La esterificacin selectiva de fitosteroles de madera representa una aplicacin novedosa de las lipasas, que es para el proceso de produccin de pulpa

o pasta de celulosa. Qu son los fitosteroles de madera?

-sitosterol y -sitostanol (como son muy similares, su separacin se hace complicada por medio fsico, as que la esterificacin selectiva de esta mezcla con esteres de cidos grasos es una opcin para separarlas)

Se evaluaron diversas lipasas comerciales de su capacidad de esterificar selectivamente los estanoles, seleccionndose una enzima inmovilizada y una no soportada.

Se optimiz el proceso con la enzima inmovilizada y la inmovilizada comercial tuvo baja estabilidad operacional debido a la desorcin de la protena.

Lipasas, son enzimas que catalizan hidrolisis de acilgliceroles conformados por cidos grasos de cadena larga, que actan preferentemente en interacciones agua-aceite.

Datos importantes:

Catalizar en medios de baja actividad de agua Enzimas dotadas para actuar en ambientes no convencionales Tienen propiedades variadas en cuanto pH, termo resistencia.

LIPASAS FUNGALES

LIPASAS BACTERIANAS

Candida rugosa Candida antarctica Thermomyces lanuginosus Rhizomucor miehei

Burkholderia cepacia Pseudomonas alcaligenes Pseudomonas mendocina Chromobacterium viscosum

Las lipasas estn ampliamente distribuidas en la naturaleza Estas se encuentran comercialmente disponibles tanto en forma libre como en inmovilizada

Esquema del proceso de revalorizacin del jabn de licor negro. El recuadro muestra el proceso de obtencin de la mezcla de esteroles y estanoles de madera

Los esteroles de madera ofrecen algunas ventajas respecto los esteroles de soya, tanto en disponibilidad y composicin. Composicin media de la mezcla de esteroles y estanoles en fitosteroles de madera y de soya.

MATERIALES

MTODOS

Lipasas QL y QLG -QL: Alcaligenes sp. -QLG: inmovilizado en tierra de diatomeas granulada Glioxil agarose u polietilenimina-glioxil agarose

La protena fue determinada por mtodo de Bradford. La actividad de la enzima libre e inmovilizada se determin mediante el mtodo Fukuda

Mtodo Fukuda: por medio de la velocidad inicial de hidrolisis de p-nitrofenil acetato mediante cuantificacion espectrofotometrica a 320 nm de p-nitrofenol producido.

Pretratamiento de la lipasa de Alacaligenes sp. PL-266 con NaIO4

Soportes empleados:

Las reacciones de transesterificacin se llevaron a acabo en un reactor Eurostar de 2 L con agitacin a 200 rpm. Los fitosteroles de madera se disolvieron en los esteres de cidos grasos. Se tomaron muestras luego de 30h de reaccin. Lavado con hexano, y secado a temperatura ambiente.

Determinacin del porcentaje de recuperacin y su actividad.

Proceso de transesterificacin enzimtica.

Diferentes preparados de lipasas comerciales disponibles fueron caracterizados en su capacidad de catalizar la reaccin de transesterificacin.
Considerando mas de un 80% de los estanoles presentes y menos de un 30% de los esteroles.

Luego evaluar la capacidad de transesterificacin selectiva.

Metil y etil Esteres de acidos grasos de:

Coco Girasol Raps (colza)

Gramos de esteres de estanoles producidos por unidad de volumen d reaccin y de tiempo.

La reaccin de esterificacion fue en medio anhidro. El sustrato actu como solvente. Todo debe ser en vaco para remover el alcohol.

Mejor resultado: Metil esteres de aceite de raps

Se realiz un diseo experimental considerando las variables y los rangos de trabajo

Objetivo: optimizar la productividad especifica.

Se obtuvo un 93% de esterificacion de estanoles y un 23% de esterificacin de esteroles.

Resultados parecidos se obtuvieron con la lipasa Alcaligenes sp (QL), de 88% y 20%

Desafortunadamente la estabilidad operacional de la enzima fue muy baja, habiendo una desorcin de casi 90%, en el primer lote.

Se intent lo mismo con la inmovilizada pero el resultado fue parecido. Es necesario recuperar la enzima econmicamente hablando.

Primero se evaluaron diversos sistemas de inmovilizacin.

Membrana hidrofobica

Lipasa QL inmovilizada en butil Sepabeads una carga de 1,75 mg proteina/g fue seleccionada como el biocatalizador mas adecuado para realizar la reaccin de transesterificacin, por tener la mayor actividad especifica a un rendimiento de inmovilizacin aun bastante alto.

Se seleccionaron dos lipasas (Alcaligenes sp.) Se obtuvieron conversiones de estanoles. superiores al 90% con conversiones de esteroles en torno al 20%, lo que satisfizo ampliamente el criterio de selectividad establecido.

La enzima inmovilizada exhibi una baja estabilidad debido a la desorcin de la protena Ha sido presentada una patente de invencin referida al proceso de elaboracin del biocatalizador obteniendo por inmovilizacin de la lipasa a Alcaligene sp PL-266 a una membrana hidrofbico.