandas, el nmero ms alto, el rea ms alejada del centrmero.

Nomenclatura:

En la descripcin del cariotipo, se registra el nmero de

cromosomas (incluidos los sexuales) seguido de una coma, luego de la cual se escriben los cromosomas sexuales. Si existen aberraciones numricas o estructurales de los autosomas, stas se escriben a continuacin, luego de otra coma. Ejemplos: 46,XX cariotipo femenino normal

46,XY cariotipo masculino normal.

Aberraciones
Aberraciones numricas: Son aquellas en las que se altera el nmero de cromosomas propio de la especie. Si el nmero de cromosomas de ese ncleo es un mltiplo del nmero haploide (23), la aberracin es euploide. Si no lo es, la aberracin es aneuploide. 69, XXY cariotipo anormal, con 69 cromosomas, 2 cromosomas X y 1 cromosoma Y (triploide). 47,XXY cariotipo masculino anormal, con cuarenta y siete cromosomas, dos cromosomas X y un cromosoma. 47,XY,+21 cariotipo masculino anormal con 47 cromosomas y un cromosoma 21 adicional, el signo (+) o (-) delante del nmero del autosoma indica ganacia o perdida de ese cromosoma completo.

Aberraciones estructurales: Son aquellas en que uno o ms cromosomas cambian su estructura propia por la adicin o prdida de material gentico. Por ejemplo:

46, XX, del (1) (q24q31) Mujer con una delecin del cromosoma 1 en el brazo largo (q) entre las bandas q24 y q31

*
es un proceso por el cual se combinan dos cadenas de cidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una nica molcula de doble cadena, que toma la estructura de doble hlice, donde las bases nitrogenadas quedan ocultas en el interior.

* La hlice de doble cadena (ADN) es separada mediante un proceso

fsico (calor) o qumico (con una base fuerte, como la sosa custica), esto rompe los enlaces por puente de hidrgeno que mantienen unidas las dos hebras del ADN. se desnaturaliza.

* Las dos hebras complementarias se separan, el ADN

* Una muestra de cadenas simples (o desnaturalizadas) se mezcla
con otra muestra de cadenas simples.

* La muestra combinada se enfra lentamente, las molculas sencillas

se van emparejando por las zonas complementarias (ms estables termodinmicamente) y se va formando una nueva molcula hibridada.

*Existen diferentes tcnicas que emplean la separacin

en gel por electroforesis como primer paso para identificar la presencia de determinadas molculas dentro de una muestra. Una de ellas fue inventada por Edward M. Southern en 1975 para la deteccin de ADN. Una vez finalizada la corrida en el gel, se realiza la transferencia (o blotting) de las muestras a una membrana para su posterior revelado. Luego se utiliz el mismo sistema para detectar ARN y se lo denomin Northern Blot (en clara alusin al nombre del cientfico inventor de la tcnica basada en ADN).

TCNICA DE TRANSFERENCIA DE SOUTHERN

* Extraccin del ADN * Digestin del ADN con una endonucleasa de

restriccin * Electroforesis en gel de agarosa * Preparacin de un ensayo de Southern ("Southern blot") * Hibridacin con sonda radiactiva * Deteccin de los RFLPs mediante autorradiografa * Reensayar el resultado del Southern con sondas adicionales

TCNICA DE TRANSFERENCIA DE SOUTHERN

TCNICA DE TRANSFERENCIA DE NORTHERN

El segundo mtodo, tipo northern o northern blot, se utiliza para identificar las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda; a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el mtodo northern sirve para identificar ARN. Una tcnica de laboratorio que se utiliza para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son complementarias a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.

TCNICA DE TRANSFERENCIA DE WESTERN

El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla compleja de protenas, como un extracto tisular)

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)

*es una tcnica que consiste en la amplificacin in vitro

de un fragmento de ADN especfico

*se trata de replicar una y otra vez un mismo fragmento

de ADN y, para ello, debemos realizar in vitro lo que hacen las clulas in vivo para replicar su ADN.

*
* La muestra se calienta a aproximadamente una temperatura de 92
C

la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucletidos

* una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio

comprendido entre ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde hacia el extremo 3 prima utilizando nucletidos libres.

Consiste en la deteccion de las alteraciones o variaciones de la constitucion genetica de un individuo relacionadas con estados patologicos

*Se realiza mediante

el estudio de los cambios que produce una mutacion en la estructura primaria .

*Tambien en las propiedades fisico quimicos de la

molecula del ADN .

*O en los Cambios en

el producto genico.

* Las

mutaciones por deleccion son facilmente detectadas por PCR .

* Un ejemplo de este tipo es en la aplicacion de la distrofia

muscular de Duchenme (PCR mltiple ).

*Esta mutacin

es producida por la expansin de unidades de repeticin de tres nucletidos.

*Este tipo de mutacin presenta 3 caractersticas :

La repeticin es polimrfica . El numero de repeticiones puede variar de

generacin en generacin . Existe una fuerte correlacin entre el nmero de repeticiones y distintos parmetros clnicos .

*Se fundamenta en la HERENCIA conunta del locus de

la enfermedad estudiada.

*Caractersticas : La unidad de estudio

la familia . Su aplicacin durante los perodos prenatal o neonatal facilita a los padres una informacion fiable que les permita una buena respuesta terapeutica. en el diagnostico gentico es

ANLISIS INDIRECTO: RFLP y vntr

USO DE LAS LLAMADAS ENZIMAS DE RESTRICCIN

Por medio de la tcnica de electroforesis se separan fragmentos de ADN, que son cortados de manera especficas por estas enzimas

POLIMORFISMOS DE LONGITUD DE LOS FRAGMENTOS DE RESTRICCIN

Secuencias especficas de nucletidos en el ADN que son reconocidas y cortadas por las enzimas de restriccin conocidas tambin como endonucleasas de restriccin y que varan entre individuos.

Las secuencias de restriccin presentan usualmente patrones de distancia, longitud y disposicin diferentes en el ADN de diferentes individuos de una poblacin, por lo que se dice que la poblacin es polimrfica para estos fragmentos de restriccin.

METODOLOGA
1. 2.
El ADN de un individuo se extrae y se purifica.

El ADN purificado puede ser amplificado usando la tcnica molecular Reaccin en cadena de la polimerasa o PCR El ADN es tratado con enzimas de restriccin especficas para producir fragmentos de ADN de diferentes longitudes. Los fragmentos de restriccin se separan mediante electroforesis en geles de agarosa.

3.
4.

Aplicaciones
Herramienta fundamental en el mapeo genmico y el anlisis de enfermedades genticas. El anlisis RFLP fue tambin la base de las modernas tcnicas de anlisis de huellas genticas (Genetic Fingerprinting analysis en ingls), tiles en la identificacin de muestras recuperadas de la escena de un crimen, en pruebas de paternidad, y en el estudio de la biodiversidad en poblaciones animales.

NMERO VARIABLE DE REPETICIONES EN TNDEM

Del ingls Variable Number of Tandem Repeats y ms conocidas por el acrnimo VNTR o minisatlites. Son repeticiones de secuencias de 9 a 100 pares de bases que se utilizan como marcador molecular.

Deteccin

La deteccin de los VNTR se puede realizar por hibridacin de ADN o por tcnicas de PCR.

Ventajas y desventajas
Los VNTR tienen la ventaja de ser marcadores multipunto, es decir, que adems de explorar el polimorfismo en la longitud de los fragmentos de restriccin en cada locus hipervariable, utilizan tambin el polimorfismo en el nmero y distribucin de estos loci a lo largo del genoma, posibilitando as la visualizacin simultnea de diversas regiones del mismo. Las limitaciones para esta tcnica, son las mismas que presentan los RFLP.

Dado el avance de la ciencia gentica, hoy es posible, gracias a los diversos mtodos y tcnicas de estudio citogentico, diagnosticar y reducir los riesgos de nacimientos de nios con nncer, hemofilia, sndromes, etc. Con los aportes de la citogentica es posible mejorar la calidad de vida de pacientes, con la produccin en masa de ciertas protenas, como es el caso de la Insulina producida por bacterias, para los pacientes con Diabetes Tipo I Se pueden determinar y salvar embarazos futuros, gracias a los estudios de enfermedades hereditarias y el mejoramiento del material gentico. Se logr establecer estudios de la expresin de diversos genes con las Tcnicas de Southern, Northern y Western Blot.

GRACIAS