El nombre siRNA son las siglas en ingls de small interfering RNA, en espaol ARN pequeo de interferencia o ARN de silenciamiento.

Es un tipo de ARN interferente con una longitud de 20 a 25 nucletidos que es altamente especfico para la secuencia de nucletidos de su ARN mensajero diana, interfiriendo por ello con la expresin del gen respectivo. Interviene en el mecanismo denominado interferencia de ARN (RNA interference, RNAi), donde el siRNA interfiere con la expresin de un gen especfico, reducindola. Adems, los siRNAs tambin actan en otras rutas relacionadas con el RNAi, como en la defensa antiviral o en la organizacin de la estructura de la cromatina en un genoma. La complejidad de estas rutas es el objeto de intensos estudios, y su descubrimiento fue la razn por la cual Craig C. Mello y Andrew Fire recibieron el Premio Nobel de Fisiologa o Medicina 2006.

Protena DICER de Giardia intestinalis. El ARN interferente pequeo o ARN pequeo de interferencia (ARNip o siRNA, del ingls small interfering RNA) es una clase de ARN bicatenario Contenido 1 Definicin y modo de funcionamiento 2 Descubrimiento 2.1 PTGS en plantas 2.2 La tecnologa anti-sense en gusanos 2.3 Prueba de la existencia de los siRNAs 2.4 Los componentes del mecanismo de RNAi 2.4.1 Identificacin de Dicer 2.4.2 El complejo RISC

3 Mecanismo de interferencia de ARN (RNAi) mediado por siRNAs 3.1 RNAi transitivo por amplificacin de la seal 3.2 Relacin entre la dosis de ARN y la respuesta fenotpica 3.3 RNAi mediado por siRNAs: resumen 4 Ensamblaje de heterocromatina mediante RNAi en S. pombe 5 Utilizacin en el laboratorio 5.1 Herramientas para el silenciamiento de genes 5.2 RNAi en mamferos 5.3 siRNAs y shRNAs 5.4 Efectos inespecficos (off-target) 6 Aplicaciones 6.1 Silenciamiento de genes ("knockdown") 6.2 Genmica funcional 6.3 Medicina 6.4 Biotecnologa 7 Referencias 8 Bibliografa 9 Enlaces externos [editar] Definicin y modo de funcionamiento Los siRNAs son molculas de ARN doble hebra de 20-21 nucletidos (nt) perfectamente complementarias, que se originan a partir de un ARN largo de doble hebra (dsRNA, double strand RNA). Los dsRNAs pueden ser de origen endgeno (por ejemplo los trnscritos generados a partir de secuencias de ADN repetidas en tndem), o de origen exgeno (como virus o transgenes). La enzima responsable del procesamiento del dsRNA en molculas de siRNAs es Dicer, una enzima citoplsmica de la familia ARNasa III, que procesa el dsRNA en fragmentos de ARN doble hebra con extremos 5' fosfato y 2 nucletidos libres con extremo hidroxilo (-OH) en 3'. Los siRNAs suprimen la expresin de los genes diana mediante el corte del ARN mensajero (ARNm) complementario en dos mitades, a travs de la interaccin de la hebra antisentido del siRNA con el

complejo RISC (RNA-induced silencing complex). Las dos mitades del ARNm son posteriormente degradadas por la maquinaria celular, lo que conlleva la supresin de la expresin del gen. Por otro lado, los siRNAs promueven la modificacin del ADN, facilitando el silenciamiento de la cromatina, puesto que favorecen la expansin de los segmentos de heterocromatina, a travs del complejo RITS (RNA-induced transcriptional silencing). [editar] Descubrimiento [editar] PTGS en plantas

Ejemplo de plantas de petunia en las que los genes responsables de la pigmentacin han sido silenciados mediante RNAi. La planta de la izquierda es de tipo salvaje (no modificada); las de la derecha expresan un transgn (gen introducido artificialmente) que induce la supresin de la expresin del transgn y el gen endgeno, produciendo reas blancas no pigmentadas en la flor. El mecanismo de interferencia de ARN (RNAi) se observ por primera vez en plantas como parte del silenciamiento post-transcripcional de genes (PTGS). Investigadores que trataban de introducir transgenes en petunias para conseguir flores de un color violeta ms intenso, obtuvieron flores con zonas blancas, lo que indicaba que tanto los transgenes introducidos como los genes endgenos haban sido silenciados. Este efecto se denomin co-supresin, y se observ que poda inducirse por: la expresin de un transgn en altos niveles transgenes que se expresan en niveles menores, pero que se integran en el genoma de la planta en copias mltiples por secuencias homlogas a un gen endgeno que se han introducido mediante un virus Por esta razn, se supuso que ste era un mecanismo de defensa en las plantas, de forma que stas responden a la infeccin de los retrovirus mediante la destruccin de los ARN virales. Sin embargo, el mecanismo de accin era desconocido. [editar] La tecnologa anti-sense en gusanos

Un gusano adulto C. elegans, que ha crecido bajo supresin mediante RNAi de un receptor hormonal nuclear implicado en la regulacin de la enzima desaturasa. Estos gusanos tienen un metabolismo de cidos grasos anormal, pero son viables y frtiles. Por otro lado, los investigadores que trabajaban en la dcada de los 90 en el gusano C. elegans, inyectaban ARN-antisense en las gnadas del gusano para tratar de interferir con la expresin de los genes, puesto que pensaban que el ARN-antisense se apareara con el ARNm (sense), evitando de esta forma la traduccin del ARNm y suprimiendo la expresin del gen objetivo. Sin embargo, Guo y Kemphues, observaron que la inyeccin de ARN-sense en el gusano era igualmente eficaz que el ARN-antisense para la supresin de la expresin gnica. Pero no podan explicar por qu razn. En 1998, Andrew Fire, Craig C. Mello y colaboradores publicaron un trabajo en Nature, en el cual indicaban que, si inyectaban slo ARN de hebra simple en el gusano, tanto sense como antisense, no se observaba ningn efecto. Sin embargo, si inyectaban ARN doble hebra (dsRNA), observaban la supresin especfica del gen objetivo. Esto puede parecer contradictorio con los resultados de Guo y Kemphues, pero estos inyectaron ARN de hebra simple (sense o antisense) que no haba sido purificado, de forma que en el proceso de produccin se producen segmentos de doble hebra, que son los que generan la supresin observada por Guo y Kemphues. Sin embargo, Fire y Mello utilizaron ARN purificado, que no contiene dsRNA y por tanto es inactivo. Cuando las hebras sense y antisense se aparean para producir dsRNA, el efecto de supresin es 100 veces mayor al observado con las hebras simples por separado. Asimismo, en el mismo reporte, Fire y Mello establecieron que la interferencia de la expresin del gen objetivo se produce a nivel del ARNm: cuando inyectaron en gusanos dsRNA contra el gen mex-3, detectaron que el ARNm de mex-3 desaparece, y por tanto los gusanos no son viables. Sin embargo, cuando inyectaban ARN de hebra simple (sense o antisense) contra mex-3, la mayor parte del ARNm de mex-3 permaneca intacto, y por ello no se observa fenotipo. Igualmente, tambin establecieron que el efecto de supresin slo ocurre si el dsRNA que se introduce en el gusano es complementaria de una regin codificante (exones), pero no si es complementaria de una regin no codificante (intrones o el promotor). Esto indica que la interferencia se produce a nivel del ARNm, cuando ya se han eliminado los intrones del pre-ARNm, y por tanto es un mecanismo post-transcripcional.

Inicialmente los dsRNAs se inyectaban en las gnadas de los gusanos, pero tambin pueden ser inyectados en el intestino o en la cabeza. Incluso se observa efecto cuando los gusanos son alimentados con cepas de E. coli portadoras de un plsmido a partir del cual se transcribe el dsRNA. En este caso el efecto es un poco ms dbil, pero todava evidente. En todos los casos el efecto sobre la expresin del gen diana se observa no slo en el tejido inyectado, sino en la mayora de los tejidos, lo que indica que la seal puede transmitirse de una clula a otra. [editar] Prueba de la existencia de los siRNAs Una vez que estuvo claro que el mecanismo de RNAi acta directamente sobre el ARNm, permaneca una importante cuestin: qu es lo que causaba la degradacin del ARNm? Los experimentos descritos a continuacin explican cmo se descubrieron los siRNAs. Para explicar la co-supresin observada en plantas, se propuso la existencia de ARNs anti-sense, que mediante apareamiento de bases con el ARNm diana, de alguna manera promoveran la degradacin del ARNm o interferiran con la traduccin del mismo. Sin embargo, en las clulas afectadas no se detectaron ARNs anti-sense que tuvieran el tamao de los ARNm, de manera que los investigadores analizaron si en las plantas transgnicas afectadas aparecan molculas de ARN de menor tamao. En uno de estos experimentos, realizado por Hamilton y Baulcombe en 1999, se analiz la presencia de pequeos ARNs en cinco lneas de plantas de tomate, que haban sido transformadas con un plsmido que codificaba para ACO (aminocyclopropane-carboxylate oxidase). En dos de las lneas analizadas la expresin del ARNm de ACO haba sido suprimida, y consecuentemente el ARNm no se detectaba en Northern blots. Para detectar la posible presencia de ARN pequeos se utilizaron geles de Northern blot con mayor concentracin de poliacrilamida, utilizando como sonda trnscritos sense o anti-sense. Slo en las plantas en las que la expresin de ACO haba sido suprimida se detectaron ARNs de aproximadamente 25 nt con ambas sondas, pero no se detectaron en las plantas en las que el ARNm de ACO estaba an presente. Por tanto, se demostr la presencia de los pequeos ARN propuestos, en plantas en las que la expresin de ACO estaba afectada. Con experimentos similares se demostr que plantas infectadas con virus tambin contienen pequeos ARNs con secuencias virales. Es importante notar que estos pequeos ARNs no son productos de la degradacin del ARNm, porque se encontraron no slo molculas sense, sino tambin anti-sense.

Un ejemplar adulto de la mosca Drosophila, un organismo modelo utilizado frecuentemente en experimentos de RNAi. Para estudiar en ms profundidad el mecanismo de RNAi, se utilizaron sistemas in vitro. En 2000, Phil Zamore, Tom Tuschl y colaboradores desarrollaron un sistema in vitro para estudiar embriones de Drosophila. El grupo de Greg Hannon desarroll otro sistema in vitro, utilizando extractos de clulas de Drosophila en cultivo. Zamore, Tuschl y colaboradores fueron los primeros en mostrar que el ARNm incubado en un extracto se degrada en presencia de dsRNA. Para ello, aadieron al extracto dos ARNm modelo que codifican para protenas luciferasa de 2 especies diferentes (Drosophila no codifica la protena luciferasa). Cuando se aadi al extracto dsRNA contra el ARNm de luciferasa, el ARNm fue degradado eficientemente. Cuando se aadi ARN antisense, slo se degrad una pequea cantidad del ARNm, y la adicin de tampn nicamente (control negativo) no produjo ningn efecto. Estos resultados son similares a los obtenidos en los experimentos in vivo con C.elegans, donde se demostr que los dsRNAs son mucho ms eficientes que el ARN antisense en la produccin de un efecto de RNAi. En otro experimento, Zamore, Tuschl y colaboradores comprobaron si los dsRNAs son procesados en pequeos fragmentos de ~25 nt (como ocurre en plantas). En este experimento, dsRNAs marcados radiactivamente bien en la hebra sense, en la antisense o en las dos, se incubaron en los extractos de Drosophila en presencia o ausencia de ARNm. Cuando los dsRNA se incubaron en el extracto, aparecieron fragmentos de 21 a 23 nts, independientemente de la presencia de ARNm, indicando que los pequeos ARNs proceden del dsRNA y no del ARNm. Este experimento mostraba adems que ambas hebras del dsRNA (la sense y la antisense) se cortan en pequeos fragmentos, porque los fragmentos aparecen tanto cuando los dsRNAs han sido marcados slo en la hebra sense, como cuando has sido marcados slo en la antisense. Este experimento muestra que los dsRNAs incubados en el extracto son procesados en pequeos fragmentos de ~21-22 nts. Este resultado es similar al resultado en plantas mencionado anteriormente.

Por tanto, la conclusin de los estudios precedentes es que fragmentos de dsRNA (introducidos en las plantas o aadidos a los extractos) son degradados en fragmentos de ~21-25 nts, que son capaces de reconocer el ARNm diana presente en la planta o en el extracto, induciendo a su vez la degradacin de ste. [editar] Los componentes del mecanismo de RNAi

La enzima Dicer corta ARN doble hebra y genera siRNAs o miRNAs. Estos ARN pequeos se incorporan en el complejo RISC (RNA-induced silencing complex), dirigindolo contra el ARNm complementario, y bien lo corta (siRNAs), bien inhibe su traduccin (miRNAs). Estudios posteriores permitieron elucidar con ms detalle el mecanismo de RNAi. Cuando se introducen en un organismo (por ejemplo, en plantas tras la infeccin con un virus de ARN, o simplemente inyectando dsRNA en plantas o nemtodos), el ARN exgeno es reconocido por la clula y unido a una enzima llamada Dicer, que contiene diferentes dominios. Dicer corta el dsRNA en fragmentos de alrededor de 22 nts. Estos pequeos dsRNAs (siRNAs) se incorporan en un complejo con mltiples componentes, denominado RISC (RNA-induced silencing complex). El complejo RISC tiene que ser activado (RISC*) a partir de una forma latente, mediante el desapareamiento de las dos hebras de los siRNAs. RISC* utiliza la hebra antisentido del siRNA como gua para seleccionar su substrato: el ARNm complementario de la hebra de siRNA presente en el complejo. A continuacin, RISC* promueve el corte y posterior destruccin del ARNm diana, provocando la supresin de la expresin del gen (en la imagen de la derecha, el mecanismo que utilizan los siRNAs corresponde a la parte central e izquierda). [editar] Identificacin de Dicer Artculo principal: Dicer.

La siguiente cuestin que necesitaba resolverse era identificar la enzima ribonucleasa (ARNasa) involucrada en la fragmentacin de los dsRNAs. Puesto que se haban purificado previamente los fragmentos de la degradacin (los siRNAs), se saba que la enzima tena que ser capaz de producir fragmentos con grupos 5' fosfato y 3' hidroxilo, lo cual reduca el nmero de candidatos: en concreto, las ARNasas de la familia de la ARNasa III fragmentan dsRNAs de esta forma. Se conocan tres tipos de ARNasa III: ARNasa III cannica (E. coli): 1 motivo ARNasaIII y 1 dsRBD (en ingls, double strand RNA binding domain) Drosha: 2 motivos ARNasa III y 1 dsRBD Dicer: 2 motivos ARNAsa III, 1 dominio helicasa y 1 dsRBD Para probar cul de estas ARNasas poda degradar dsRNA en fragmentos de ~22 nt, en 2001 Bernstein y colaboradores expresaron en clulas S2 de Drosophila todas las protenas candidatas como protenas marcadas con una etiqueta (como GST, glutathione S-transferase). Las protenas fueron purificadas con un anticuerpo dirigido contra la etiqueta e incubadas con un dsRNA dirigido contra ciclina E. El resultado de este experimento mostr que slo Dicer es capaz de cortar el dsRNA largo en fragmentos pequeos. Las otras ARNasas no fragmentaron el dsRNA. Como control negativo se utiliz la protena "homeless", para probar si el dominio helicasa de Dicer podra estar implicado en la reaccin. Adems el experimento prob que la reaccin precisa ATP. Para poder unirse a las molculas de dsRNA, Dicer necesita formar un complejo con otras protenas que la asisten en sus funciones, como la protena R2D2 en Drosophila o RDE-4 y RDE-1 en C.elegans. [editar] El complejo RISC

Izquierda: Una protena Argonauta completa de la especie Pyrococcus furiosus de la familia de las archaea. Derecha: El dominio PIWI de una protena Argonauta en complejo con ARN doble hebra. Los siRNAs generados por Dicer se ensamblan en el complejo RISC (siglas en ingls de RNA-induced silencing complex) que contiene diferentes factores celulares. El componente activo del complejo RISC es una protena de la familia de las endonucleasas denominadas Argonautas, que cortan la hebra de ARNm diana complementaria al siRNA que est

asociado a RISC. Como los fragmentos producidos por Dicer son de doble hebra, en teora ambas hebras podran producir un siRNA funcional. Sin embargo, slo una de las dos hebras (la antisense), denominada la hebra gua, se une a la protena Argonauta y dirige el proceso de degradacin del ARNm complementario. La otra hebra (la sense), denominada hebra pasajera, es degradada durante el proceso de activacin de RISC. Aunque en principio se supuso que una helicasa dependiente de ATP separaba ambas hebras , en realidad el proceso es independiente de ATP y realizado directamente por protenas que componen el complejo RISC. La hebra seleccionada como gua tiende a ser aquella cuyo extremo 5' se aparea menos con su complementaria, aunque la seleccin de la hebra gua no resulta afectada por la direccin en la que Dicer corta el dsRNA antes de su incorporacin al complejo RISC. Sin embargo, la protena R2D2 podra servir como el factor identificador, al unirse al extremo 5' ms estable de la hebra pasajera. Aunque existen diferentes protenas de la familia Argonauta (Ago1, Ago2, Ago3 en mamferos), slo Ago2 puede formar complejos RISC capaces de fragmentar el ARNm diana. En el mismo estudio, se demostr asimismo que Ago2 es capaz de cortar el ARNm diana in vitro en presencia de un siRNA de hebra simple, pero no de un dsRNA, y que la reaccin es independiente de ATP. Asimismo, se identificaron dos residuos de Ago2 necesarios para la actividad enzimtica: D597 y D669. La base estructural para la unin del ARN a la protena Ago2 ha sido examinada mediante cristalografa de rayos X de la unin del dominio estructural de una protena Argonauta unida a ARN. En este estudio, el extremo 5' fosforilado de la hebra de ARN se introduce en una hendidura de superficie bsica conservada (presente en protenas homlogas de diferentes especies) y hace contacto a travs de un catin divalente (un tomo con dos cargas positivas) como el magnesio, y por apilamiento aromtico (un proceso que permite a ms de un tomo compartir un electrn, pasndolo adelante y atrs) entre el nucletido 5' en el siRNA y un residuo conservado de tirosina. Se piensa que este sitio forma un sitio de nucleacin para la unin del siRNA a su ARNm complementario. Todava no est claro cmo el complejo RISC activado localiza los ARNm complementarios en el interior celular. Aunque se ha propuesto que el proceso de fragmentacin podra estar ligado a la traduccin, la traduccin del ARNm diana no es esencial para la degradacin mediada por RNAi. De hecho, el proceso de RNAi puede ser ms efectivo contra ARNm dianas que no son traducidos. Las protenas Argonauta, los componentes catalticos de RISC, estn localizadas en regiones especficas del citoplasma denominadas P-bodies (cuerpos-P, tambin cuerpos citoplsmicos o cuerpos GW, porque contienen la protena GW182), los cuales son regiones con altas tasas de degradacin de ARNm; tambin se ha detectado actividad miRNA en los P-bodies. Alteracin de los P-bodies disminuye la eficiencia del proceso de RNAi, lo que sugera que los P-bodies podran ser un lugar crtico para el proceso de RNAi. Sin embargo, estudios posteriores han demostrado que los P-bodies no son imprescindibles para el proceso de RNAi, puesto que clulas sin P-bodies pueden producir silenciamiento tanto con siRNAs como con miRNAs.

[editar] Mecanismo de interferencia de ARN (RNAi) mediado por siRNAs El mecanismo de RNAi se inicia cuando una clula recibe un ARN de doble hebra largo (dsRNA), que puede generarse a partir de un transgn exgeno, un intruso viral o un elemento gentico propio. Este dsRNA largo se fragmenta en siRNAs por una enzima denominada Dicer. Un complejo de silenciamiento inducido por ARN (el complejo RISC) selecciona entre ambas hebras del siRNA: la hebra sense (pasajera) se degrada, mientras que la antisense (gua) se utiliza para localizar el ARNm complementario, y puede tener distintos destinos segn el organismo. En Drosophila y en mamferos, la hebra antisense se incorpora directamente en el complejo RISC para identificar el mRNA complementario, que ser destruido. En ausencia de siRNAs, el complejo RISC carece de especificidad para unirse a ninguna molcula de ARNm. Pero cuando se une a la hebra gua del siRNA, el complejo RISC (ahora activado) puede participar en repetidos ciclos de degradacin especfica del ARNm diana, produciendo el silenciamiento de la expresin del gen correspondiente. En la mayor parte de los casos, la supresin no es completa, por lo que produce una reduccin de la expresin, denominada knock-down. En plantas y en gusanos, despus de que Dicer haya procesado el dsRNA originario, la hebra antisense de los siRNAs (primarios) se utiliza en un proceso de amplificacin. La hebra antisense, unida a una ARN polimerasa-dependiente de ARN (RdRP, del ingls RNA-dependent RNA polymerase), puede aparearse con un ARNm complementario, y actuar como punto de inicio para la sntesis de una nueva molcula larga de dsRNA. Dicer acta entonces sobre ste dsRNA, fragmentndolo para generar nuevas molculas de siRNA (secundarias), que son especficas para diferentes secuencias del mismo ARNm, generando un efecto de amplificacin. Tambin en este caso, el ARNm unido a siRNAs es destruido, produciendo el silenciamiento (knock-down) del gen correspondiente. Esta amplificacin en plantas y gusanos permite que el efecto de silenciamiento producido por RNAi se extienda a travs de los tejidos somticos, no reproductivos, por transferencia de dsRNAs directa de clula a clula, generando una amplia resistencia a las infecciones virales. [editar] RNAi transitivo por amplificacin de la seal Otro descubrimiento sorprendente fue el realizado por Hannon en 2002. Cuando se introduca en C. elegans un transgn que contena una molcula GFP fusionada al gen UNC-22 (un gen responsable de la coordinacin motora), seguido de una inyeccin de dsRNA contra GFP, el resultado era diferente segn la posicin de la molcula GFP con respecto a UNC-22 en el transgn: si la molcula GFP estaba unida delante de UNC-22 (GFP--UNC22), los gusanos de la progenie eran blancos, pero normales si la molcula de GFP estaba unida detrs de UNC-22 (UNC-22--GFP), los gusanos de la progenie eran blancos, y adems presentaban fenotipo unc-22 mutante: descoordinacin motora

La explicacin a este fenmeno se debe a la presencia en gusanos de la enzima ARN polimerasadependiente de ARN (RdRP), que usa como cebador la hebra antisense de los siRNAs generados a partir del dsRNA contra GFP inyectado (primarios), para la produccin de un ARN-antisense largo. Como la enzima RdRP slo sintetiza ARN en direccin 3'-5', cuando el transgn es UNC-22--GFP, los siRNAs se unen a la molcula de GFP, y amplifican un ARN que contiene ambos genes, UNC-22 y GFP. Este ARN puede aparear con el ARNm del transgn UNC-22--GFP o con el ARNm UNC-22 endgeno del gusano, de forma que al ser fragmentado por Dicer, se generan siRNAs secundarios tanto contra GFP como contra UNC-22, lo que produce el silenciamiento de ambos genes: los gusanos de la progenie son, por tanto blancos (por silenciamiento de GFP) y con descoordinacin motora (fenotipo mutante unc-22). Sin embargo, cuando el transgn presente es GFP--UNC-22, los siRNAs primarios se unen a GFP y el ARN-antisense largo que se genera slo incluye la molcula de GFP. Esta molcula slo se puede aparear con el transgn GFP--UNC-22, pero no con el ARNm UNC-22 endgeno. Por ello, tras la accin de Dicer slo se generan siRNAs secundarios contra GFP, de manera que los gusanos de la progenie son blancos (por silenciamiento de GFP), pero normales, porque UNC-22 se expresa a partir del gen endgeno. [editar] Relacin entre la dosis de ARN y la respuesta fenotpica La relacin entre la dosis de ARN y el fenotipo se analiz mediante la inyeccin de una serie de diferentes concentraciones de ARN de hebra simple o doble en C. elegans. Utilizando la concentracin ms elevada de los ARN sense y antisense individuales contra el gen UNC-22 (3,6 millones de molculas por gnada) se observ fenotipo mutante en, respectivamente, el 1% y el 11% de los descendientes. La inyeccin de dosis comparables de ARN de doble hebra produjo, sin embargo, fenotipo mutante en el 100% de los descendientes. Por tanto, la inyeccin de ARN de doble hebra es al menos 100 veces ms eficaz produciendo RNAi que la inyeccin de ARN de hebra simple. En otro experimento, se observ que la inyeccin de 60.000 (sesenta mil) molculas de cada hebra de ARN por gusano adulto provocaba el fenotipo mutante en alrededor de 100 descendientes. La expresin de UNC-22 comienza en el embrin cuando ste consta de unas 500 clulas. En este momento, el material inyectado se diluye hasta solamente algunas molculas de ARN doble hebra por clula. Este resultado sugiri que el ARN doble hebra funciona de una manera cataltica y no estequiomtrica, puesto que unas pocas molculas de ARN doble hebra pueden inducir RNAi. Tambin indicaba que existen etapas de amplificacin en el mecanismo de RNAi. [editar] RNAi mediado por siRNAs: resumen En las clulas, un dsRNA largo (inyectado, procedente de un virus...) es fragmentado por Dicer, que genera fragmentos cortos de dsRNA (los siRNAs). La hebra antisense se incorpora al complejo RISC, activndolo. Este complejo identifica el ARNm homlogo del siRNA, cortndolo en dos mitades que son despus degradadas por la maquinaria celular.

Por tanto, el mecanismo de RNAi mediado por siRNAs suprime la expresin gnica a nivel posttrancripcional (puesto que la molcula diana es el ARNm), de manera especfica a la secuencia. Los resultados de este tipo de supresin son similares (a veces idnticos) a los fenotipos de los mutantes nulos: la supresin puede producir una reduccin significativa (knock-down) o completa (knock-out) de los niveles de la protena diana. La supresin gnica (tambin llamada silenciamiento) realizada por los siRNAs es extremadamente especfica, y slo afecta al ARNm homlogo (aunque con siRNAs sintticos pueden producise efectos inespecficos, denominados efectos off-target; ver ms adelante). En plantas, el RNAi se denomina "silenciamiento gnico post-transcripcional" (PTGS, del ingls post-transcriptional gene silencing), mientras que en Neurospora (un hongo tambin utilizado como organismo modelo) se denomina quelling. Estos mecanismos permiten la defensa contra la invasin virca o de elementos transponibles. Los efectos sistmicos probablemente se explican por el pequeo tamao de los siRNAs, que pueden pasar de una clula a otra. La amplificacin de la seal que se observa en ciertos organismos (plantas, C. elegans) resulta de un mecanismo por el cual los siRNAs antisense se aparean al ARNm homlogo y funcionan como cebador para la transcripcin de un ARN antisense por una ARN-polimerasa dependiente de ARN (RdRP), que se aparea con el ARNm homlogo y da lugar, tras la accin de Dicer, a la aparicin de siRNAs secundarios. [editar] Ensamblaje de heterocromatina mediante RNAi en S. pombe Schizosaccharomyces pombe (la levadura de fisin) es una levadura ampliamente utilizada en estudios genticos como organismo modelo (por ejemplo, es el organismo en el que Paul Nurse realiz los estudios sobre el ciclo celular que le permitieron obtener el Premio Nobel de Fisiologa o Medicina en 2001). A diferencia con Saccharomyces cerevisiae (la levadura del pan, tambin muy utilizada en estudios genticos), que tiene pequeos centrmeros puntuales de unos 100bp, S. pombe tiene centrmeros ms largos (40-100kb), con secuencias repetitivas, similares a los centrmeros de mamferos. Los elementos repetitivos que rodean al centrmero (cen) son transcritos en S. pombe para producir cenRNAs no-codificantes. Estas secuencias repetitivas y los cenRNAs atraen enzimas Histona Metil-Transferasa (HTMasas, de las siglas en ingls) tipo H3K9 (metilan la lisina9 de la histona H3), protenas HP1 y otros complejos que median la formacin de heterocromatina. La portena HP1 recluta cohesinas para promover la cohesin de las cromtidas hermanas en los centrmeros. Los nucleosomas asociados con regiones de heterocromatina presentan metilacin H3K9 y estn hipoacetilados (es decir, presentan pocos grupos acetilo -CO-CH3 asociados), mientras que los nucleosomas de las regiones de eucromatina portan metilacin en H3K4 (en lisina4 de la histona H3) y estn hiperacetilados. Las regiones heterocromticas de los telmeros y

otras regiones cromosmicas comparten muchas propiedades con la heterocromatina centromrica. En S. pombe, se han identificado algunos componentes de la maquinaria de RNAi asociados a la generacin de heterocromatina centromrica: un complejo similar al RISC, denominado RITS (del ingls RNA-induced transcriptional silencing) el complejo RDRC (RNA-directed RNA polymerase complex) Dicer ARC, un complejo que funciona como chaperona de la protena Ago1 y que contiene siRNA duplex (doble hebra) el complejo CLRC, que contiene la histona metil-transferasa en H3K9 denominada Clr4, necesario para la metilacin de los nucleosomas en H3K9 y para la generacin de siRNAs El modelo de trnscrito naciente propone que el complejo RITS interviene en la formacin de heterocromatina, asocindose con los trnscritos nacientes a travs del apareamiento de bases con los siRNAs de hebra simple presentes en el complejo, adems de asociarse con los grupos metilo H3K9 de los nucleosomas a travs del dominio cromo de su subunidad Chp1. La sntesis de dsRNA y generacin de siRNAs ocurre en asociacin con regiones cromosmicas especficas y esto puede ser la causa de la restriccin en cis (es decir, en la misma molcula de ADN donde se genera) del silenciamiento mediado por siRNAs. El circuito de sntesis de siRNA asociado a los cromosomas es esencial para la difusin de la metilacin en H3K9 y el silenciamiento en los centrmeros. El acoplamienteo del circuito de sntesis de siRNAs con la metilacin en H3K9 forma un circuito de retroalimentacin (feedback loop) que mantiene la heterocromatina de manera epigentica. Por el momento (2008), el papel de los cenRNAs no codificantes en el ensamblaje de la heterocromatina centromrica slo se ha demostrado en S. pombe, aunque algunos componentes del mecanismo de RNAi contribuyen al silenciamiento de genes en las zonas pericentromricas en Drosophila melanogaster. [editar] Utilizacin en el laboratorio [editar] Herramientas para el silenciamiento de genes Los tipos de herramientas que se utilizan para obtener RNAi en el laboratorio son diferentes segn los organismos: En C. elegans se utilizan dsRNAs largos, que pueden introducirse en los gusanos : por microinyeccin (en las gnadas, en la cabeza o en el intestino) sumergiendo los gusanos en una solucin que contenga los dsRNAS

alimentndolos con cepas de E. coli portadoras de un plsmido a partir del cual se transcribe el dsRNA. En Drosophila melanogaster se utilizan tambin dsRNAs largos, que pueden: inyectarse en los embriones introducirse en forma de transgenes que expresan una horquilla de dsRNA en el caso de clulas de Drosophila en cultivo, el dsRNA puede aadirse directamente al medio de cultivo, de donde lo absorbern las clulas En plantas, se puede: sobreexpresar un dsRNA o una horquilla de dsRNA a partir de un transgn sobreexpresar un ARN de hebra simple a partir de un transgn o un virus para provocar la cosupresin En mamferos: en clulas embrionarias en cultivo, ovocitos o embriones precoces, se puede transfectar o inyectar dsRNA en clulas diferenciadas en cultivo o en animales (in vivo), se puede: transfectar o inyectar molculas de siRNA sintticos transfectar un plsmido, un lentivirus (un vector generado a partir de una versin desactivada del VIH) u otro vector viral que exprese una horquilla que contenga los siRNAs. [editar] RNAi en mamferos Aunque las molculas de dsRNA pueden inducir RNAi especfico en embriones tempranos de ratn y en ovocitos de ratn, en clulas somticas de mamferos los dsRNAs tambin activan muchas rutas celulares, algunas de las cuales pueden producir apoptosis. La protena kinasa dependiente de dsRNA (PKR) es un importante "detector" antiviral, que se activa al unirse a dsRNAs largos, como los producidos por los virus. Una vez que se activa PKR, sta inhibe la traduccin de protenas a travs de la fosforilacin de una de las subunidades del factor de iniciacin de la traduccin (EIF2). La fosforilacin de EIF2 produce una supresin general de la sntesis proteica que dirige a la clula hacia la apoptosis. PKR tambin activa las enzimas 2',5'OligoA sintetasa y ARNasa L, que son componentes centrales de una importante va antiviral. Cuando se unen a los dsRNAs, la 2',5'-OligoA sintetasa se activa, generando oligo-adenilatos que activan la ARNasa L, que a su vez degrada el ARN. Los dsRNAs tambin pueden inducir la expresin de interfern que, conjuntamente con otras seales, pueden estimular la apoptosis.

Sin embargo, en 2001, Thomas Tuschl y sus colegas demostraron que siRNAs sintticos de tamao inferior a 30pb son capaces de inducir RNAi en clulas de mamfero sin activar las vas de PKR e interfern, un trabajo que fue publicado en Nature. Este descubrimiento suscit un gran inters en la utilizacin de la tcnica de RNAi para investigacin biomdica y desarrollo de nuevos frmacos. [editar] siRNAs y shRNAs Como se indica en el punto "Herramientas para el silenciamiento de genes", en el caso de clulas somticas de mamferos se pueden introducir bien directamente siRNAs sintticos o bien un plsmido (o un vector viral) que contenga una horquilla que exprese el siRNA. En este segundo caso se habla de expresin de "shRNAs" (siglas en ingls de short hairpin RNA), que son procesados por la enzima Dicer para generar siRNAs funcionales (ver miRNAs). Los siRNAs son molculas de dsRNA de alrededor de 22 nts, con un grupo fosfato en el extremo 5' y un grupo hidroxilo en el extremo 3'. El corte del ARNm diana se produce a nivel de la posicin 10 a 11 a partir del extremo 5' de los nucletidos apareados (no se produce ningn otro corte fuera de sta zona), y el corte del ARNm es ms eficiente si en sus extremos 3' los siRNAs presentan de 2 a 3 nucletidos libres. Asimismo, la eficacia del siRNA depende de la accesibilidad de la zona de apareamiento en el ARNm diana: la presencia de estructuras secundarias en dicha zona del ARNm o la unin de protenas en esa zona puede impedir la unin del siRNA, disminuyendo su eficacia.

En la actualidad, existen muchos algoritmos disponibles para el diseo de siRNAs, tanto comerciales en empresas especializadas (Dharmacon [35], Ambion [36], Qiagen [37], Invitrogen [38], Sigma [39], etc.) como en entornos acadmicos (ver tambin la pgina web de Nature sobre RNAi [40]). Los siRNAs sintticos pueden obtenerse de diversas formas: pueden ser sintetizados qumicamente por empresas especializadas (como Dharmacon, Ambion, Sigma, etc.); presentan la ventaja para el investigador de su facilidad de utilizacin, la rapidez en la obtencin (algunos das), as como su homogeneidad y pureza; el inconveniente es el coste. pueden ser sintetizados in vitro por el propio investigador utilizando ARN polimerasa T7; ms econmico, pero los siRNAs obtenidos son menos homogneos, lo que puede producir una menor eficacia. pueden obtenerse por fragmentacin de dsRNAs sintetizados in vitro, utilizando ARNasa III purificada ("esiRNAs"); tambin es ms econmico, pero el resultado es menos homogneo.

Las molculas de siRNA o shRNA se introducen en las clulas mediante tcnicas de transfeccin. Es interesante destacar que la ruta del RNAi se puede modular extracelularmente utilizando molculas qumicas pequeas. En un estudio publicado en agosto de 2008, se desarroll un ensayo basado en clulas para monitorizar la actividad de la ruta del RNAi, y los autores detectaron que la molcula enoxacin (Penetrex) mejora la degradacin del ARNm mediada por siRNA, y promueve la biognesis de los miRNAs endgenos. Este artculo prueba que pequeas molculas qumicas pueden mejorar la eficacia de la ruta del RNAi, lo que podra ser til en el desarrollo de herramientas para la investigacin y teraputicas. [editar] Efectos inespecficos (off-target) Los siRNAs (y los shRNAs) pueden producir una reduccin no intencionada de la expresin de ciertos genes cuya secuencia es prxima a la del siRNA, por corte del ARNm correspondiente o por la inhibicin de su traduccin. Los efectos off-target pueden aparecer si los siRNAs imitan el reconocimiento del ARNm diana por los microRNA. Estos efectos inespecficos pueden reducirse mediante la modificacin qumica del segundo residuo de la hebra activa del siRNA (que es muy importante para la actividad del microRNA) sin afectar al silenciamiento del ARNm diana especfico. La prediccin de los efectos off-target no es muy til por el momento, pero durante el proceso de diseo es necesario eliminar todos los siRNAs que presenten una similitud significativa a molculas de ARNm no deseadas, mediante la utilizacin de BLAST [41]. Asimismo es aconsejable utilizar una concentracin de siRNAs en el medio de transfeccin inferior a 100 micromolar, puesto que por encima de dicho valor, aumenta la probabilidad de obtener efectos inespecficos. Por esta razn, es ms sencillo controlar la aparicin de efectos off-target con siRNAs sintticos (puesto que se puede controlar su concentracin en el medio de cultivo) que con shRNAs, puesto que en este caso el nivel de expresin (que depende del tipo de promotor utilizado) puede variar mucho de clula a clula. [editar] Aplicaciones La especificidad y la robustez del efecto de RNAi sobre la expresin gnica hace de este mecanismo una valiosa herramienta en investigacin, tanto en cultivos celulares como en organismos vivos, puesto que dsRNAs o siRNAs sintticos o transgnicos pueden introducirse en las clulas para inducir el silenciamiento selectivo de genes especficos de inters. Esto ha permitido un avance espectacular en el desarrollo de la biologa celular, puesto que el RNAi es una herramienta simple y rpida para la comprensin de la funcin de los genes (a pesar de que en ltimo trmino es conveniente desarrollar el organismo knockout para asegurar la consistencia de los resultados). La tcnica de RNAi en el laboratorio tambin puede utilizarse para silenciar sistemticamente cada uno de los genes de la clula (anlisis genmico), lo que puede ayudar a identificar los componentes necesarios para un proceso celular en particular, como la divisin celular o las vas

de sealizacin, por ejemplo. De hecho, en la actualidad existen colecciones a gran escala de RNAi de mamferos disponibles pblicamente, tanto en empresas comerciales (Dharmacon, Ambion, Qiagen o Sigma, ver links en el apartado "siRNAs y shRNAs") como en instituciones acadmicas (de ratn o de humano: [42], [43], [44]). Por otro lado, la explotacin de la va de RNAi es tambin una herramienta prometedora en biotecnologa y medicina. Como comparacin en la generacin de modelos animales para el estudio de enfermedades: la obtencin de una lnea de ratones knockout puede precisar aos, aunque una vez obtenidos, se pueden mantener indefinidamente, mediante cruces la obtencin de una lnea de ratones transgnicos para RNAi (a los que se les ha introducido un vector que exprese una molcula de siRNA para silenciar un gen especfico, de forma constitutiva o condicional), puede conseguirse en meses, y tambin pueden mantenerse indefinidamente, mediante cruces por otro lado, se pueden inyectar localmente molculas de siRNA (por ejemplo en la retina), lo cual puede realizarse en un tiempo corto (semanas), y puede mantenerse durante meses o indefinidamente (si los siRNAs se introducen en forma de vectores virales) o bien durante algunas semanas (si se utilizan siRNAs sintticos) finalmente, los siRNAs se pueden inyectar de forma sistmica (en el sistema circulatorio), y como en el caso anterior, pueden mantenerse durante semanas, meses o indefinidamente, segn la forma en la que se introduzcan en el organismo. [editar] Silenciamiento de genes ("knockdown") La ruta del RNAi se utiliza a menudo en biologa molecular y celular para estudiar la funcin de los genes en cultivos celulares e in vivo en organismos modelo. Para ello, se sintetiza dsRNA (o siRNAs/shRNAs en mamferos) con una secuencia complementaria a la del gen de inters y se introduce en una clula u organismo, donde se reconoce como material gentico extrao, lo que activa la ruta del RNAi. Utilizando este mecanismo, los investigadores pueden producir una reduccin drstica en la expresin del gen diana. Estudiando los efectos de esta disminucin se pueden dilucidar las funciones fisiolgicas del producto de ese gen (la protena correspondiente). Puesto que el RNAi puede no bloquear completamente la expresin del gen de inters, normalmente suele referirse a esta tcnica como "knockdown", para distinguirla de los procedimientos de "knockout" en la que la expresin del gen es completamente suprimida. [editar] Genmica funcional La mayora de las aplicaciones de RNAi en genmica funcional en animales han utilizado C. elegans y Drosophila, puesto que estos son los organismos modelo en los que el mecanismo de RNAi es ms efectivo. C. elegans es particularmente til para la investigacin con RNAi por dos razones: primero, los efectos de silenciamiento de genes son normalmente heredables, y segundo, porque

la administracin de dsRNA es extremadamente simple (ver Herramientas para el silenciamiento de genes). Aunque la administracin es ms difcil en otros organismos, tambin se estn haciendo esfuerzos para realizar estudios genmicos a gran escala en clulas de mamferos. Las aproximaciones para el diseo de libreras genmicas de RNAi pueden requerir mucha ms sofisticacin que el diseo de un slo siRNA para un conjunto definido de condiciones experimentales. Frecuentemente se utilizan redes neuronales artificiales para disear libreras de siRNA y para predecir la probabilidad de su eficiencia en el silenciamiento de genes. El screening genmico masivo se ve generalmente como un mtodo prometedor para avanzar en la anotacin del genoma y ha desencadenado el desarrollo de mtodos de screening a gran escala (highthroughput) basados en microarrays. Sin embargo, la utilidad de esos screens y la posibilidad de aplicar las tcnicas desarrolladas en organismos modelo incluso a especies relacionadas es cuestionable, por ejemplo desde C. elegans a nemtodos parasticos relacionados. La genmica funcional utilizando RNAi es una tcnica particularmente atractiva para el mapeo y anotacin genmicos en plantas, porque muchas plantas son poliploides, lo que representa un reto significativo para mtodos genticos ms tradicionales. Por ejemplo, el RNAi ha sido utilizado con xito para estudios genmicos funcionales en el trigo del pan (que es hexaploide), as como en los sistemas modelos de plantas ms comunes, como Arabidopsis y el maz. [editar] Medicina Una posibilidad muy interesante es la utilizacin del mecanismo de RNAi en terapia. Aunque es difcil introducir dsRNAs largos en clulas de mamferos debido a que estos desencadenan la respuesta de interfern, el uso de siRNAs (sintticos o shRNAs) ha tenido ms xito. Entre las primeras aplicaciones en llegar a la fase de ensayos clnicos, se encuentra el tratamiento de la degeneracin macular y el virus respiratorio sincitial. El RNAi tambin se ha mostrado efectivo en la reversin de fallo heptico inducido en modelos de ratn. Otros usos clnicos propuestos se centran en terapias antivirales, incluyendo la inhibicin de la expresin gnica viral en clulas cancerosas, silenciamiento de los receptores y correceptores del HIV en el husped, el silenciamiento del virus de la hepatitis A y de la hepatitis B, el silenciamiento de la expresin del virus de la gripe y la inhibicin de la replicacin del virus del sarampin. Tambin se han propuesto tratamientos potenciales para enfermedades neurodegenerativas, prestando atencin particular a las enfermedades de poliglutaminas tales como la enfermedad de Huntington. La interferencia de ARN tambin se considera una alternativa prometedora para tratar el cncer, mediante el silenciamiento diferencial de genes sobreexpresados en clulas tumorales o genes involucrados en la divisin cellular (mitosis). En la revista Molecular Therapy (del grupo Nature), puede encontrarse una serie de artculos de acceso libre que tratan sobre la tcnica de RNAi como estrategia teraputica, que resume diferentes reas de investigacin publicadas en diferentes revistas.

Un rea clave de investigacin en el uso de RNAi en aplicaciones clnicas es el desarrollo de un mtodo de administracin seguro, que hasta el momento implica sobre todo el uso de sistemas de vectores virales similares a los que se utilizan en terapia gnica, aunque tambin se utilizan otros mecanismos como aerosoles, siRNAs encapsulados en liposomas, conjugados con colesterol o asociados a complejos anticuerpo-protamina. A pesar de la proliferacin de estudios en cultivos celulares para drogas basadas en RNAi, existen algunas preocupaciones en relacin a la seguridad del RNAi, especialmente debido a los posibles efectos off-target (ver Efectos inespecficos (off-target)), en los que un gen con una secuencia similar al gen diana es tambin silenciado. Un estudio de genmica computacional ha estimado que la tasa de error debido a efectos off-target es aproximadamente del 10%. Un importante estudio de enfermedad heptica en ratn produjo una alta tasa de mortalidad en los ratones experimentales, debido segn los investigadores a la sobresaturacin de la va del RNAi, a causa de la utilizacin de shRNAs que deben procesarse en el ncleo y exportarse al citoplasma por un mecanismo activo. Todas estas son consideraciones que estn bajo intenso estudio en la actualidad, para reducir su impacto en la utilizacin teraputica del RNAi. [editar] Biotecnologa La interferencia de ARN se ha utilizado en aplicaciones de biotecnologa, particularmente en el diseo de plantas alimenticias que producen niveles bajos de toxinas naturales de plantas. Esta tcnica aprovecha el fenotipo estable y heredable del RNAi en plantas. Por ejemplo, las semillas de algodn son ricas en protenas nutritivas, pero contienen de forma natural el producto terpenoide txico gossypol, hacindolo no apto para el consumo humano. Se ha utilizado RNAi para producir cepas de algodn cuyas semillas contienen niveles reducidos de delta-cadineno sintetasa, una enzima clave en la produccin de gossypol, sin afectar la produccin de gossypol en otras partes de la planta, donde el gossypol es importante en la prevencin del dao producido por los agentes infecciosos de la planta. Esfuerzos similares se han dirigido hacia la reduccin del producto natural cianognico linamarino en plantas de yuca. Aunque ningn producto vegetal que utilice ingeniera gentica basada en RNAi ha pasado todava la fase experimental, los esfuerzos en el desarrollo de estos productos han reducido con xito los niveles de alrgenos en plantas de tomate y han disminuido los precursores de carcingenos probables en plantas de tabaco. Otras caractersticas vegetales que han sido modificadas en el laboratorio incluyen la produccin de productos naturales no-narcticos en opium poppy, resistencia a virus de plantas comunes y refuerzo de plantas como los tomates con antioxidantes dietticos. Productos comerciales previos, como el tomate Flavr Savr y dos cultivares de papaya resistentes al virus anillado de la papaya, fueron originalmente desarrollados utilizando tecnologa antisense, pero probablemente explotaban la ruta del RNAi. [editar] Referencias Bernstein E, Caudy AA, Hammond SM, Hannon GJ. Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference. Nature. 2001 Jan 18;409(6818):363-6 [1]

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