Introduccin a la Biologa Molecular y Celular. Primer parcial 2012. 19/05/12 Nombre y apellido: L.U.

N: Turno de seminario: P1: /9 P2: /10 P3: /10 P4: /16 P5 = /10 Total /55

Problema 1 (55 puntos). Basado en resultados an no publicados del laboratorio de Robert Singer. En el proceso de traduccin eucaritica, la subunidad menor del ribosoma (40S) reconoce al cap del mRNA y rpidamente lo escanea de 5 a 3 hasta encontrar el primer AUG. Entonces se acopla la subunidad mayor (60S) y el ribosoma empieza a traducir leyendo nucletidos de a 3 (tripletes o codones). En su camino, el ribosoma desplaza toda protena que se encuentre unida al mRNA. Para estudiar este proceso se construy un plsmido de expresin en clulas eucariotas, cuyo inserto se muestra en la Fig. 1. ATG Figura 1 TAG

Enhancer 1

+1

E1

I1

E2

I2

E3

I3

E4

Datos: - El exn 3 es alternativo en varios tipos celulares pero en las clulas hepticas se incluye totalmente en el mRNA maduro. - E1 = 200 pb - I1 = 1500 pb - E2 = 100 pb - I2 = 2000 pb - E3 = 150 pb - I3 = 800 pb - E4 = 250 pb - La A del ATG est ubicada en la posicin +1740 del gen. - La T del TAG est ubicada en la posicin +4810 del gen. Ro debajo de este TAG no hay ningn otro codn STOP.

Pregunta 1 (9 puntos) Proporcione los siguientes datos, mostrando los correspondientes clculos: a. Longitud del transcripto primario (en nucletidos). b. Longitud del RNA mensajero (en nucletidos) en hgado. c. Peso molecular (PM) del polipptido codificado en hgado (en Daltons, considerando el PM promedio de 1 aminocido igual a 110 Daltons). Sigue el problema. El polipptido codificado por el gen de la Fig. 1 no tiene una funcin relevante a los fines del problema. Lo que importa es que al gen de la figura se le han incorporado artificialmente por ingeniera gentica dos secuencias (esquematizadas en rayado y en negro), provenientes de genomas de bacterifagos, es decir, que no existen en ningn mRNA celular ni procariota ni eucariota. La presencia de estas secuencias le confiere al RNA codificado por este gen la propiedad de unirse a protenas fluorescentes de distinto color. La secuencia rayada es capaz de unirse especficamente a una protena fluorescente verde (PFV) y la secuencia negra es capaz de unirse especficamente a una protena fluorescente roja (PFR). La emisin de luz de color (fluorescencia) de cada una de stas slo se observa cuando estn unidas a la secuencia de RNA correspondiente. Cuando PFV y PFR estn unidas a sus respectivas secuencias blanco en la misma molcula de mRNA, en lugar de slo verde o slo rojo, se observa una fluorescencia de color amarillo, resultante de la combinacin de ambas fluorescencias (Fig. 2).
Fluorescencia observada CAP Figura 2 CAP CAP AUG AUG AUG
PFV

UAG UAG UAG

PFR PFR

(A)n (A)n (A)n

NINGUNA ROJA VERDE AMARILLA

CAP

AUG

PFV

UAG

(A)n

La transcripcin del gen de la Fig. 1 est bajo el control del enhancer del gen de la 1 antitripsina, una protena que se expresa slo en clulas hepticas. Se dispone de dos lneas celulares humanas, una de origen heptico y otra de origen neuronal. A ambas lneas se las modific genticamente de modo de que expresen simultneamente y constitutivamente las protenas PFV y PFR que difunden rpidamente tanto en el citoplasma como en el ncleo. Pregunta 2 (10 puntos) Cuando se transfecta la lnea neuronal con el plsmido de la Fig. 1, no se observa fluorescencia ni en el ncleo ni en el citoplasma mientras que la transfeccin en la lnea heptica muestra fluorescencia en ambos compartimentos. Qu tiene la lnea heptica o qu le falta a la lnea neuronal para explicar estos resultados? Pregunta 3 (10 puntos) En la transfeccin en la lnea heptica se observa una fuerte fluorescencia amarilla en el ncleo y una marcada fluorescencia roja en el citoplasma (Tabla 1, experimento 1). En cambio, si se tratan las clulas con el inhibidor de la traduccin cicloheximida, slo se observa fluorescencia amarilla tanto en el ncleo como en el citoplasma (Tabla 1, experimento 2). Explique el por qu de ambos resultados. Pregunta 4 (16 puntos) Complete la Tabla 1 y justifique sus respuestas para cada uno de los tratamientos de los experimentos 3 al 6 (los experimentos 1 y 2 ya fueron explicados en la pregunta anterior). En todos los casos las clulas hepticas que expresan PFV y PFR fueron transfectadas con el plsmido de la Fig. 1.
Experimento 1 2 3 4 5 Tratamiento Ninguno Agregado de cicloheximida (inhibe traduccin) Agregado de actinomicina D (inhibe transcripcin) Co-transfeccin con un plsmido que expresa un tRNA supresor cuyo anticodn es 3 AUC 5 Co-transfeccin con un plsmido que expresa microRNA (miRNA) que se aparea a una secuencia de la regin 3 no codificante del mRNA de RFP e inhibe totalmente su traduccin. Co-transfeccin con un plsmido que expresa un factor de splicing que provoca la exclusin total del exn 3 del mRNA maduro. Fluorescencia en ncleo S/No Color S AMARILLO S AMARILLO Fluorescencia en citoplasma S/No Color S ROJO S AMARILLO

Pregunta 5 (10 puntos) Observara fluorescencia, y en caso afirmativo de qu color, en bacterias Escherichia coli modificadas genticamente para expresar constitutivamente PFV y PFR, transformadas con: 5.1 el plsmido de la Fig. 1? 5.2 un plsmido similar al de la Fig. 1 pero en el que se reemplaz el promotor y enhancer eucariticos por un promotor procaritico y donde la secuencia rayada se sac del exn 3 y se la puso en el intrn 2? La construccin no tiene secuencia de Shine-Dalgarno (sitio de unin al ribosoma). Justifique

Introduccin a la Biologa Molecular y Celular. Primer parcial 2012. 19/05/12 Nombre y apellido: L.U.N: Turno de seminario:

P1: /12

P2: /5

P3: /5

P4: /6

P5: /6

P6: /6

P7: = /5

Total /45

Problema 2 (45 puntos). Basado en los pioneros trabajos de Arthur Kornberg (1918-2007; premio Nobel 1959) y sus continuadores. La replicacin del DNA es un proceso clave en todos los organismos porque garantiza la continuidad de la informacin gentica a travs de las generaciones de manera fiel y rpida, antes de cada divisin celular. Por ejemplo, en E. coli, la replicacin es realizada por la DNA Polimerasa III, que es una protena con estructura cuaternaria compuesta por 15 subunidades de 10 tipos diferentes, llamada holoenzima, que realiza la mayora (pero no todas) de las actividades enzimticas necesarias para el proceso in vivo. En el laboratorio de Arthur Kornberg se ha logrado purificar la holoenzima completa, as como cada una de las subunidades que pudieron separarse entre s mediante tratamiento con urea solamente. La Tabla 1 indica los pesos moleculares (PM) de los diferentes tipos de subunidades, separadas por electroforesis en gel de poliacrilamida con SDS: Subunidad PM (kDa) 27 10 71 12 15 Tabla 1 La subunidad contiene el sitio activo de la actividad polimerasa propiamente dicha; a la se la conoce como agarradera deslizante, o clamp en ingls, porque a manera de anillo, enhebra a la hebra molde y asegura procesividad (elongacin); la aporta la actividad de 3-5 exonucleasa; y las dems subunidades aportan roles estructurales, asociando a otras entre s. El PM de la holoenzima completa purificada, estimado por tamiz molecular (Sephadex), es 701 kDa. Si se reconstituye la holoenzima a partir de sus subunidades, pero omitiendo , la subunidad queda incluida en un oligmero de apenas 206 kDa, mantenindose la actividad de polimerasa in vitro y su fidelidad. Pregunta 1 (12 puntos) Cul de los dos modelos de estructura cuaternaria de la holoenzima representados en la Fig. 1 es consistente con todos los datos, el A o el B? Fundamente su respuesta. Subunidad PM (kDa) 132 37 52 35 33

'

MODELO B

'

MODELO A

Figura 1 Pregunta 2 (5 puntos) En base al enunciado, qu tipos de uniones qumicas mantienen asociadas a las subunidades de la holoenzima de E. coli descriptas por Kornberg? Hay uniones disulfuro entre ellas?

Sigue el problema Por otra parte, los procariotas termfilos Thermus aquaticus (Taq) y Pyrococcus furiosus (Pfu), contienen una DNA polimerasa similar a la DNA pol III de E. coli, pero con ciertas diferencias estructurales y funcionales, cuya subunidad cataltica tambin se llama . Con la intencin de entender algunas de esas diferencias, se hicieron 2 tipos de experimentos: 1. Replicacin de DNA in vitro a 37 C usando un molde de DNA de cadena simple, un primer complementario al mismo, desoxirribonuclesidos trifosfato (dNTPs) y Mg2+. 2. Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) usando un molde de DNA de cadena doble, primers adecuados, dNTPs y Mg2+, con 30 ciclos de 95C, 72C y 65C cada uno. En cada uno de los dos tipos de experimento se usaron distintas fuentes de DNA polimerasa purificada, segn se indica en la Tabla 1: REPLICACIN DE DNA IN VITRO Hebra complementaria Frecuencia de al molde error* de la sintetizada sntesis de DNA -6 S 10 NO -6 S 10 -4 S 10 4 S 10-6 S 10 PCR Producto de PCR fabricado

Exp. 1 2 3 4 5 6 7 8

Enzima usada

holoenzima de E. coli NO holoenzima de E. coli sin NO holoenzima de E. coli sin NO holoenzima de E. coli sin NO Subunidad de Taq S Subunidad de Pfu S Subunidad de Pfu mutada -4 en uno de sus aminocidos S S 10 -6 Subunidad de Pfu preS NO 10 tratada con mercaptoetanol -6 *10 = 1 mutacin cada milln de nucletidos incorporados -4 10 = 1 mutacin cada 10.000 nucletidos incorporados
Tabla 1

Pregunta 3 (5 puntos) Por qu no fue necesario agregar helicasa y los 4 ribonuclesidos trifosfato (rNTPs), que son necesarios para la replicacin del DNA in vivo, para el experimento de replicacin del DNA in vitro. Justifique. Pregunta 4 (6 puntos) Como se mencion, el oligmero de 206 kDa que incluye una subunidad preserva la actividad de polimerasa y su fidelidad slo in vitro (experimento 3 de la Tabla). Por qu la duplicacin del DNA in vivo requiere de la holoenzima completa conteniendo las 2 subunidades ? Justifique. Pregunta 5 (6 puntos) En base a los datos de la Tabla 1, qu diferencias en cuanto a la actividad 3- 5 exonucleasa existen entre las subunidades de E. coli, Pfu y Taq? Fundamente su razonamiento, aclarando la implicancia biolgica de dicha actividad. Pregunta 6 (6 puntos) Interprete los resultados del experimento 8. Pregunta 7 (5 puntos) Ser viable un cultivo de E. coli knockout para el gen que codifica a ? Y otro knockout para ? Justifique.