Gua de Trabajos Prcticos

BIOLOGIA II

2009

Biologa II Segundo Cuatrimestre-ao 2009 Coordinador de la materia Dra. Prof. Deborah R. Tasat Docentes Responsables de TP Dra. Andrea Gioffr Dra. Paola D`Atri Dr. Martin Radrizzani Ayudantes de Primera Lic. Mnica Palmieri Lic. Leonardo Storani Ayudantes de Segunda Marcos Bruno Romina Chiurazzi Sebastin Ferraro Vernica Delfosse

INDICE Cronograma de la materia Programa Analtico Bibliografa Recomendada Caractersticas grales. de la Materia-Rgimen de aprobacin Normas para el trabajo en el laboratorio Pipetas de precisin de volumen variable Microscopio ptico: Descripcin y Funcionamiento Microscopa Optica Tcnicas cito-histolgicas y Microscopa clulas eucariotas Microscopa ptica en el estudio de los microorganismos Pared Bacteriana Morfologa bacteriana y Tcnica de Gram Desinfeccin y Esterilizacin Crecimiento bacteriano Cuantificacin en medio slido y recuento celular Espectrofotometra Turbidimetra: evaluacin del crecimiento bacteriano. Crecimiento bacteriano en medio lquido Cuantificacin de Protenas Centrifugacin Permeabilidad de las membranas celulares Problemas: Gua de Problemas Cultivo de Tejidos Fagocitosis: Resea histrica Fagocitosis en cultivos primarios de macrfagos Recuento Celular- Cmara de Neubauer Pg. 1 Pg. 2 Pg. 4 Pg. 5 Pg. 6 Pg. 8 Pg. 10 Pg. 13 Pg. 14 Pg. 19 Pg. 21 Pg. 23 Pg. 25 Pg. 28 Pg. 30 Pg. 32 Pg. 35 Pg. 37 Pg. 40 Pg. 42 Pg. 68 Pg. 44 Pg. 47 Pg. 48 Pg. 50 Pg. 51 Pg. 53 Pg. 54 Pg. 57 Pg. 61 Pg. 62 Pg. 65 Pg. 68

TP#1 TP#2

TP#3 TP#4 TP#5 TP#6 TP#7 TP#8 TP#9

TP#10 Divisin Celular: Mitosis y Meiosis TP#11 cidos Nucleicos: Resea histrica Extraccin de ADN Electroforesis: Geles de agarosa TP#12- Anlisis de ADN TP#13 Electroforesis: Geles de poliacrilamida Separacin de Protenas TP#14 Problemas TP#15 Problemas

Inicio de las clases: Finalizacin de las clases: Exmenes: Primer Parcial: Segundo Parcial:

Mircoles 19 de Agosto Tericos y TPs Mircoles 25 de Noviembre

Mircoles 14 de Octubre Mircoles 2 de Diciembre

Exmenes Recuperatorios: Primer y Segundo Parcial: Fechas de Finales: Sern establecidas por la Escuela de Ciencia y Tecnologa Mircoles 16 de Diciembre

Programa Analtico de la materia 1: Microscopas ptica y electrnica. Microscopio ptico simple y compuesto. Microscopios especiales de: fondo oscuro, fluorescencia, polarizacin, contraste de fase, interferencia, confocal. Electrnicos de transmisin y de barrido. 2: Mtodos citolgicos y citoqumicos. Fijacin. Inclusin. Obtencin de cortes. Coloracin. Tcnicas especiales: tejidos duros (descalcificacin y desgaste), frotis de sangre, Impregnaciones metlicas. Histoqumica. Inmunohistoqumica: tcnicas directa e indirectas. Tcnicas para microscopa electrnica de transmisin y de barrido. Mtodos citofotomtricos. Mtodos autoradiogrficos. 3: El origen de las clulas. Evolucin de las clulas procarionte y eucarionte. Estructura general de las clulas procarionte y eucarionte. Teora de la Endosimbiosis. Niveles de Organizacin: Unicelulares, Multicelulares y Pluricelulares. Organizacin Celular. Clulas Procariontes: (Arqueobacterias y Eubacterias). Clulas Eucariontes (Reino Fungi: ascomycetes, deuteromycetes y basidiomycetes). 4: Clulas Eucariontes. Comparacin entre clula animal y vegetal. Lmites Celulares. Tamao y forma celular. Organizacin subcelular: Membrana Plasmtica y Pared Celular. Caractersticas de la clula animal y vegetal. Tipos de clulas: forma, tamao, diferenciaciones. 5: Membrana Plasmtica. Breve Resea Histrica (Danelli, Singer). Composicin Qumica: La Bicapa lipdica y Protenas de Membrana. Propiedades. Transporte de Molculas a travs de la Membrana. Tipos de Transporte: Pasivo Simple, Facilitado y Activo (Cotransporte: Simporte y Antiporte). 6: Endomembranas I. Continuidad de Membrana. Compartimentalizacin Celular. El Retculo Endoplsmico Rugoso y Liso. Estructura y Funciones. 7: Endomembranas II. Sistema de Golgi. Estructura y Funcin. Sistema vacuolar: Lisosomas. Peroxisomas. Reciclado de la Membrana Celular: Vesculas cubiertas. Transporte de Macromolculas: Exocitosis y Endocitosis. 8: Mitocondrias y Cloroplastos. Caracterizacin Morfolgica y Estructural. Compartimentalizacin. Funcin de las Mitocondrias: Respiracin Aerbica y Fermentacin. (Gluclisis, Cadena Respiratoria y Fosforilacin Oxidativa). Funcin de las Cloroplastos. 9: Citoesqueleto I. Clasificacin y funciones. Los Microfilamentos: actina y protenas asociadas. Estructura y funciones. El Movimiento ameboide. Los Filamentos Intermedios: Estructura y funciones. Marcadores Especficos de Estirpe Celular. Anomalas genticas de protenas estructurales. Protenas de los filamentos intermedios (queratinas). 10: Citoesqueleto II. Los Microtbulos: tubulina y protenas asociadas. Estructura y funciones. Organizacin molecular y funcional del aparato mittico. Organoides microtubulares: cilias y flagelos.

11: Divisin Celular en eucariontes: Mitosis: Organizacin Molecular y rol Funcional del aparato mittico. Descripcin general de la meiosis: Etapas, Formacin del Complejo sinaptonmico, recombinacin gnica entre cromtidas homlogas (crossing-over), separacin de homlogos y de cromtides hermanas. Consecuencias genticas de la meiosis. Comparacin entre meiosis y mitosis. 12: Ciclo Celular: Perodos Go, G1, S, G2. Ciclinas y Factor Promotor de la Maduracin (MPF). Factores regulatorios del ciclo celular (p21, p53, p16, etc.), cascadas regulatorias. 13: Ncleo I. La organizacin del ADN. Los cromosomas (nucleosomas histonas cromatina). Replicacin. La envoltura nuclear. 14: Ncleo II. El Nuclolo. Tipos de ARN. Transcripcin y procesamiento del ARN. Ribosomas y poli-ribosomas. Traduccin. Protenas intracelulares y de exportacin.

Bibliografa Recomendada
A modo orientativo se citan a continuacin algunos libros de referencia. Sin embargo, se recomienda optar por las ediciones actualizadas, en el caso de que se encuentren disponibles Biologa Curtis and Barnes. Ed. Panamericana, 2001 H. Biologa Molecular de la Clula B. Alberts y col. Ed. Garland, 1994. Biologa Celular y Molecular De Robertis y De Robertis. Ed. El Ateneo,1994. Fundamentos de Biologa Celular y Molecular De Robertis y De Robertis (h). Ed. Ateneo, 1995. Histologa Genesser. Ed. Panamericana, 1996. La Clula 2da. Edicin G. Cooper. Ed. Marbn, 2002 . Bioqumica Stryer. Ed. Revert, 1995 Genes VII Lewis. Ed. Marbn, 2001 Biologa Celular Smith y Wood. Ed. Adison Wesley Iberoamericana, 1997 Recombinant DNA. 2da Ed. Watson JD, Gilman M, Witowski J, Zoller M (1992) Freeman, Scientific American Books Molecular Cell Biology. 4th ed. Lodish, Harvey; Berk, Arnold; Zipursky, S. Lawrence; Matsudaira, Paul; Baltimore, David; Darnell, James E. Bsquedas Bibliogrficas Para buscar citas de trabajos originales publicados en revistas cientficas en ingls mediante el uso de palabras presentes en sus ttulos o resmenes (abstracts) o el apellido de sus autores, o libros on-line (tambin en ingls), se puede consultar la base de publicaciones ms importante en ciencias biomdicas y biotecnologa, llamada PubMed, a la siguiente direccin de internet: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/PubMed/ Publicaciones Peridicas Scientific American o su edicin en espaol (Investigacin y Ciencia) Mundo Cientfico Ciencia Hoy

Caractersticas generales y Rgimen de aprobacin

El curso se desarrollar en 15 semanas y comprende: Clases Tericas de 2 horas (1 clase por semana) a dictarse los das mircoles de 15-17hs Trabajos Prcticos de 3 horas. Los mismos se llevarn a cabo los das mircoles de maana: 9-12hs o de noche de 18-21hs. Exmenes parciales escritos a desarrollar. El examen final podr ser oral o escrito. Clases Tericas Teniendo en cuenta la imposibilidad material para desarrollar la totalidad de los temas debido a los avances crecientes en el conocimiento en Biologa, las clases tericas estn dedicadas bsicamente a la actualizacin de los temas fundamentales de la materia. No obstante, la totalidad de los tpicos del Programa Analtico deben ser estudiados utilizando la bibliografa aconsejada. Para facilitar la compresin de los contenidos desarrollados en las clases tericas, es esencial el estudio previo de los temas a ser dictados. Clases Prcticas El Trabajo Prctico es una actividad de asistencia obligatoria, por lo tanto, se exige un 80 % de asistencia. La inasistencia a los TPs implica por lo tanto la prdida de la regularidad de la materia. Las bases conceptuales de los temas de TP son desarrolladas previamente en las Clases Tericas o durante el desarrollo de las prcticas. El alumno deber poseer los conocimientos tericos correspondientes al tema del da, los que sern evaluados mediante interrogatorios orales o escritos (parcialitos). La materia presenta distintas instancias de Evaluacin 1-Trabajos Prcticos El alumno deber poseer los conocimientos tericos correspondientes al tema del da, los que sern evaluados mediante interrogatorios orales o escritos (parcialitos). Los parcialitos se aprueban con el 60 % de la nota total. Todos los parcialitos desaprobados sern recuperados en una fecha que dispondr la ctedra, previa a cada parcial. Para acceder al exmen recuperatorio, los alumnos debern tener aprobados no menos del 50 % de los parcialitos en cada mdulo. Los alumnos que no aprueben los TPs, no podrn presentarse a rendir los exmenes parciales. Informes: Todos los resultados y observaciones de los TPs debern presentarse en informes siguiendo los lineamientos establecidos por la ctedra. Los informes debern ser entregados a ms tardar, en la segunda clase posterior a la realizacin de la Prctica. Luego de esa fecha se considerar desaprobada la prctica. En caso de estar desaprobado el informe, el alumno deber rehacerlo. 2-Exmenes Parciales Durante el curso lectivo se tomarn 2 (dos) exmenes parciales cada uno de los cuales se aprobar con el 60% de la nota. Recuperatorios de Parciales Se podr recuperar, en las fechas previstas por la Ctedra, solamente uno de los exmenes parciales. 3-Exmen Final
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Los alumnos que regularizan la materia, rendirn un examen final integratorio. El mismo puede ser escrito u oral. Promedio Final de la Materia La nota final surge de promediar la nota de los exmenes parciales, final y el promedio de los TP. Los alumnos que al finalizar la cursada se encuentren dentro de las siguientes situaciones: -desaprobacin de los dos exmenes parciales - desaprobacin del exmen recuperatorio. Estos debern recursar la materia. En caso de recursar en el cuatrimestre siguiente, la nota de los TPs sern consideradas, debiendo cursar solamente los tericos y rendir los respectivos exmenes parciales.

NOTA: Todo el material necesario ser provisto por la ctedra. Sin embargo es obligacin del alumno contar con: - Marcador indeleble trazo fino - Lpices de colores y hojas blancas

Normas para el trabajo en el laboratorio En el siguiente texto, mostramos una serie de tems elementales para el trabajo en el laboratorio. 1. Se implementar el uso de guardapolvo, de preferencia que sea de algodn, largo y con mangas largas, asimismo es recomendable no usar faldas, shorts o zapatos abiertos. Las personas de cabello largo debern sujetarlos mientras estn en el laboratorio. 2. No fumar, comer o beber en el laboratorio. Lavar bien las manos al salir del lugar. 3. Es importante conocer la localizacin de los accesorios de seguridad. -Localizar los extintores de incendio y verificar a que tipo pertenecen y que tipo de fuego pueden apagar. -Localizar las salidas de emergencia o salidas alternativas a las habituales. -Localizar la llave general de electricidad del laboratorio. -Localizar la manta anti-llama. -Localizar el lava-ojos y ducha ms cercanos 4. Todo frasco o tubo conteniendo alguna sustancia debe rotularse. Es necesario contar con un rotulador indeleble. 5. No devolver los reactivos a los frascos originales, as no hayan sido usados. Evitar circular con ellos por el laboratorio. 6. No usar ningn instrumento para el cual no se haya sido entrenado o autorizado a
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utilizar. 7. Verificar el voltaje de trabajo del instrumento antes de enchufarlo. Cuando los instrumentos no estn siendo usados deben permanecer desenchufados. 8. Nunca pipetear lquidos con la boca. En este caso usar peras de plstico o propipetas especiales para tal fin. * Material de Vidrio 1. Al usar material de vidrio, verificar su condicin. Cualquier material de vidrio que est astillado debe ser rechazado. 2. Los vidrios rotos as como todo material punzante deben ser descartados en un recipiente apropiado. NUNCA DEJARLOS SIN IDENTIFICAR NI A LA MANO DE UN TERCERO. * Residuos Consultar siempre la va de descarte de cada uno de los reactivos utilizados. * Microscopios Verificar siempre el estado de las lentes y recordar apagar la lmpara luego de realizada la observacin. Siempre que use aceite de inmersin, limpiar al finalizar con el solvente adecuado. Al retirarse, verificar que el instrumental utilizado est apagado, en su lugar, la mesada de trabajo debe quedar libre y limpia. Cualquier desperfecto, rotura o accidente deber ser informado a los docentes

ANTE CUALQUIER DUDA SUGERIMOS SIEMPRE CONSULTAR A LOS DOCENTES A CARGO

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Pipetas de precisin de volumen variable (micropipetas) Este tipo de instrumento permite el pipeteo de pequeos volmenes de lquidos con precisin y reproducibilidad. Es un instrumento de precisin que, como tal, es costoso y requiere de cierto cuidado en su manejo. Las mismas son autoclavables y utilizan un cono, punta o tip descartable, con el que se toman las muestras. Requerimos leer atentamente este apndice para evitar una mala manipulacin de las mismas. Descripcin general de una micropipeta tipo.

A- Push button, suele indicar el mximo Vol a pipetear B- Tambor mvil, a partir del cual se puede ajustar el Vol a dispensar. En un pequeo visor, se observa el Vol a calibrar. C- Conducto principal-vstago D- Eyector de tips, este es activado presionando el botn E. F- Tip descartable

Tabla: Lmites operativos y lectura de volumen. Modelo P20 Rango de Volumen 2ul-20ul ectura del indicador de V

P200 50ul-200ul

P1000 200ul-1000ul

1ul= 10-3 ml

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Utilizacin: Observar que el mbolo (push button) tiene tres posiciones. T0 (B-E), T1, primer tope (AC), T2 (D) Para la carga: 1. Calibracin del V, tener mucho cuidado en no sobrepasar los lmites operativos de cada pipeta. Colocar el tip. 2. Llevar el mbolo a la posicin de carga T1 (ver A). 3. Dentro del lquido a pipetear, liberar el mbolo lentamente hasta la posicin T0 (ver B). 4. Para la descarga: 5. Bajar el mbolo suavemente, este debe pasar por primer tope, para la descarga total, llegar hasta el final, posicin T2 (ver C y D). 6. Finalmente, fuera del lquido dispensado, liberar el mbolo hasta T0 (ver E). 7. Descartar el tip.

T0 T1 T2

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MICROSCOPIA
Descripcin y funcionamiento del microscopio ptico La microscopa de luz es una forma de microscopa ptica que incluye lupas y microscopios compuestos. Un microscopio compuesto posee dos lentes: la lente objetivo, que se encuentra cerca del objeto que se observa y el lente ocular, colocado cerca del ojo. El aumento primario del objeto se produce por el lente objetivo, y la imagen que as se origina se transmite al ocular, donde ocurre el aumento final. La magnificacin total es el producto del aumento del objetivo por el aumento del ocular. Una propiedad importante de un microscopio es su poder de resolucin, es decir, la capacidad para mostrar como distintos dos puntos separados que se encuentran cercanos. Depende exclusivamente del poder del objetivo. El lmite de resolucin de un microscopio compuesto es directamente proporcional a la longitud de onda de la luz empleada () e inversamente proporcional a la apertura numrica (AN), una propiedad ptica de las lentes objetivo. AN n seno = n x seno , donde: = ndice de refraccin = seno del ngulo de abertura de la lente

El fsico Ernst Abbe estableci la relacin entre , AN del objetivo y distancia mnima de separacin entre dos puntos. Si el Lmite de resolucin (LR) es la distancia mnima que separa dos puntos que pueden ser discriminados como tales entonces: LR = 0.61 x / AN donde = longitud de onda de la luz AN = apertura numrica del objetivo LR del *el ojo humano = 0.1 mm *microscopio ptico = 0.2m *microscopio electrnico = 2-10 A

Dado que la longitud de onda de la luz empleada est acotada en el rango 400-700 nm. En la prctica la resolucin de un objeto es funcin de su apertura numrica. A mayor apertura numrica ms pequeo ser el objeto resuelto. Por otra parte, el medio por el cual se transmite la luz afecta tambin a la apertura numrica. Mientras el objetivo est separado del objeto por aire, su apertura numrica nunca ser mayor que 1. Para alcanzar aperturas numricas mayores, el objetivo debe estar inmerso en un medio que posea un ndice de refraccin de la luz mayor que el del aire. Por ello se emplean aceites de varios tipos cuyos ndices de refraccin sean iguales al del vidrio. Los lentes objetivos diseados para utilizarse con este tipo de aceites se denominan lentes de inmersin. La apertura numrica de una lente de este tipo oscila entre los valores 1.2 y 1.4.

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Principios Generales de ptica

Luz: Es una onda electromagntica que a partir de una fuente, se propaga en el vaco a una velocidad de 300.000 km /seg. La escala de medicin de las longitudes de onda es desde los nanmetros hasta kilmetros. El espectro de luz visible se encuentra en el rango 380 nm (violeta) 750 nm (rojo). Refraccin: La refraccin es el resultado de un cambio en la velocidad de propagacin de la luz al pasar de un medio transparente a otro de diferente densidad. Como consecuencia se produce una desviacin en el sentido de la propagacin.

aire i

aire i

aire

aceite de inmersin

Leyes de la refraccin 1ra. Ley: Los rayos incidente, refractado y la normal estn en el mismo plano. 2da. Ley: Cuando la luz atraviesa la superficie de separacin de dos sustancias transparentes el cociente entre seno i/seno r es una constante y se denomina ndice de refraccin

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Diagrama de un Microscopio compuesto

Tipos de Microscopios: pticos Campo claro Contraste de fase Interferencia Campo oscuro Polarizacin Fluorescencia Confocal Electrnicos Transmisin Barrido

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TP#1 Microscopa La Microscopa ptica en el estudio de las clulas eucariotas

Mtodos para obtener informacin morfo-funcional

1. Microscopios pticos y electrnicos 2. Tcnicas citolgicas y citoqumicas 3. Marcadores especficos (Anticuerpos, Radioactivos) 4. Tcnicas Inmunocitoqumicas (directas e indirectas) 5. Separacin de componentes subcelulares (centrifugacin) 6. Aislamiento y caracterizacin de macromolculas (electroforesis, cromatografa) 7. Cultivo in vitro de clulas y/o tejidos 8. Manipulacin embrionaria

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TP#2 Tcnicas cito-histolgicas

Son los procedimientos que abarcan desde la obtencin de una muestra de origen animal o vegetal, hasta su transformacin en una preparacin adecuada para su estudio microscpico. La tcnica corriente para microscopa de campo claro es bsica y sirve como patrn para casi todas las dems. La tcnica histolgica de rutina para estudiar las preparaciones con el microscopio ptico consta de los siguientes pasos: a. b. c. d. e. f. g. h. Obtencin de la muestra Fijacin (tipos de fijadores, variacin del tiempo de fijacin) Deshidratacin Inclusin (distintos medios) Corte (tipos de micrtomos) Montaje del corte Coloracin (concepto de basofilia y acidofilia) Montaje final (deshidratacin, aclaracin)

Unidad de medida milmetro (mm) micrmetro (m) nanmetro (nm) ngstrom (A)

Valor de la unidad (m) 1x10 -3 1x10-6, 1x10-3 mm 1x10-9, 1x10-6 mm 1x10 -10, 1x10-7 mm

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Tcnica Histolgica
OBTENCIN DE LA PIEZA NECROPSIA: Son piezas que se obtienen de un cadver. BIOPSIA: Son trozos de tejido que se obtienen de un sujeto con vida, con el objeto de estudiarlos a microscopio y efectuar el diagnostico histopatolgico. FIJACIN: es una operacin que tiene por objeto matar las clulas y conservarlas en el estado en que se encontraban durante la vida. Tipos de fijadores: formol 10-2-%, Bouin (mezcla fijadora a base de cido pcrico, formol y cido actico). DESHIDRATACIN: se realiza en grados crecientes de alcoholes (70, 96 y 100). ACLARACIN: se utiliza un liquido intermediario (solvente orgnico) antes de la inclusin. Solventes utilizados: benzol o xilol. INCLUSIN: el objetivo es aumentar y homogeneizar la consistencia del tejido. Masas de inclusin: parafina, celoidina, etc. CORTE: el objetivo de la inclusin es preparar el material para realizar cortes del espesor necesario para permitir el paso de la luz y ser examinados por el microscopio. El corte se realiza con micrtomo. DESPARAFINACION: El objetivo es extraer la parafina del corte. Se utiliza el xilol. HIDRATACIN: se realiza en grados decrecientes de alcohol (100, 96, 70), luego los cortes se pasan por agua destilada. COLORACIN: argnticas, etc. Hematoxilina-eosina, tricrmicos, PAS, impregnaciones

DESHIDRATACIN: se realiza con alcoholes en grados crecientes. ACLARACIN: se utiliza benzol o xilol. MONTAJE: con blsamo de Canad.

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Coloracin Con Hematoxilina-Eosina

Pasos 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. Desparafinar el corte en xilol durante 10 minutos Hidratar en alcoholes 100, 96, 70 y 50. Pasaje por agua destilada Coloracin con hematoxilina durante 10 minutos. Viraje en agua corriente Coloracin con eosina durante 3 minutos Lavado rpido en agua corriente Deshidratar en alcoholes 50, 70, 96 y 100 Aclaracin en xilol Montaje con blsamo de Canad.

Observar los cortes al microscopio ptico: Dibujar las caractersticas principales y coloracin de los mismos

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Objetivo: Visualizacin y Caracterizacin de distintos tipos celulares Frotis Sanguneo

Diferenciar clulas de la serie roja y de la serie blanca.

Materiales

Rata Wistar Jeringa Colorante May Grunwald-Giemsa o Hematoxilina-Eosina Porta y cubreobjetos Microscopio compuesto

Metodologa

A partir de la muestra de sangre se obtendrn los extendidos segn mostrar el docente a cargo del T.P. Dejar secar, fijar con alcohol 96% y colorear la muestra durante 5-15 min.

Observar bajo microscopio de campo claro. Se realizar la observacin del preparado tratando de identificar los tipos celulares que se muestran a continuacin:

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La Microscopa ptica en el estudio de los microorganismos

Resea Histrica La existencia de microorganismos era sospechada desde mucho antes del siglo XVII, pero no poda demostrarse, consecuencia de las limitaciones tcnicas de la poca. En 1664, Robert Hooke desarroll un microscopio compuesto y lo utiliz para observar pulgas, esponjas, plantas y mohos entre otros. Su trabajo fue publicado en Micrographia siendo muy popular. Varios aos ms tarde, el trabajo de Anton van Leeuwenhoek, un cientfico amateur con gran habilidad para combinar lentes y obtener telescopios y microscopios, permiti la magnificacin de muestras ms de 200 veces, generando imgenes de mayor claridad. Pas meses observando a travs de su microscopio y envi sus observaciones a la Royal Society of London, causando sensacin. Sorpresivamente el trabajo de estos investigadores fue abandonado por casi 200 aos hasta la Revolucin industrial, cuando se dieron las condiciones tcnicas y sociales para el desarrollo de la ciencia de los microorganismos. El trabajo posterior de Ferdinand Julius Cohn en la observacin de microorganimos eucariotas y bacterias (procariotas) populariz el uso de los microscopios en la microbiologa y sent las bases para el comienzo de la microbiologa mdica fundada por Robert Koch. La historia de la microbiologa, como la historia del hombre, no es una coleccin de eventos de progreso lineal, sino un entramado de carreras de individuos brillantes y sus ideas. Cada nuevo descubrimiento, se basa en un descubrimiento previo y en retorno, permite otros cuestionamientos. La tabla siguiente, resume los avances que ayudaron al desarrollo de la prctica microbiolgica, entre los que se encuentra el desarrollo de la tcnica de Gram, que realizaremos en este TP.

Through the microscope: A look at all things small. Timothy Paustian and Gary Roberts, University of WisconsinMadison. http://www.microbiologytext.com

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AO

EVENTO

Robert Hooke es el primero en utilizar el microscopio para describir la esctructura 1664 reproductiva de los mohos. Tambin acu el trmino clula a partir de la observacin de corcho vegetal. 1673 1872 Anton van Leeuwenhoek, un comerciante alemn y habilidoso constructor de lentes, es el primero en describir microorganismos en detalle. Ferdinand Julius Cohn publica un trabajo decisivo en bacterias y reciclado de los materiales. Aparece un esquema de clasificacin utilizando el nombre Bacillus.

Oscar Brefeld reporta el crecimiento de colonias fngicas a partir de esporas individuales 1872 en gelatine y el botnico alemn Joseph Schroeter crece colonias bacterianas pigmentadas en trozos de papa. 1877 1881 1882 1884 Robert Koch desarrolla mtodos de tincin de bacterias, fotografa especimenes y preparado de registro visuales permanente en cortes histolgicos. Koch desarrolla medio de cultivo slido y mtodos para la obtencin de cultivos puros de bacterias. Angelina Fannie and Walther Hesse en el laboratorio de Koch desarrollan el uso de agar como medio de soporte para el cultivo en medio slido. Hans Christian Gram desarrolla un sistema de tincin para la identificacin de bacterias. [la tincin de Gram]. M. H. McCrady establece un mtodo cuantitativo para el anlisis de muestras de agua usando el nmero ms probable .

1887 Primer reporte de la placa de Petri por Julius R. Petri. 1915

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La Pared Bacteriana
Las bacterias (procariotas) son los organismos vivos ms pequeos que contienen toda la maquinaria requerida para el crecimiento y la autorreplicacin a expensas de distintos nutrientes pudiendo ser auto o hetertrofos. Su tamao promedio es de aproximadamente 0,5m de dimetro. Casi todos los procariotas estn rodeados por una pared celular rgida que rodea la membrana citoplasmtica que da a los diferentes tipos su morfologa caracterstica. Dado que la mayora de las bacterias son hipertnicas en relacin con su ambiente, se lisaran si no tuviesen dicha pared. Las paredes celulares de los procariotas son complejas y contienen muchos tipos de molculas que estn ausentes en los eucariotas. Estn compuestas por polmeros complejos (peptidoglucanos), que son primariamente responsables de la resistencia mecnica de la pared.

GramNegativa Gram Positiva La clasificacin de las bacterias depende principalmente de su tamao, forma y propiedades de coloracin, en consecuencia, el microscopio ptico ha sido durante mucho tiempo el instrumento principal del bacterilogo. Las preparaciones no teidas pueden ser observadas mediante un microscopio de contraste de fases, pero en general los bacterilogos utilizan preparaciones fijadas al calor y por lo tanto coloreadas. Para las bacterias la coloracin de Gram es la ms utilizada. Este mtodo fue desarrollado en forma emprica por el bacterilogo dans Christian Gram en 1884. En primer lugar, las clulas son fijadas al porta mediante calor y coloreadas con un colorante bsico, cristal violeta. A continuacin los portas son tratados con una mezcla de I2KI (lugol) para fijar (mordiente) el colorante, posteriormente son lavados en acetona o alcohol y, finalmente se aplica una coloracin de contraste, la safranina. Teniendo en cuenta lo descrito, se denomina en consecuencia organismo grampositivo a los que retienen el colorante violeta inicial, mientras que los organismos gramnegativos son
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decolorados por el disolvente orgnico utilizado y presentan la coloracin de contraste. Casi 75 aos despus de la introduccin de este procedimiento tan til se observ que las bacterias G+ y G-, diferan fundamentalmente en la estructura de la pared. Salton demostr que la pared grampositiva no se tie, sino que presenta una barrera de permeabilidad frente a la elusin del complejo coloranteI2 por el alcohol. La coloracin de Gram se usa ampliamente como base para la clasificacin de las bacterias, dado que refleja una diferencia fundamental en la arquitectura de la pared celular. En las clulas grampositivas, la pared esta formada por una capa homognea de

peptidoglucanos y polisacridos que miden entre 10 a 80 nanmetros de espesor. En las clulas gramnegativas, por el contrario, la pared est formada por dos capas: una interior de peptidoglucanos de solo 2 a 3 nanmetros de espesor, y una capa exterior de lipoprotenas y lipopolisacridos. Estas molculas estn dispuestas en forma de una bicapa de unos 7 a 8 nanmetros de espesor similar en estructura a la membrana celular. De modo que, el lmite de una clula gramnegativa es en realidad una membrana celular interna, una capa de peptidoglucanos delgada y una membrana externa.

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TP# 3 Morfologa Bacteriana y Tcnica de Gram

El microscopio ptico revela dos formas principales de bacterias, organismos ms o menos esfricos conocidos como cocos (en latn, baya) y otros cilndricos denominados bacilos (en latn bastn). Los cocos incompletamente separados pueden aparecer en cierto nmero de formas diferentes, dependiendo de los planos en los que se dividen: cuando aparecen predominantemente por parejas se denominan diplococos, en cadenas, estreptococos, y en grupos reciben el nombre de estafilococos (racimo). Los cocos que permanecen adheridos tras dividirse sucesivamente en dos o tres direcciones perpendiculares, formando tetraedros cuadrados o formas cbicas, se conocen por sarcinas. Los bacilos reciben el nombre de cocobacilos, cuando son excepcionalmente cortos, el de bacilos fusiformes cuando estn afilados por ambos extremos, de formas filamentosas cuando crecen en forma de largos filamentos y de vibriones o espirilos cuando son curvados. Se muestra en el grfico la diversidad morfolgica. Puede distinguir las formas de la figura?

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Objetivos del Trabajo Prctico: Observar la morfologa de las distintas cepas bacterianas al microscopio ptico. Observar comparativamente clulas eucariotas y clulas procariotas. Identificar el tipo de pared bacteriana a partir de la tincin de Gram. Metodologa Preparacin del extendido. Los portaobjetos a utilizar deben estar limpios y desengrasados. Se coloca una gota de solucin fisiolgica por cada colonia a analizar, y all se emulsionar una pequea cantidad de cada colonia. En caso de trabajar con cultivo lquido se coloca una gota del cultivo directamente sobre el portaobjeto. Se realizar tambin un hisopado de la cavidad oral-encas y se procesar el extendido como se indica a continuacin. Secado de la preparacin. Se realiza colocando en posicin horizontal sobre la corriente de aire caliente de un mechero. Puede realizarse tambin en estufa. Fijado de la preparacin. Se efecta pasando 3 veces el lado del portaobjeto que NO TIENE la preparacin, sobre la llama del mechero para que la misma adquiera una temperatura de aproximadamente 80 0C. Coloracin 1. Cubrir con VIOLETA para Gram las zonas del portaobjeto que tienen la preparacin. Dejar 20 segundos. 2. Lavar con chorro fino de agua 10 segundos. 3. Cubrir con LUGOL para mordentar. Dejar 30 segundos. 4. Decolorar durante 10 segundos con DECOLORANTE haciendo presin en el frasco plstico, para que salga un chorro fino que arrastre el colorante. 5. Lavar con chorro fino de agua 10 segundos. 6. Cubrir con SAFRANINA. Dejar 20 segundos. 7. Secar

8.
Nota: El tiempo de cada paso puede variar de acuerdo al kit utilizado. Por favor, verificar antes de comenzar Desinfeccin y Esterilizacin el protocolo.

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Desinfeccin y Esterilizacin
Definiciones Se dice que un objeto es estril cuando carece de todo germen viable, en este contexto, viable significa capaz de reproducirse. La esterilizacin es el proceso mediante el que se matan o eliminan todos los microorganismos viables, para lo que se utilizan mtodos fsicos o qumicos destinados a eliminar los mismos de un objeto o matarlos in situ. Este trmino es un absoluto que implica la inactivacin de todas las formas de vida microbiana. Los productos de descomposicin txicos que a veces quedan en el objeto esterilizado se denominan: pirgenos. El trmino desinfeccin se suele emplear para los procedimientos que eliminan o matan a la mayora de los microorganismos viables pero no a todos. Los desinfectantes reducen la biocarga, es decir la cantidad de microorganismos viables. Los procesos de esterilizacin y desinfeccin son costosos y por tanto, es de suma importancia elegir el mtodo apropiado que cause el menor dao posible al material correspondiente. Las consideraciones siguientes influyen en la eleccin del mtodo: Es ms fcil esterilizar un objeto limpio que otro fsicamente sucio, una biocarga baja constituye un requisito previo para una esterilizacin con buena relacin costo / beneficio. La proporcin de microorganismos muertos depende de la concentracin del agente y del tiempo de exposicin. El nmero de microorganismos supervivientes se puede expresar por la ecuacin: N 1/CT Donde N es el numero de supervivientes, C la concentracin del agente y T el tiempo de exposicin. Si una poblacin de microorganismos es expuesta a una tcnica de esterilizacin y el logaritmo del nmero de supervivientes se representa en funcin del tiempo, la pendiente de la curva define la tasa de muerte. Las curvas pueden utilizarse con el fin de predecir las condiciones necesarias para conseguir la esterilidad El mecanismo detallado del proceso de muerte de los microorganismos quizs vare con la tcnica de esterilizacin empleada pero el efecto neto es similar y consiste en la inactivacin de constituyentes esenciales de la clula (cidos nucleicos y protenas). Factores que afectan la potencia desinfectante En contraposicin con los agentes quimioteraputicos que presentan un alto grado de selectividad para ciertas especies de bacterias, los desinfectantes son muy txicos para todos los tipos de clulas. La efectividad de un agente particular est determinada en gran parte por las condiciones en las cuales acta. Concentracin del agente: Muchos agentes son letales para bacterias slo cuando se los utiliza en concentraciones muy elevadas. Otros en concentraciones muy bajas pueden estimular, retardar, o hasta

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destruir al microorganismo. Sin embargo, la concentracin necesaria vara con el desinfectante, el microorganismo y el mtodo de ensayo. Mediante la siguiente expresin es posible relacionar la concentracin de la droga empleada y el tiempo necesario para destruir una determinada fraccin de la poblacin: Cn t = K Donde C es la concentracin de la droga, t es el tiempo necesario para destruir una determinada fraccin de las clulas y n y K son constantes. Tiempo de exposicin a un agente pH La concentracin de in hidrgeno influye sobre la accin bactericida al afectar tanto al microorganismo como al agente qumico. Temperatura La destruccin de las bacterias por los agentes qumicos aumenta junto con la temperatura. Naturaleza del microorganismo La eficacia de un agente determinado depende de las propiedades del microorganismo. Las ms importantes son: especie, fase de cultivo, presencia de estructuras especiales (esporas o cpsulas), etc. Presencia de materiales extraos La presencia de materia orgnica (suero, sangre, pus) influye sobre la actividad de muchos desinfectantes alterando su actividad y los transforma en inertes. Tcnicas de esterilizacin Calor El calor, como forma de transferir energa, es el mtodo preferido para la esterilizacin, debido a su fcil empleo, costo, control y eficacia. a) Calor Seco: El mecanismo esterilizador del calor seco es bsicamente la oxidacin de los componentes celulares. La incineracin y el uso del mechero Bunsen son ejemplos de esterilizacin por calor seco. El instrumental de vidrio se puede esterilizar durante una hora en una estufa de aire caliente a 160-180 C. b) Calor hmedo: El agente ms eficaz para la esterilizacin es el vapor de agua saturado a presin (autoclave). La destruccin de las enzimas y membranas esta influida por la disponibilidad de agua, que modifica los enlaces hidrgeno. El vapor a presin facilita la penetracin del calor en el material que se quiere esterilizar. Existe una relacin directa entre temperatura y presin de vapor. El vapor a presin tiene una temperatura superior a 100 C, lo que aumenta su capacidad de matar microorganismos. La duracin del ciclo de la autoclave est determinada por el tiempo de actuacin ms un margen de seguridad y se calcula por las curvas de letalidad trmica para patgenos termo-resistentes como los clostridios. El ciclo usual de 121 C durante 15 minutos es suficiente para matar esporas de Clostridium botulinum con un margen adecuado de seguridad.

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Filtracin Las soluciones termo-esterilizadas contendrn pirgenos. Esos productos termoestables de la descomposicin de los microorganismos, capaces de inducir fiebre, resultan indeseables en preparados como los lquidos intravenosos. Los filtros modernos son de nitrocelulosa y actan por la atraccin electrosttica y el tamao de los poros, que retienen los microorganismos y otras partculas. Irradiacin El empleo de la irradiacin gamma constituye ahora el mtodo de eleccin para esterilizar grandes lotes de dispositivos pequeo tamao como agujas, jeringas, vas intravenosas, catteres, guantes, etc. Aunque el costo inicial del equipo es muy alto, permite un funcionamiento continuo y proporciona una eficiencia del 100%. La tcnica requiere instalaciones y personal especializado. El mecanismo de muerte consiste en la produccin de radicales libres, que son eficaces para romper los enlaces del ADN. La irradiacin, a una dosis mayor que la necesaria para las clulas vegetativas tambin mata las esporas. Este aumento en la dosis se debe a la falta relativa de agua en las esporas. Agentes qumicos La necesidad de esterilizacin mediante sustancias qumicas gaseosas y/o lquidas ha disminuido mucho gracias al xito de la irradiacin gamma. Sin embargo, an se utilizan el xido de etileno (gas) y el formaldehdo (liquido). Ambos son agentes alquilantes y matan por lesin en las protenas y cidos nucleicos.

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Grupo Halgenos (agentes oxidantes)

Desinfectantes de uso hospitalario Ejemplos Ventajas e Inconvenientes Hipoclorito Econmicos, eficaces, actan por liberacin de cloro libre. Activos contra virus, bactericida. yodo Desinfectantes esporicidas empleado tpico como cutneos preparado tiles, cutneo

otros metales pesados (modifican los grupos funcionales de protenas y cidos nucleicos) Alcoholes (solvente orgnico que interacta con las membranas lipdicas) Aldehdos (agentes alquilantes, modifican enzimas, accin irreversible)

cloruro mercrico

Alcohol etlico Alcohol isoproplico

Formaldehdo formalina glutaraldehdo

Desinfeccin cutnea y limpieza de superficies, usados a veces en combinacin con yodo y clorhexidina. Alcohol 70% es mejor desinfectante que 96%, mayor poder bactericida. demasiado irritantes para uso como desinfectantes generales Destruye microorganismos vegetativos incluyendo micobacterias, lentamente pero de modo ms eficaz, ms activo y menos txico que el formaldehdo, esporicida, algo irritante. Se mantiene estable 1-2 semanas en solucin alcalina, de uso limitado, caros.

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Crecimiento bacteriano
Introduccin En un cultivo bacteriano homogneo el crecimiento de una poblacin bacteriana se puede predecir a travs de la siguiente relacin: dX/dt = X (1) siendo dX el incremento en la masa celular (biomasa), dt es el intervalo de tiempo, X es la cantidad de biomasa, y es la velocidad de crecimiento especfica (con unidades de tiempo inversa -1/t-). Si es constante, integrando la ecuacin (1), queda claro que X va aumentando de manera exponencial con el tiempo: ln X/X0 = t (2) donde ln es el logaritmo natural (en base e = 2.303) y X0 cuando t = 0, por lo tanto rearreglando la ecuacin 2 se aprecia que la biomasa final ser: X = X0 et (3) El crecimiento bacteriano que se comporta segn esta relacin es llamado crecimiento exponencial o crecimiento logartmico. De estas ecuaciones puede deducirse el tiempo de duplicacin (td) cuando X = 2Xo: td = ln 2/ = 0.693/ Estas ecuaciones predicen el comportamiento de una poblacin bacteriana slo en la porcin de la curva de crecimiento que no es influenciada por el crecimiento de la poblacin (es decir la fase exponencial). En general y en este TP en particular se trabaja con cultivos bacterianos lquidos no se agrega ni quita nada del ambiente donde se crecen las bacterias luego de inocular las clulas a un medio de crecimiento adecuado con una composicin mas o menos definidas. Esto significa que estos sistemas slo permitirn la multiplicacin celular por un perodo de tiempo limitado y en el que progresivamente se producirn cambios en el medio original y en el ambiente, producto justamente de los productos metablicos y del consumo de los nutrientes por efecto de la masa celular en crecimiento. En este sentido podremos definir varias etapas en una curva de crecimiento normal, cuya validez se extiende a cultivos de clulas eucariotas. Fase lag: durante la cual la masa celular crece pero no aumenta el nmero de clulas. Fase de crecimiento o fase exponencial: Durante la fase log el crecimiento de microorganismos sigue un patrn exponencial. La razn de este comportamiento es que muchos microorganismos se reproducen formando dos clulas hijas a partir de una clula madre. Fase estacionaria: no hay aumento neto en el nmero de clulas debido a cambios qumicos y fsicos en el ambiente, pero donde aun requieren una fuente de energa que mantiene la viabilidad celular. Fase de muerte: caracterizada por una disminucin exponencial en el nmero de las clulas vivas.

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La fase lag es debida a los cambios rpidos en los medios de cultivo, por ejemplo si transferimos un inculo de una poblacin en crecimiento estacionario a un medio de cultivo fresco el tiempo que tarde en llegar a fase exponencial depender del tamao de dicho inculo. Un inculo de volumen pequeo que es transferido a un gran volumen de medio fresco puede resultar en la salida difusional de vitaminas, cofactores e iones que son necesarios para muchas actividades enzimticas intracelulares. Si esta transferencia se realiza de un medio rico a un medio pobre, resultar en consecuencia en un aumento de la fase lag y tambin puede resultar en un crecimiento exponencial pero de menor. Medicin de la masa celular Hasta aqu hemos venido hablando de masa celular que resulta proporcional al nmero de clulas slo en la fase exponencial. La masa celular se puede medir en trminos de peso seco, pero generalmente resulta ms prctica y til la medicin por Turbidimetra en un espectrofotmetro o en un colormetro, ya que permite seguir el aumento de la densidad del cultivo mientras esta creciendo. La de eleccin es 660nm ya que se evita la absorcin de partculas coloreadas del medio de cultivo y en consecuencia el blanco hecho con medio de cultivo sin inoculo bacteriano es similar al blanco de agua. Cuantificacin celular Para tener una idea precisa del nmero de clulas viables elegimos se utiliza el mtodo de Plaqueo en medio slido. Se efectan diluciones que son distribuidas en el agar y luego de dejar incubando una noche a 370C se procede a contar colonias (ver nota y figura ms abajo), cuyo nmero resulta directamente proporcional al nmero de clulas ya que cada una de ellas proviene de una clula individual. De este concepto deriva el trmino Unidad Formadora de Colonia (UFC). El clculo de la concentracin de clulas viables a un tiempo dado, se realiza como se indica:

UFC/ml= n x FD/Vp

N= nmero de colonias contabilizadas FD=Factor de dilucin (previo al plaqueo) Vp= volumen plaqueado

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TP#4 Cuantificacin celular en medio slido

1. Realizar diluciones seriadas al 1/10 (ver figura) del cultivo a cuantificar, utilizando medio LB (Vf=1ml). Tener la precaucin de homogenizar la suspensin celular antes de pipetear.

VSv: 900L

2. Plaquear seleccionando un volumen de plaqueo adecuado al tamao de la placa (hta. 200 ul para placas de 10 cm; hta 50 ul para placas de 5 cm). 3. Incubar a 37 oC toda la noche 4. Cuantificacin de colonias y clculos de UFC/ml. (Nota: este paso se realizar durante el prximo TP) NOTA: Morfologa de colonia: La multiplicacin bacteriana en medio slido, genera una colonia macroscpica que tambin puede presentar caractersticas particulares de acuerdo a la especie y al medio de cultivo. (http://www.bact.wisc.edu)

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ESPECTROFOTOMETRIA Introduccin a la Espectroscopia de Absorcin Transmitancia Cuando una solucin es puesta en presencia de un haz de luz, debido a la interaccin entre los fotones y las partculas absorbentes de la muestra, la potencia del haz se atena de P0 a P. La transmitancia T de la solucin es por lo tanto, la fraccin de radiacin incidente transmitida por la solucin. T = P/P0 Absorbancia La absorbancia de una solucin se define por la ecuacin: A = - log10T = log P0/P A diferencia de la transmitancia, la absorbancia de una solucin aumenta cuanto mayor es la atenuacin del haz. Por lo tanto T y A son conceptos que definen la cada de la potencia radiante P0, luego de atravesar una capa de solucin de una especie absorbente de concentracin c y de b cm. de grosor. b P0 P

Solucin absorbente de concentracin c Absortividad y absortividad molar La absorbancia es directamente proporcional a la longitud b de la trayectoria a travs de la solucin, y a la concentracin c de la especie absorbente. Estas relaciones se expresan por A = abc Donde a es una constante de proporcionalidad denominada absortividad, caracterstica para cada solucin en particular, tan invariable como el punto de fusin, de ebullicin o los ndices de refraccin. La magnitud de a depender de las unidades utilizadas para b y c. Frecuentemente b se expresa en centmetros y c en gramos por litro. Entonces la absortividad tiene unidades de (g/l)-1 y cm-1. Cuando la concentracin se expresa en moles por litro, la absortividad se denomina Absortividad molar. A = bc

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Ley de Lambert Beer La expresin: A = bc o A = abc es una expresin que se conoce como ley de Beer y permite cuantificar una muestra medida por absorcin. La ley de Lambert y Beer establece que la absorcin de la luz es proporcional al nmero de molculas de las sustancias en solucin por donde pasa el haz luminoso. Por lo tanto la absorcin vara con la longitud del trayecto que recorre el haz de luz en la solucin y con la concentracin del absorbente en una forma caracterstica para cada sustancia absorbente y para una longitud de onda dada. La ley de Beer tambin se aplica a soluciones que contengan ms de una clase de especie absorbente. Suponiendo que no haya interaccin entre las distintas especies, la absorbancia total para un sistema multicomponentes se expresa como: Atotal = A1+A2+.........+An = 1bc1+2bc2+.........+nbcn Limitaciones propias de la ley de Beer La ley de Beer slo describe bien el comportamiento de la absorcin en soluciones diluidas. A concentraciones elevadas (en general > 0.01M) la distancia promedio entre las especies responsables de la absorcin disminuye hasta el punto en que cada una afecta a la distribucin de carga de sus vecinas. Esta interaccin, a su vez puede alterar la capacidad de que las especies absorban a una determinada longitud de onda de radiacin. Dado que el grado de interaccin depende de la concentracin, el hecho de que ocurra este fenmeno causa ciertas desviaciones de la relacin lineal entre la absorbancia y la concentracin. Instrumentos para mediciones de absorcin: Espectrofotmetro El espectrofotmetro es un instrumento que permite medir la intensidad de la luz transmitida. Consta de: a) Fuente de luz: lmparas que suministren una fuente continua y cuya potencia no vare bruscamente en un intervalo considerable de longitudes de onda. b) Selector de longitud de onda: sistema ptico que separa el haz de luz en sus longitudes de ondas componentes, seleccionando una de ellas, la que luego atravesar la muestra (ver figura ms abajo) c) Recipientes para la muestra (cubetas): deben ser de un material a travs del cual pase la radiacin de la regin espectral de inters. Para trabajar en la regin UV (por debajo de 350 nm) se necesita cuarzo. En la regin entre 350 y 2000 nm se pueden usar vidrios o recipientes de plstico. Para los trabajos en las regiones ultravioleta y visible, la longitud de la cubeta es 1 cm. La calidad de los datos de absorbancia depende de manera crtica de la forma en que se usen y mantengan las cubetas. Las huellas dactilares, la grasa u otras manchas en las paredes, alteran de forma notable las caractersticas de transmisin de una cubeta. Por tanto es necesaria una limpieza a fondo, antes y despus de usarlas, la superficie de las ventanas no debe tocarse durante su manipulacin.

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d) Detectores de radiacin: receptor que transforma la seal luminosa en corriente elctrica. e) Sistemas de procesamiento y dispositivos de lectura de las seales: voltmetro que registra la corriente elctrica en una escala general. Normalmente en los espectrofotmetros se pueden encontrar 2 escalas: 1) %T (transmitancia), 2) A (absorbancia). El espectrofotmetro puede emitir frecuencias luminosas que varan segn el aparato y la fuente de luz. Normalmente suelen corresponder a la regin del espectro visible, entre 400 y 700 mm, pudiendo abarcar tambin la regin del ultravioleta (UV), entre 15 y 400 nm y del infrarrojo (IR), ms de 700 nm.

UV

VISIBLE

IR

300 400 500 600 700 800 nm

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TP# 5 Cuantificacin del Crecimiento Celular (Turbidimetra)

OBJETIVOS Evaluar el crecimiento bacteriano por turbidimetra MATERIALES -Cultivo de E. coli en fase exponencial -erlenmeyers/botellas de cultivo -caldo Luria Bertani (LB) -Placas de Petri con medio LB-agar -Bao termostatizado -espectrofotmetro, cubetas -pipetas, tubos tipo eppendorf y tips estriles, rastrillo de vidrio

DESARROLLO

Antes de comenzar la prctica: Encender el espectrofotmetro y calibrar a 600 nm

-Largar un cultivo en medio LB utilizando como inculo el cultivo previamente crecido. Realizar una dilucin 1/20 (Vf= 50 ml). Tomar una alcuota de 0.2 ml en un tubo eppendorf estril, reservar en heladera. Pipetear un V de 0.5 ml y medir al espectro (descartar). Este dato de absorbancia constituye el to. Colocar el cultivo en agitacin a 37 oC. -Realizar mediciones cada 30 min, reservando tambin un volumen de 0.2 ml como se explico ms arriba. De esta manera se seguir la curva de crecimiento a lo largo del TP, midiendo la DO600 a diferentes tiempos, en diferentes condiciones (que sern indicadas por los docentes) y se graficar los valores de absorbancia en funcin del t.

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Preparacin de Medios de cultivo LB-caldo LB-agar 10g triptona (o hidrolisado de casena) Al medio LB agregar 15 g de agar 5 g extracto de levadura 10g NaCl Autoclavar. Dejar enfriar (50-60 oC) Csp 1L antes del agregado de antibiticos si es (ajustar si es necesario a pH 7.4 con necesario, y luego del templado volcar NaOH 1N) en placas de Petri. Dejar solidificar y Autoclavar a 121 oC, 20 min. colocar unas h a 37 oC para eliminar el exceso de humedad y conservar en heladera. Si es necesario el agregado de antibiticos, hacerlo siempre post-autoclavado asegurndose, que el medio se haya templado. Ampicilina: 50 g/ml

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TP# 6 Cuantificacin de Protenas

Introduccin Existen dos tipos de mtodos que pueden ser empleados para estimar la concentracin de protenas en una muestra: Absorcin de luz ultravioleta (UV) Mtodos colorimtricos Absorcin de luz ultravioleta (UV) Las protenas absorben activamente la luz de la regin ultravioleta con un pico mximo correspondiente a los 280 nm y otro a los 200 nm. El pico de 280 nm corresponde a la absorcin de fotones por parte de los electrones de un anillo aromtico. Los aminocidos que tienen anillos aromticos en su estructura son la fenilalanina, triptofano, histidina y tirosina. Los enlaces peptdicos absorben fotones por debajo de los 210 nm. Sin embargo la longitud de onda de eleccin es la de 280 nm debido a que son muy pocas las sustancias qumicas que la absorben, disminuyendo las posibles interferencias. Los mtodos de absorcin de luz UV presentan las siguientes ventajas: Se llevan a cabo directamente en la muestra sin necesidad sin agregarle ningn reactivo. Se realizan rpidamente ya que no requieren incubacin La relacin entre la absorcin y la concentracin proteica es lineal (se cumple la ley de Lambert Beer). Mtodos colorimtricos Se fundamenta en el agregado de diferentes reactivos qumicos que reaccionan con las protenas dando lugar a un producto coloreado que ser medido en el espectro visible, y cuya intensidad es lineal con respecto a la concentracin proteica en un rango determinado (esta relacin se aleja de la linealidad tanto en las altas concentraciones como en las muy bajas). Existen diferentes mtodos que varan no solo en su fundamento sino tambin en su sensibilidad. La eleccin de uno u otro ser acorde a la muestra biolgica problema. Los ensayos colorimtricos siempre se llevan a cabo realizando al mismo tiempo una curva con diferentes diluciones de una solucin de una protena patrn de concentracin conocida. Por lo tanto los valores obtenidos son siempre relativos a esta curva de referencia. La misma debe realizarse simultneamente y en la misma solucin empleada para la muestra incgnita, a fin de considerar las posibles interacciones de los reactivos con los componentes de la solucin reguladora usada, la descomposicin de los mismos, y las posibles variaciones de tiempo y temperatura.

Objetivo Determinacin de la concentracin proteica de una muestra utilizando el mtodo colorimtrico de Bradford.

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Materiales Solucin madre de Albmina bovina (BSA) Solucin cida del reactivo de color (Coomassie Blue G) NaOH 1 M Agua destilada Tubos de hemlisis Pipetas automticas Espectrofotmetro Metodologa Reactivo de color: Se disuelve 100 mg de Serva Blue G en una mezcla de 100 ml de 85% de cido fosfrico y 50 ml de etanol 95%, despus de la completa disolucin del colorante se lleva el volumen a 1 litro con agua. Fundamento del mtodo: El pico de absorcin mxima del colorante en una solucin cida, se desplaza desde los 465 nm a los 595 luego del agregado de la protena, debido a la estabilizacin de la forma aninica del colorante por interacciones tanto inicas como hidrofbicas. El colorante reacciona principalmente con los residuos de arginina, y en menor proporcin con histidina, lisina, tirosina, triptofano y fenilalanina. Procedimiento: Se realizarn previamente las diluciones correspondientes para la curva de calibrado y de las muestras incgnitas. 1- Prender el espectrofotmetro 15 minutos antes de usarlo 2- Poner 20 l de la muestra en los tubos. Agregar 50 l de NaOH a la muestra 3- Agregar 1 ml del reactivo de color e incubar durante 5 minutos 4- Medir la absorbancia a la longitud de onda correspondiente en una cubeta de plstico o de vidrio. Importante: Tener en cuenta el Vmin a emplear para cada cubeta, de lo contrario, el haz de luz no atravesar la muestra 5- Obtener la curva patrn (Cc vs A595) y a partir de esta, obtener la concentracin de las muestras incgnita.

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Autoevaluacin Confeccin de la curva de calibrado 1- Teniendo en cuenta que el rango de deteccin para este mtodo va de 0.2 a 20 g, calcular las diluciones que hay que preparar a partir de una solucin madre de BSA de 1mg/ml, para construir una curva de calibrado de al menos 5 puntos. Dilucin BSA (concentracin) Volumen a pipetear (l) Absorbancia (DO595)

2- Cul es la longitud de onda a la deber leer las muestras luego de reaccionar con el reactivo de color? 4-Usted cuenta con una solucin de albmina pura y quiere determinar su concentracin. Se le ha acabado el Coomassie y por problemas presupuestarios no puede comprarlo por ahora y no tiene nadie que le preste un poco. Sin embargo cuenta en el laboratorio con un espectrofotmetro que lee hasta 280 nm, cubetas de plstico y de cuarzo. Podr calcular la concentracin de la solucin? Qu precauciones debera tener? Podr hacer lo mismo con una solucin mezcla de protenas? Conclusiones Confeccione un informe graficando la curva de calibracin y calcule la concentracin de la muestra incgnita. Coinciden los resultados observados con los esperados?.

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Centrifugacin
La sedimentacin de una partcula por accin de la fuerza centrfuga, resulta de la aplicacin de aceleracin radial por movimiento rotacional. Las partculas ms densas que el medio de suspensin se movern rpidamente hacia la periferia del recipiente que contengan la mezcla sometida a centrifugacin. Por el contrario las partculas o el lquido ms liviano se movern rpidamente hacia el interior. La fuerza centrifuga supera a las fuerza difusionales Brownianas que normalmente impiden o previenen la sedimentacin de partculas finas por accin de la gravedad, permitiendo obtener la separacin en 2 fases de (precipitado pellet y sobrenadante) en un tiempo corto. La velocidad de sedimentacin Vg de una partcula en un fluido menos denso bajo la influencia de la fuerza gravitacional est dada por la Ley de Stokes

Vg = D 2
D: dimetro de la partcula 1: densidad de la partcula 2: densidad del lquido : viscosidad del fluido g: aceleracin de la gravedad

1 2 g 18

En una centrfuga g es reemplazada por w2r, donde r es la distancia de la partcula al centro de rotacin y w es la velocidad angular de la centrfuga (radianes seg.1). W = n/30 n = velocidad rotacional en revoluciones por segundo Por lo tanto, la fuerza centrifuga aumenta la velocidad de sedimentacin de Vg a Vs, es decir:

rw2 Vs = Vg g
De esta ecuacin se puede deducir que la velocidad de sedimentacin de una partcula puede aumentar por: 1234aumento del dimetro de la partcula (D) aumento de la diferencia entre las densidades de la partcula y el fluido (1 - 2) aumento de la velocidad de centrifugacin (w) disminucin de la viscosidad del liquido de la suspensin

Adems aumentando el tiempo a que la partcula es sometida a la fuerza centrfuga, mayor ser el desplazamiento de la misma desde el centro de rotacin, de acuerdo a: Vs t = distancia recorrida Esto se logra aumentando el tiempo de centrifugacin A bajas velocidades de centrifugacin se podrn sedimentar clulas enteras pero quedarn en suspensin los componentes celulares como ncleos, mitocondrias y restos

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de membranas, a estos habr que aplicarles, segn su tamao, mayor velocidad de centrifugacin para sedimentarlos.

Condiciones de centrifugacin 1000 x g, 5 min. 4000 x g, 10 min. 15.000 x g, 20 min. 30.000 x g, 30 min. 100.000x g, 3 h

Fracciones sedimentadas Clulas, ncleos. Cloroplastos, restos celulares. Mitocondrias, peroxisomas. Lisosomas Ribosomas y polisomas, membranas

La velocidad de centrifugacin puede estar definida en g (aceleracin de la gravedad) y nos indica cuantas veces la aceleracin de la gravedad debo aplicarle a una partcula para que sedimente en determinado tiempo de centrifugacin o en rpm (revoluciones por minuto) las cuales dependern del radio del rotor o radio de giro. Existen tablas que nos indican a cuantas rpm debemos centrifugar una muestra en un determinado rotor para someterla a los g necesarios para sedimentarla. En el caso de las ultracentrfugas, por ej. la velocidad de centrifugacin alcanza a los 60000 rpm, que para una partcula localizada a 6 cm del eje rotacional corresponde a una fuerza 250.000 veces mayor que la gravitacional (250000 g) Diferentes tipos de centrfugas La parte fundamental de cualquier centrfuga es el rotor (donde se insertan los tubos conteniendo las muestras), y segn el tipo de centrifuga puede poseer adems refrigeracin y un sistema para producir vaco. Existen diferentes tipos de centrfugas dependiendo de las velocidades de centrifugacin: 1) Centrfuga tipo clnica. Para bajas velocidades (0 5000 rpm), normalmente se utiliza para separar clulas, algunas poseen refrigeracin. 2) Centrfuga tipo Sorvall. Alcanza hasta 20.000 rpm y poseen refrigeracin. 3) Ultracentrfugas. Para altas velocidades de centrifugacin (hasta 80.000 rpm), poseen refrigeracin y un sistema de vaco para disminuir la fuerza de rozamiento con el aire y lograr altas velocidades. Por otro lado segn la finalidad de la centrifugacin, las centrfugas pueden ser analticas o preparativas. a) Las centrfugas analticas son ultracentrfugas y se trabaja con muestras pequeas. En general se emplean para determinar el peso molecular de las partculas. b) Las centrfugas preparativas son capaces de trabajar con grandes muestras (10 2.000 ml), se utiliza para separar diferentes fracciones subcelulares. Pueden ser tipo Sorvall o Ultracentrfuga.

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TP # 7

Permeabilidad de las Membranas Celulares

Introduccin Las membranas biolgicas tienen la propiedad de ser semipermeables y selectivas. Las sustancias pueden atravesar la membrana celular por difusin pasiva o por alguno de los mecanismos de transporte activo El transporte de las molculas depende de su peso molecular, su carga elctrica y del coeficiente de solubilidad en lpidos. La difusin se produce cuando existe un gradiente de concentracin, y ocurre desde el lugar de mayor concentracin hacia el de concentracin menor. La membrana celular mantiene un balance entre la presin osmtica de los lquidos intracelulares e intersticiales. Las soluciones pueden ser isotnicas, hipotnicas o hipertnicas respecto al lquido intracelular. Objetivos Determinacin de la hemlisis y resistencia globulares Materiales Ratas Heparina ClNa Sacarosa Agua destilada Jeringas y agujas 23 G Alcohol 96% Gradillas con tubos de hemlisis Centrfuga Espectrofotmetro Microscopio Portaobjetos y cubreobjetos

Metodologa Obtener sangre de una rata mediante puncin cardiaca con jeringa heparinizada. Preparar una batera de tubos de hemlisis con distintas soluciones de ClNa (5 mL volumen final) , como indica la tabla adjunta. Agregar 50 l de sangre suavemente en cada tubo. Se agitan suavemente los tubos y se colocan en la gradilla en orden creciente de concentracin. Luego de 10 minutos se centrifugan las distintas muestras (1500 rpm, 5 minutos).

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Tabla 1:
SOLUCION SOLUTO SOLVENTE CONCENTRACION (NaCl) (AGUA) ml en % OBSERVACIONES

MADRE 1 2 3 4 5 6 7

9 100 9 100 1:2 1:10 1:2 de 3 1:10 de 3 1:100 de3 Agua

Nota: complete el cuadro. Mr del NaCl = 58,5 Conclusiones Confeccionar un informe luego de observar la turbidez, tonalidad, microscopa de los sedimentos y lectura espectrofotomtrica correspondiente al sobrenadante cada tubo (480nm). El mismo debe contener resultados obtenidos y conclusiones. Autoevaluacin 1) Esquematice la estructura de la membrana plasmtica. Mencione brevemente la funcin de cada uno de sus componentes. 2) Explique los mecanismos por los cuales son incorporados los siguientes elementos a las clulas considerando los componentes de la membrana involucrados y el requerimiento energtico: glucosa, Na+, agua, bacterias, hormonas esteroideas, glicerol, Cl-, micropartculas inertes.

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Cultivo de Tejidos
Se entiende por cultivo celular al conjunto de tcnicas que permiten el mantenimiento de las clulas in vitro, conservando al mximo sus propiedades fisiolgicas, bioqumicas y genticas. Se podra hablar de tres tipos de cultivos: Cultivo de rganos: implica que la arquitectura caracterstica del tejido in vivo se mantiene al menos en parte. Este tipo de cultivo permite mantener los tipos celulares diferenciados y es por ello una buena replica del tejido de origen, aunque no permite su propagacin. Explantes primarios: Fragmentos de tejidos o de rganos que se adhieren a una superficie y en el que proliferan las clulas de la periferia del explante. Cultivo de clulas: Supone una disgregacin celular por medios enzimticos o mecnicos. Este tipo de cultivo puede propagarse, aumentando la masa celular del mismo. Una vez que el cultivo se ha propagado por algunas generaciones, ste pierde la heterogeneidad celular de partida, la poblacin se hace uniforme y homognea ya que predominan en el cultivo aquellos tipos celulares que tienen superior tasa de crecimiento. CULTIVO PRIMARIO: cultivo de clulas provenientes de la disgregacin de un tejido original tomado de algn rgano animal. Este tipo de cultivo se caracteriza por conservar la morfologa celular de origen, ser diploides, poseer un crecimiento celularin vitro limitado y por tener inhibicin por contacto (ej: hepatocitos, neuronas). Aquellos cultivos primarios que proliferan in vitro pueden ser replaqueados o subcultivados. Cuando esto ocurre se establece una LINEA CELULAR PRIMARIA o FINITA, con caractersticas similares a las del cultivo primario. En una lnea primaria el cultivo se estabiliza y presenta mayor homogeneidad, ya que el tipo celular con mayor tasa de crecimiento desplaza a los otros tipos celulares. (Generalmente existen medios de cultivo selectivos para el tipo celular de inters). Tanto los cultivos primarios como las lneas primarias tienen un tiempo de vida limitado, finalmente las clulas entran en una fase de senescencia, con acumulacin de numerosas anormalidades, perdida de funciones especializadas, etc. que conducen a la muerte del cultivo. (ej: fibroblastos, HUVEC) Ocasionalmente una lnea primaria puede mantenerse en cultivo por ms generaciones de las esperadas, esto se debe a la aparicin en el cultivo de clulas inmortales. Estas clulas forman cultivos estables o LINEAS CELULARES CONTINUAS o

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INFINITAS. La razn de la inmortalizacin de estas clulas en muchos casos es desconocida generalmente estn relacionadas con la perdida espontnea o inducida de las vas de control del ciclo celular. Las lneas celulares continuas estn formadas por clulas que se diferencian gentica y morfolgicamente de las clulas de las cuales se originaron. Pueden provenir de clulas derivadas de tumores o de una lnea primaria que ha sido transformada mediante la transfeccion de oncogenes o el tratamiento con carcinognicos. Este tipo de cultivo tiene la caracterstica de ser aneuploide, de no tener inhibicin por contacto y de crecer de manera indefinida. Entre las lneas mas conocidas se encuentran las HeLa, K-562, Meg-01. Condiciones de Cultivo Recipientes de cultivo: placas de petri, multiplacas, etc. Sustrato: Muchas lneas celulares crecen en monocapas unidas a un soporte ms o menos slido (vidrio, superficies plsticas, superficies tratadas con colgeno, fibronectina o gelatina). Aquellas lneas que para proliferar necesiten adherirse se conocen como dependientes de anclaje, las lneas que crecen en suspensin son por lo tanto independientes de anclaje. Fase gaseosa: a) Oxgeno: Las necesidades de oxigeno de la mayora de los cultivos esta cubierta por la presin atmosfrica de este gas. b) Dixido de Carbono: Este gas es fundamental porque influye en la cantidad de CO2 disuelto el pH y la cantidad de iones HCO3Las reacciones que tienen lugar son: H2O + CO2 H2CO3 H+ + HCO3- (1) NaHCO3 Na+ + HCO3- (2) El incremento de la concentracin del ion HCO3- desplaza la ecuacin (1) hacia la izquierda de modo que el pH se establezca en 7.4. Cada medio tiene una concentracin recomendada de bicarbonato y presin de CO2 para alcanzar el pH correcto. pH y capacidad buffer: El pH ptimo de crecimiento para la mayora de los tipos celulares es 7.4. El indicador de pH que se suele usar es rojo fenol. El medio de cultivo debe tener capacidad buffer, a fin de evitar cambios bruscos de pH. El sistema buffer mas utilizado es el del bicarbonato Temperatura

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Medio de cultivo: formado por los siguientes elementos: 1. Soluciones salinas equilibradas 2. Aminocidos 3. Vitaminas 4. Otros suplementos orgnicos de bajo peso molecular 5. Hormonas y factores de crecimiento (suero) 6. Antibiticos y antifngicos. Algunos de los medios mas utilizados son: Medio Mnimo Esencial de Eagle (MEM); RPMI 1640, MEM modificado (DMEM); Medio 199. Los medios no definidos son aquellos que deben ser suplementados con suero. Alguno de los mas empleados son: suero de ternera (calf serum, CF), fetal bovino (fetal calf serum, FCS); suero de caballo (horse serum, HS); y suero humano (Human serum, HuS). A pesar que la composicin del suero es conocida, los componentes presentes pueden tener concentraciones variables que podran influir en el cultivo. El tipo de medio de cultivo y como ser suplementado depende de los requerimientos de la lnea celular a cultivar. Los estudios que emplean cultivos celulares abarcan gran nmero de disciplinas y aproximaciones al estudio del fenmeno celular como: actividad intracelular, ecologa e interacciones celulares. Dentro de las reas de estudio que ms utilizan este tipo de tecnologa se encuentran la virologa, inmunologa y aquellas disciplinas dedicadas a la investigacin del cncer.

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La Fagocitosis: Resea histrica

En 1908, 20 aos despus de su incorporacin al Intituto Pasteur, Elie Metchnikoff (1845-1916) comparti el premio Nobel en Fisiologa & Medicina con Paul Ehrlich. Este premio fue otorgado a Metchnikoff por su descubrimiento de la fagocitosis como base de la inmunidad mediada por clulas y a Ehrlich por sus estudios en anticuerpos e inmunidad humoral. Metchnikoff contempl el proceso de fagocitosis dentro del amplio concepto de Harmony and Disharmony que describa la compleja relacin entre los patgenos y sus hospedadores.

Cien aos despus, la importancia del legado de Metchnikoff es ms que evidente. Metchnikoff propuso que la fagocitosis era un mecanismo antigo que se origin en los metazoos primitivos y que los provey de un sistema de defensa operativo de rpida accin contra los microorganismos. Hoy sabemos que los fagocitos tambin juegan un rol crucial en la inmunidad adaptativa de los organismos superiores, reconciliando as la inmunidad celular de Metchnikoff con la inmunidad humoral de Ehrlich. (2008; 120 aniversario, Institut Pasteur).

Introduccin Los macrfagos pulmonares constituyen la primera lnea de defensa del organismo evitando la entrada de una gran variedad de sustancias como: gases atmosfricos, partculas de polvo, aerosoles y microorganismos. A pesar del gran nmero de partculas infecciosas que son depositadas continuamente sobre las paredes alveolares del pulmn, su superficie generalmente se encuentra estril. El poder bactericida del pulmn se debe al potencial fagoctico y ltico (proteasas, elastasas, etc.) de los macrfagos alveolares. Estas

clulas ingieren el material extrao que llega al pulmn mediante el proceso de fagocitosis. Muchos patgenos infectan y replican dentro de los macrfagos, interfiriendo con los procesos celulares que eliminan a la mayora de los microorganismos. En el siguiente sitio de la revista Nature, se muestran estos eventos en Listeria monocytogenes, Legionella pneumophila y M. tuberculosis: http://www.nature.com/nrmicro/ani mation/imp_animation/allthree_qt.m ov

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TP # 9 Fagocitosis de partculas por macrfagos alveolares

Objetivos Objetivo 1. Obtener una poblacin casi homognea de macrfagos alveolares mediante lavado bronqueoalveolar (BAL) Objetivo 2. Estudiar el fenmeno de fagocitosis in vitro a distintas temperaturas. Objetivo 3. Cuantificacin Celular: empleo de cmara de Neubauer Materiales Ratas, ratones o hmsters Anestsico Cnulas nasofaringeas de polietileno Jeringa PBS y PBS libre de Ca+2 Mg+2 Material de ciruga Tubos de centrfuga Centrfuga de mesa Medio de cultivo Dulbecco o RPMI 1640 Partculas de hierro Cpsulas de Petri Bao termostatizado o estufa a 37C Alcohol 96% Colorante vital azul de tripn o rojo neutro Colorante hematoxilina Microscopio ptico Cmara de Neubauer

Metodologa Obtencin de los macrfagos: Anestesiar al animal, exponer la trquea e introducir una cnula adosada a una jeringa de 3ml que contenga PBS libre de Ca+ Mg+. Masajear suavemente la caja torxica y recuperar la solucin. Descartar este primer lavado alveolar. Repetir el procedimiento y guardar la solucin recuperada en un tubo de centrfuga. Repetir este procedimiento 1012 veces. Centrifugar el material recolectado 10 minutos a 800 x g. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en medio RPMI-1640 y contar el nmero de clulas. Evaluar la viabilidad celular de los macrfagos alveolares obtenidos utilizando algn colorante vital. Sembrar las clulas en cpsulas de Petri e incubar en cmara de cultivo (37C, 5 % CO2). Exponer los cultivos celulares a las a partculas previamente sonicadas. El volumen a utilizar de la suspensin ser indicado por los docentes. Incubar 1 h a 4C, 20C (T ambiente) y a 37C. Descartar el medio, lavar las clulas con PBS y fijarlas con alcohol 96%. Teir las clulas con hematoxilina Observar bajo microscopio.
Nota 1: Partculas: Alternativamente se emplearan particulas de hierro, carbon o material derivado de la polucin en el aire (ceniza residual de combustibles), denominado ROFA (residual oil fly ash).

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Anlisis de Resultados - Graficar el nmero de clulas que incorporaron partculas de hierro vs las distintas temperaturas. Confeccionar un informe final analizando los resultados obtenidos.

Nota 2: Como consecuencia de los tiempos necesarios para el establecimiento del cultivo de macrfagos, los alumnos recibirn las cajas de Petri conteniendo clulas extradas previamente. Durante la prctica, se realizar un BAL en animales de laboratorio, tal como indica el protocolo descripto. Las clulas obtenidas por los alumnos, sern utilizadas para evaluar el rendimiento de dicho protocolo mediante la cuantificacin celular utilizando la cmara de Neubauer.

Autoevaluacin -Complete el siguiente cuadro referido a los procesos involucrados en el transporte de sustancias hacia y desde el interior de la clula. Caractersticas Difusin Fagocitosis Endocitosis Cules son las caractersticas estructurales y funcionales de los filamentos intermedios? Seale los principales grupos en que fueron clasificados. Mencione qu tcnicas utilizara para visualizar microtbulos y microfilamentos. Objetivo 3 Evaluar el rendimiento del protocolo de BAL mediante la cuantificacin celular utilizando la cmara de Neubauer. Materiales -Cmara de recuento/ cmara de Neubauer/ hemocitmetro -Microscopio -Suspensin celular Procedimiento: -Realizar una dilucin de la muestra utilizando en colorante azul de trypan. -Cargar la cmara con una micropipeta como se indica en la figura. Ejemplo del elemento transportado

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Recuento Celular

Cada cuadrado del hemocitmetro (16 cuadrados menores) representa un volumen total de 0.1 mm3 o 10-4cm3. Como 1 cm3 es aproximadamente equivalente a 1 ml, la concentracin celular por ml (y el nmero total de clulas) se determina realizando los siguientes clculos: Clulas por ml: El promedio de clulas por cuadrado x el factor de dilucin x 104 Clulas totales: Clulas por ml x el volumen original de la muestra Responda: Si el promedio de clulas por cuadrado es de 25 y para poder contar realiz una dilucin 1/20: Cuntas clulas por ml recuper de un BAL en rata?. Si recuper un volumen de lavado de 5 mL: cuntas clulas totales obtuvo?

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TP # 10 Divisin Celular: Mitosis

Divisin Celular El crecimiento, reparacin y renovacin de todos los organismos multicelulares depende de la formacin de nuevas clulas a travs de la divisin de las clulas preexistentes. Existen dos mecanismos para la divisin celular: la mitosis en las clulas somticas y la meiosis en las clulas germinales. Ambas formas de divisin presentan muchas caractersticas comunes, aunque difieren en el comportamiento de los cromosomas durante las fases iniciales de la divisin. Mitosis: La divisin mittica da lugar a dos clulas hijas que poseen copias idnticas del genoma de la clula original. El ADN se replica antes del inicio de la divisin celular (periodo S). El periodo entre los episodios sucesivos de divisin celular se denomina interfase. La secuencia de acontecimientos que ocurren durante la mitosis se ha dividido en cinco fases: profase, prometafase, metafase, anafase y telofase. Objetivo Observar las distintas fases de la mitosis en meristema apical de raz de cebolla (Allium cepa)

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Divisin Celular: Meiosis

Como hemos visto en el TP anterior la mitosis da como resultado la formacin de dos ncleos hijos, cada uno de los cuales recibe una copia exacta de los cromosomas de las clulas progenitoras. Durante la meiosis cada ncleo diploide se divide dos veces produciendo un total de cuatro ncleos, cada uno de los ncleos contiene la mitad del nmero de cromosomas presentes en el ncleo original. Los ncleos haploides obtenidos durante la meiosis contienen nuevas combinaciones de cromosomas. Los cromosomas homlogos derivados originalmente de los padres del organismo estn distribuidos al azar entre los cuatros nuevos grupos haploides. La meiosis consiste en dos divisiones nucleares sucesivas: Meiosis I y Meiosis II En la Meiosis I los cromosomas homlogos se aparean y luego se separan (etapa reduccional). Las etapas de la Meiosis I son: profase I, prometafase I, metafase I, anafase I y telofase I. En la Meiosis II se separan las cromtides de cada homlogo. Las etapas se denominan: profase II, prometafase II, metafase II, anafase II y telofase II. La profase II no est precedida por la duplicacin del material gentico. Objetivo Esquematizar las diferentes fases de la meiosis en cortes histolgicos de testculo de rata y/o vizcacha.

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El ADN: Resea histrica

El cido desoxiribonucleico (ADN) fue aislado por primera vez en 1869 por el cientfico suizo Friedrich Miescher. Para finales de los 1940s, los cientficos conocan la composicin del ADN: fosfato, azcar y cuatro bases que contenan nitrgeno (adenina, timina, guanina y citosina). Gracias a los experimentos de Frederick Griffith y Oswald Avery, se saba que el ADN era la molcula de la herencia de los caracteres, planteada por Gregor Mendel en el siglo anterior. Los experimentos de Erwin Chargaff, mostraron que la cantidad de adenina en una clula era casi idntica a la cantidad de timina, asimismo, la cantidad de guanina era comparable a la cantidad de citosina (A=T, y G=C). Sin embargo, nadie imaginaba la estructura de la molcula. En 1953, Linus Pauling sostuvo que haba descubierto la estructura del ADN, sin embargo cuando Watson vio el trabajo de Pauling, que an no se haba publicado, supo que no era correcto. Unos das despus, lleg a las manos de Watson una fotografa de difraccin de rayos X tomada a partir de cristales de ADN por Rosalind Franklin. Ms tarde Watson escriba:

"The instant I saw the picture, my mouth fell open and my pulse began to race" Watson, The Double Helix (1968).

El descubrimiento de la doble hlice fue publicado en Nature el 25 de Abril de 1953 'A Structure for Deoxyribonucleic Acid' by Watson, J.F., and Crick, F.H.C. Los autores comprendieron que del modelo de apareamiento de bases especfico que proponan, se desprenda directamente un posible mecanismo de copiado del material gentico. En 1962, Watson and Crick recibieron el premio Nobel de Fisiologa y Medicina, junto a Maurice Wilkins, quien haba publicado junto a R. Franklin el importante trabajo de cristalografa, en el mismo nmero de Nature. Rosalind Franklin, cuya fotografa di un indicio importante a Watson, muri en 1958. Los cientficos se preguntan si hubiese sido distinguida con el premio si hubiera estado viva.
La primer ADN polimerasa, la ADN polimerasa I de E. coli, fue descubierta en el ao 1955 en el laboratorio de Arthur Kornberg. Discovery of DNA polymerase. Lehman, 2003 disponible en http:// www.jbc.org

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Extraccin de ADN
Introduccin Mediante la utilizacin de distintos protocolos se puede obtener ADN de al menos tres clases diferentes. 1. ADN cromosmico celular Este ADN celular puede ser obtenido a partir de un cultivo de bacterias, de plantas, de clulas animales o de cualquier otro tipo de organismo que este siendo estudiado. 2. ADN plasmdico. La preparacin de ADN plasmdico a partir de un cultivo de bacterias sigue los mismos pasos bsicos de purificacin de ADN cromosmico celular, con la crucial diferencia que en algunos pasos, el ADN plasmdico debe ser separado del ADN cromosmico, que tambin est presente en la clula bacteriana. 3. ADN de bacterifagos o fagos (virus que infectan bacterias), ampliamente usado como vehculo de clonado. Fundamentos de la extraccin de ADN celular Los procedimientos para la preparacin de ADN cromosmico a partir de un cultivo celular bacteriano pueden ser divididos en 4 etapas: 1) 2) 3) 4) Cultivo y recoleccin. Lisis celular. Eliminacin de los restos celulares. Concentracin de ADN puro.

Luego se centrfuga para eliminar el sobrenadante que contiene el medio de cultivo, y se continua con el pellet, que contiene las bacterias. 2-Lisis celular: Todos las clulas bacterianas estn rodeadas por una rgida pared celular. Para liberar los componentes celulares de estas barreras, se utiliza la lisis qumica. Esta lisis qumica, suele involucrar un agente que ataca a la pared y otro que rompe la membrana. 3-Eliminacin del debris celular: Este proceso puede llevarse a acabo por centrifugacin, dejando el extracto celular como un sobrenadante claro que contiene ADN; ARN; y algunas protenas y el pellet con restos de membrana celular. Los procedimientos estndar para eliminar los contaminantes del ADN son los siguientes: 1. Para eliminar las protenas se adiciona una mezcla de fenol: cloroformo (1:1) que producen la precipitacin de las protenas, pero dejan a los cidos nucleicos (ADN y ARN) en solucin acuosa. 2. Para eliminar ARN, se trata la muestra con la enzima RIBONUCLEASA (RNAsa). sta degrada rpida y completamente todas las molculas de RNA hasta dejarlo reducido a sus subunidades ribonucleotdicas.

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En este punto hay que hacer una importante distincin entre la purificacin de ADN cromosmico y la purificacin de ADN plasmdico: en una preparacin de plsmido, siempre es necesario separar el ADN plasmdico de la gran cantidad de ADN cromosmico bacteriano que est tambin presente en las clulas. Actualmente existen varios mtodos para la separacin de ambos tipos de ADN, basados en diferencias fsicas entre el ADN plasmdico y al ADN cromosmico. De estas diferencias, la ms utilizada es el tamao. Los plsmidos ms grandes son solamente el 8% del tamao del cromosoma de E. coli, y la mayora de los plsmidos son mucho ms pequeos. Generalmente se utilizan tcnicas como la lisis alcalina, esta condicin desnaturaliza los cidos nucleicos, luego por tratamiento renaturalizante el ADNp se renaturalizar mas rpida y eficientemente que el ADNc debido a la diferencia de tamao entre ellos, permitiendo su separacin, pudindose obtener de modo efectivo ADN plasmdico. 4-Concentracin de ADN puro: generalmente la concentracin de ADN obtenida luego de los pasos arriba mencionados es baja. Para concentrarlo se utiliza ms frecuentemente la precipitacin con etanol o isopropanol. En presencia de sal y a una temperatura de 20C o menos, el etanol absoluto precipita eficientemente los polmeros de cidos nucleicos. El precipitado puede ser recolectado por centrifugacin, eliminacin del sobrenadante y resuspensin del pellet en un volumen adecuado de agua o buffer.

Qu son los Plsmidos? Adems de un cromosoma, las clulas bacterianas, habitualmente contienen plsmidos. Estos son molculas de ADN que estn presentes en prcticamente todo tipo de bacterias y juegan un rol crtico en la capacidad de adaptacin y en la evolucin de las mismas. Su replicacin es autnoma y aunque no este sincronizada con la del cromosoma, depende de factores del hospedador para llevarse a cabo. El nmero de copias de plsmidos por clula es variable y depende de las caractersticas del mismo (plsmidos de alto o bajo nmero de copias) y a su vez, una misma clula puede contener ms de un tipo de plsmido. Al igual que los cromosomas, los plsmidos codifican para ARN y protenas, pero, sin embargo, no codifican para funciones esenciales del crecimiento bacteriano. En cambio, proveen productos que pueden beneficiar a la bacteria bajo circunstancias especiales; por ejemplo, sobrevivir en condiciones adversas del medio o competir con otros microorganismos que ocupan el mismo nicho ecolgico.

TP # 11: Protocolo de Extraccin de ADN genmico

A-Soluciones: 1- Buffer TE 10 X: EDTA Tris-HCl 100mM pH 8,0 2- Dodecil sulfato de sodio (SDS) 10% 3- Proteinasa K, 10 mg/mL 4- Cloroformo/alcohol isoamlico 24:1 5- NaCl 5M 6- Isopropanol B- Materiales 1- Cultivo en fase exponencial E. coli DH5
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2- Tubos eppendorf de 2 mL: 3 por grupo 3- Bao termostatizado regulado a 65 C 4- recipientes con hielo granizado 5- guantes 6- pipetas automticas 7- capilares o varillas de vidrio Previo al inicio del protocolo: Preparar el bao a 65C, dispensar 2mL del cultivo en los tubos eppendorf. Sellar uno de los extremos de los capilares (se usar 1 por grupo). Poner en hielo o congelador el isopropanol. Tener preparado por cada grupo un tubo con 200 uL de buffer TE 1X. Procedimiento 1) Centrifugar por 2 min los tubos con clulas. Descartar el SN y eliminar las trazas de medio en papel absorbente. 2) Resuspender el pellet en 400 uL de buffer TE, asegurndose de que no queden grumos. 3) Agregar 50 uL de SDS 10 % y 10 uL de PK, mezclar el tubo por inversin e incubar 20 min a 65C (la suspensin se torna transparente). 4) Agregar 100 uL de NaCl, mezclar. 5) Agregar 600 uL de Cloroformo/alcohol isoamlico. Mezclar repetidas veces por inversin hasta tener una solucin homognea (1 fase) y blanquecina. 6) Centrifugar a 12.000xg por 10 min (se forman dos fases). 7) Transferir la fase acuosa (superior) a un nuevo tubo. Hacerlo cuidadosamente con pipeta, evitando levantar la capa blanquecina que se encuentra en la interfase. 8) Agregar suavemente con pipeta 400 uL de isopropanol fro (evitando que se mezclen las fases). 9) Introducir suavemente un capilar en el tubo hasta la interfase y realizar muy suavemente movimientos circulares en la interfase, y comenzarn a visualizarse las hebras de ADN de color blanquecino. 10) Pese a que la idea es que por los movimientos circulares y la carga de la varilla, el ADN se enrolle a esta; esto es difcil de lograrlo en microtubos. Por lo tanto, luego de haber realizado esta observacin, retirar la varilla, cerrar el tubo e invertir cabeza-cola unas 15-20 veces. De esta manera el ADN formar una masa algo ms compacta y visible. Abrir el tubo, y con la misma varilla, retirar el ADN, colocndolo suavemente, agitando la varilla en un tubo conteniendo EDTA 1X. 11) Conservar a 4 C para permitir su completa resuspensin.

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ELECTROFORESIS: Geles de Agarosa

INTRODUCCIN En una separacin electrofortica, las partculas cargadas, migran en un medio determinado con direccin al electrodo de signo opuesto. Esto ocurre, bajo la influencia de un campo elctrico externo, aplicado en una corrida electrofortica. Los movimientos de las partculas son retardados por la interaccin con una matriz slida, porosa e inerte en la que estn inmersas, la cual, acta como un tamiz. Todo este fenmeno, se lleva a cabo a su vez, en un medio acuoso (buffer) con iones que transmiten la corriente elctrica. La oposicin de la interaccin elctrica y del tamiz molecular resulta en una velocidad de migracin diferencial que permite separar los componentes de una mezcla de macromolculas (tanto cidos nucleicos como protenas), basndose en el tamao, forma y carga neta de las macromolculas. Una electroforesis puede realizarse en geles de agarosa o en geles de poliacrilamida dependiendo del material a resolver. La agarosa es un polmero lineal de hidratos de carbono, extrado de un alga marina, los geles se preparan fundiendo la agarosa en el buffer elegido. Los geles de poliacrilamida se generan por la polimerizacin de la acrilamida y la bis-acrilamida mediada por un catalizador. Ambos mtodos son utilizados para la separacin, identificacin y purificacin de fragmentos de ADN. En el caso de los geles de poliacrilamida tambin se utilizan para separar protenas a partir de un extracto celular. La tcnica es simple y rpida de realizar, es capaz de resolver fragmentos de ADN que no pueden separarse por otros mtodos. Adems, la localizacin del ADN dentro del gel puede determinarse directamente mediante tinciones con bajas concentraciones de un colorante fluorescente intercalar, llamado: Bromuro de Etidio (BrEt). As, las bandas que contengan tan solo de 1 a 10 ng de ADN podrn ser visualizadas por examen directo del gel bajo luz ultravioleta. Si resulta necesario las bandas pueden recuperarse del gel para ser utilizadas posteriormente con otros propsitos. Los geles pueden confeccionarse de varias formas, tamaos y porosidad, y pueden correr horizontales los agarosa y verticales los de poliacrilamida, en un campo elctrico de fuerza y direccin constante. La eleccin dentro de estos parmetros depende principalmente del tamao de los fragmentos que se desean separar. Los geles de poliacrilamida son ms efectivos para separar fragmentos pequeos de ADN (5 a 500 pb), y su poder de resolucin es extremadamente grande, pudiendo separar fragmentos que difieren en 1 pb. Los geles de agarosa, poseen un poder resolutivo menor respecto de los geles de poliacrilamida, pero poseen un rango mayor de separacin. Mediante concentraciones variables de agarosa, se pueden separar fragmentos de ADN desde 200 pb hasta aproximadamente 50 kb de longitud.

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Factores que afectan la tasa de migracin del ADN en geles de agarosa

1) Tamao molecular del ADN Las molculas de ADN de doble cadena, migran a travs de la matriz del gel, a tasas que son inversamente proporcionales al nmero de pares de bases que ellas contienen. En consecuencia, las molculas ms grandes, migran mucho ms lentamente debido a que sufren una gran friccin y resistencia. 2) Concentracin de Agarosa Un fragmento lineal de ADN, de un tamao determinado, migra a diferentes tasas a travs de geles que contienen diferentes concentraciones de agarosa. A medida que se aumenta la concentracin de agarosa, los poros formados en la matriz del gel de agarosa disminuyen en tamao. As, mediante la utilizacin de geles con diferentes concentraciones de agarosa, es posible resolver un amplio rango de tamaos de molculas de ADN. 3) Conformacin del ADN La molcula de ADN puede presentarse en varias conformaciones. En primer lugar, puede estar en su forma lineal como existen en los eucariotas. En segundo lugar, tambin existen molculas de ADN circulares, las cuales pueden presentar varias formas dependiendo del superenrrollamiento que posean o debido a la presencia de algn nick en la doble hlice. De este modo, si tenemos las diferentes formas de ADN, pero del mismo tamao molecular, las tasas de migracin de las diferentes formas a travs del mismo gel sern distintas. 4) Voltaje aplicado A bajo voltaje, la tasa de migracin de fragmentos lineales de ADN, es proporcional al voltaje aplicado. Sin embargo, a medida que la fuerza del campo elctrico se incrementa, la movilidad de los fragmentos de ADN de alto PM incrementa diferencialmente; por lo tanto, el rango efectivo de separacin en geles de agarosa decrece cuando el voltaje se incrementa. 4) Direccin del campo elctrico, composicin de bases y temperatura El comportamiento del ADN en geles de agarosa, a diferencia de lo que ocurre con los geles de poliacrilamida, no esta afectado significativamente por su composicin de bases ni por la temperatura a la cual se corre el gel. Por lo tanto, en geles de agarosa en un campo elctrico de direccin constante, la movilidad electrofortica de fragmentos de ADN de diferentes tamaos no cambia entre 4 C y 30 C.

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6) Presencia de colorante intercalares: El BrEt, es el colorante fluorescente utilizado para detectar ADN en geles de agarosa y poliacrilamida. Afecta la tasa de migracin reduciendo la movilidad electrofortica del ADN lineal en un 15%. El colorante se intercala entre las bases apiladas de las molculas de ADN hacindolas mas rgidas, lo cual, produce la disminucin de la movilidad. El bromuro de etidio es un agente altamente mutagnico y debe manipularse con mucho cuidado, utilizando guantes. Todas las soluciones conteniendo BrEt deben decontaminarse (con carbn activado) antes de ser descartadas. 7) Composicin del buffer de corrida: La movilidad electrofortica del ADN, est afectada por la composicin y la fuerza inica del buffer de electroforesis. En ausencia de iones (por ejemplo si se omitiera el buffer de corrida por error) la conductividad elctrica seria mnima y el ADN no migrara o lo hara muy lentamente. Por otro lado, en buffers con elevada fuerza inica (por ejemplo, si se utiliza un buffer de corrida al 10X) la conductividad elctrica es muy eficiente, generndose calor, pudindose alterar la matriz y desnaturalizarse el ADN. Existen diferentes buffers de corrida electrofortica de ADN de doble cadena, entre otros el TAE (Tris Acetato + EDTA), TBE (Tris Borato + EDTA) y TPE (Tris Fosfato+EDTA). Generalmente en las corridas es necesario utilizar marcadores de peso molecular. Estos, son fragmentos de ADN de tamao conocido, obtenidos comercialmente, y que deben sembrarse en el gel en un pocillo vecino al de la muestra y deben correrse conjuntamente. Esto facilita la determinacin del tamao de los fragmentos de ADN contenidos en la muestra, por comparacin de las bandas de la muestra con los marcadores de peso molecular. Geles de agarosa : corrida Una vez efectuada la siembra de todas las muestras, se procede a tapar la cuba de electroforesis y a conectar los cables correspondientes para aplicar el voltaje deseado. As el ADN migrar hacia el nodo (rojo). El voltaje aplicado ser de 1-5V/cm (medido como la distancia entre los electrodos). Si los electrodos se colocaron correctamente, se formarn burbujas en el nodo y el ctodo y en unos pocos minutos el azul de bromofenol comenzar a migrar desde el lugar de siembra. El gel se corre, generalmente, hasta que el frente de corrida (formado por los colorantes del loading buffer) haya migrado una distancia apropiada a travs del mismo. La presencia de BrEt permite que el gel pueda ser examinado bajo luz U.V. en cualquier momento durante la corrida. En principio, la corrida puede efectuarse en presencia o en ausencia del BrEt tanto en gel como en buffer. Si se efecta en ausencia del colorante, es necesario teir el gel una vez finalizada la electroforesis (sumergiendo el gel en una solucin de BrEt (0.5g/ml en buffer de corrida al 1X)

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Geles de Agarosa: Visualizacin del ADN La visualizacin del ADN en geles de agarosa teido con el colorante fluorescente bromuro de etidio, es debido, a que el grupo planar de esta molcula se intercala entre las bases apiladas del ADN. La posicin fija de este grupo y su cercana a las bases causa la unin del colorante al ADN que muestra una fluorescencia comparablemente mayor a aquella que posee el colorante libre en solucin. La radiacin U.V. a 254nm es absorbida por el ADN y transmitida al colorante, por otro lado la radiacin a 302nm y 366nm es absorbida por el colorante unido al ADN. En ambos casos, la energa es re-emitida a 590nm en la regin del rojo-naranja del espectro visible. En consecuencia, dado que la fluorescencia impartida por el complejo ADN: BrEt es mayor a aquella emitida por el colorante libre, es posible detectar pequeas cantidades de ADN en presencia de BrEt libre en el gel. As, como la unin del BrEt al ADN es directamente proporcional, la intensidad de la banda nos puede dar una estimacin de la cantidad de ADN presente en la muestra. Esto implica, que a mayor concentracin de ADN, la banda observada tendr una luminosidad mas intensa.

NOTA: El BrEt se utiliza para la visualizacin tanto de ADN como de ARN simple o doble cadena. No obstante, la afinidad del colorante por los cidos nucleicos de simple cadena es menor y por lo tanto la fluorescencia impartida es ms pobre.

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TP #12 Anlisis del ADN

Objetivo Evaluar el rendimiento de la extraccin de ADN Evaluar la integridad del producto obtenido Evaluar la copurificacin de otros cidos nucleicos PREPARACION DE GEL DE AGAROSA AL 1% 1. Pesar 0.5 gr. de agarosa 2. Diluir en 50 ml de TAE 1X 3. Calentar en microondas hasta disolver. Luego, enfriar a 60 C aprox. 4. Volcar en el molde o cama, previamente obstruidos sus bordes y colocado el peine. Evitar la presencia de burbujas. Dejar solidificar unos minutos a temperatura ambiente. 5. Llenar la cuba con buffer TAE 1X 6. Una vez solidificado el gel, (quitar la obstruccin y el peine del gel) y sumergirlos en la cuba. Dejar equilibrar unos minutos. 7. Mezclar en un parafilm 5 ul muestra + 5ul loading buffer. Sembrar con micropipeta P20 en el gel. 8. Conectar la cuba a la fuente de energa y correr 5minutos a 90 V, luego 15 minutos a 65 V. 9. Visualizar exponiendo el gel a la luz U.V.

Solucin Stock Buffer TAE 25X

121 gr. Tris-base 28.55ml. cido actico glacial 50 ml 0.5 M EDTA (pH: 8)

Nota 1: El BrEt, en esta prctica se encuentra mezclado en el loading buffer para mayor seguridad. Es de suma importancia usar guantes durante la prctica. Nota 2: Los loading buffers son utilizados para: 1. Incrementar la densidad de la muestra, con lo cual evita que el ADN difunda en el buffer en el momento de la siembra, adems facilita la carga de la muestra en cada pocillo. 2. Otorgar color a la muestra. Poseen colorantes que en un campo elctrico migran hacia el nodo a tasas predecibles independientemente de la concentracin de agarosa.

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Electroforesis: Geles de Poliacrilamida

Introduccin La separacin electrofortica de protenas ha sido introducida en los aos 1960s por Samuel Raymond. Modificaciones posteriores como la utilizacin de SDS y un agente reductor como el -mercaptoetanol han optimizado esta tcnica, convirtiendo al SDS-PAGE en una de tcnicas ms utilizadas en la actualidad para estudios bioqumicos y de biologa molecular. Bsicamente, la tcnica consiste en someter a una muestra compleja a un campo elctrico que se establece entre un par de electrodos de platino a travs de una solucin acuosa. La muestra migrar en una matriz (poliacrilamida) de acuerdo a distintas propiedades, tal como se explica a continuacin. Las protenas son molculas anfotricas, su carga neta est determinada por el pH del medio. De esta manera, en una solucin con un pH por encima de su punto isoelctrico, la protena tiene carga neta negativa y migra hacia el nodo (+). Contrariamente, debajo su punto isoelctrico, est positivamente cargada y migra hacia el ctodo (-).

PAGE (PoliacrylAmide Gel Electrophoresis) La carga por unidad de masa difiere de protena en protena. A un pH determinado y bajo condiciones nativas, la separacin electrofortica de protenas est determinada por el tamao y la carga de las molculas. Casi la totalidad de las electroforesis de protenas analticas se realizan bajo condiciones que aseguran la disociacin de de las protenas en sus subunidades polipeptdicas individuales y que minimizan su agregacin (condiciones desnaturalizantes). Comnmente se emplea el detergente aninico SDS en combinacin con un agente reductor y calor para disociar las protenas antes de su siembra en el gel. El polipptido desnaturalizado une al SDS y queda homogneamente cargado. Como la cantidad de SDS unido es proporcional al peso molecular del polipptido e independiente de su secuencia, el complejo SDS-polipptido migra a travs del gel de poliacrilamida de acuerdo al tamao (ver figura). Como la distancia de migracin est relacionada con la masa molecular del polipptido, entonces el SDS-PAGE no solo separa una mezcla compleja de protenas en bandas individuales, sino que tambin permite estimar la masa molecular de cada banda que representa un polipptido.

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Los geles son preparados utilizando armadores especiales donde se monta el dispositivo de la figura de ms abajo. Se vuelcan las soluciones de gel separador (A) y posterior a la polimerizacin se vuelca sobre ste, el gel concentrador (B) y se coloca el peine que formar los lugares de siembra (wells). Una vez polimerizado el gel, el peine se retira. Se muestra tambin una cuba donde se coloca el gel, se siembra la muestra, se cubre con el buffer de corrida y se conecta a la fuente de poder. Los modelos varan de acuerdo al fabricante.

Ctodo Peine

Well/calle Vidrio posterior Spacer (entre los 2 vidrios) Vidrio anterior

Compartimento para buffer

nodo

Para realizar la calibracin de cada gel, se utilizan estandares de peso molecular (marcadores de peso molecular), que son mezcla de protenas de masa molecular conocida. Esto ayuda a estimar la masa de las bandas incgnita. La unidad de masa se denomina Dalton (Da). La figura siguiente, muestra la resolucin de una muestra de protenas en geles con distinta concentracin de poliacrilamida. La densidad del gel establece un rango de masas moleculares que sern resueltas de manera ptima en una corrida. Para la visualizacin se realiz una tincin con azul de Coomassie.

MPM

7%

10%

12 %

60 kDa >

TP # 13 Separacin de Protenas
Objetivo: Evaluar distintas muestras de protenas mediante SDS-PAGE Analizar semicuantitativamente la concentracin de una muestra conteniendo una protena purificada 1. Obtencin del extracto celular de de protenas bacterianas. Se obtendrn las protenas totales mediante la lisis trmica de bacterias. Los docentes entregarn dos cultivos crecidos de dos especies bacterianas distintas. Con el fin de obtener las protenas a partir de un mismo nmero de clulas, se proceder como se indica: -Medir la DO600 de los cultivos y ajustar la concentracin celular a 10 % de transmitancia. -Tomar 1 mL de estas suspensiones bacterianas y peletear las clulas por centrifugacin (5 min, 10.000xg). Resuspender en 100 L de PBS -Agregar 100 L de buffer de siembra 2X (cracking buffer) y someter a 100 C las muestras por 5 min utilizando un bao de agua. Reservar en hielo hasta la siembra de los geles. 2. Semicuantificacin de la concentracin de protenas de una muestra Se sembrar en un gel una curva patrn (de concentracin conocida) y la muestra incgnita. Las muestras sern preparadas con el mismo V del buffer de siembra, y se sembrar el mismo V de todas las muestras. Nota: -No es necesario trabajar en esterilidad -Preparar con anterioridad el bao de agua y asegurarse de contar con flotadores para tubos eppendorf. 2. Preparacin de geles de poliacrilamida Gel Separador al 12% (5ml) 2 ml 1.3 ml (pH8.8) 1.7ml 50 ul 2 ul 50 ul Gel Stacking al 4% (1ml) 0.17ml 0.13 ml (pH6.5) 0.68 ml 10ul 1 ul 10 ul

Sn. Acrilamida-Bisacrilamida Buffer Agua bidestilada 10 % SDS TEMED 10% Persulfato de Amonio

Nota: Preparar las soluciones de cada tipo de gel sin Persulfato de Amonio, este se agrega en el momento de utilizarlo. Precaucin: La acrilamida y la bisacrilamida son neurotioxinas potentes y se absorben a travs de la piel. Su efecto es acumulativo. Utilizar guantes en la preparacin de las mezclas.
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Primero colocar el gel separador. Cubrir la superficie con etanol 96%, nbutanol o agua. Dejar polimerizar a temperatura ambiente (el tiempo depende de la T ambiental). Remover el etanol. Agregar el gel stacking y colocar el peine. Dejar polimerizar a temperatura ambiente unos minutos. Colocar el gel en la cuba de corrida. Remover el peine. Agregar el buffer de corrida hasta cubrir las calles. Sembrar las muestras (Vmax=15ul) NOTA: asegurarse que los vidrios se encuentren totalmente limpios, de lo contrario, realizar una limpieza con etanol. 3. Condiciones de corrida: Setear la fuente de poder 50mA/150 Volt. Cortar la corrida cuando el colorante llegue al final del gel. Tincin con Coomassie blue

4.

Finalizada la corrida electrofortica, se proceder al desarmado del cassette trabajando con sumo cuidado para evitar la rotura de los vidrios. - Incubar el gel en la solucin de azul de Coomassie 30 con agitacin. Descartar la solucin, lavar rpidamente con agua para eliminar el exceso de colorante. - Incubar con la solucin de desteido. Decolorear hasta que sean visibles las bandas y que el background sea el adecuado. -Transferir el gel a un recipiente con agua para la hidratacin del mismo. Guardar en heladera. NOTA: Los geles pueden secarse en secadores de geles especiales para su conservacin.

Anlisis de resultados 1. Se realizar el anlisis comparativo entre los perfiles proteicos obtenidos a partir de las bacterias. Incluya en el informe fotos de los geles junto a sus observaciones y comentarios. 2. Se informar la concentracin proteica de la muestra incgnita

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Soluciones -10X Buffer de corrida (Tris glicina) 32 g Tris base 144 g Glycine AguaCsp/1L Preparar para la corrida el buffer 1XSDS 10 % -2X Buffer de siembra (cracking buffer) Tris-Cl pH 6.8 125 mM glycerol 20% bromophenol blue 0.2 % SDS 4% B-mercaptoetanol 200 mM -Solucin de desteido 7.5% cido actico 20% etanol (o metanol)

-Azul de Coomassie 0.1% coomassie R-250 (Sigma) 40% etanol 10% cido actico -Acrilamida-Bisacrilamida 30 g Acrilamida 0.8 g Bisacrilamida Agua csp 1L

-1.5 M Tris HCl pH 8.8 -1M Tris-HCl HCl pH 6.8

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PROBLEMAS

http://www.sciam.com/article.cfm?id=what-are-we-thinking-when

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PRIMERA PARTE SOLUCIONES 1) a) b) c) % 2) a) b) Cmo preparara: 1000 ml de una solucin NaCl 0,32 M 500 ml de NaCl al 0,9 % Una solucin de NaCl que sea isoosmolar con una solucin de CaCl2 al 0,9

Cuntos ml de una solucin de NaCl al 5 % se precisan para preparar: 1500 ml de NaCl al 0,9 % 1500 ml de NaCl 0,15 M

3) Ud. desea preparar 1000 ml de una solucin de NaCl al 0,9 % que contenga PMSF 1 mM. El PMSF (P.M. = 174,2) es poco soluble en agua y muy soluble en etanol. Cmo resuelve el problema? 4) Cul es la concentracin mnima que debe tener una solucin de PMSF en etanol para preparar una solucin acuosa que contenga una concentracin final de 2 mM de PMSF y la concentracin de etanol no exceda el 0,1 %? 5) A partir de una solucin madre de NaCl al 25 % se desea preparar las siguientes soluciones: Concentracin final deseada 0,05 M 0,075 M 0,1 M 0,15 M 0,2 M 0,25 M 0,30 M 0,35 M Cantidad En ml 200 200 200 200 200 200 200 500 Volumen de NaCl necesario

a) Complete el cuadro indicando la cantidad en ml de NaCl al 25 % necesaria para preparar cada solucin. b) Calcule la osmolaridad de cada solucin. 6) Cuntos ml de una solucin madre necesito preparar para obtener 10 ml de cada una de las siguientes diluciones: 1:2, 1:5, 1:25, 1:50? 7) De una solucin madre (A) 1 M se realiz primero una dilucin 1:2 (B), luego se diluy 1:50 obtenindose de este modo la solucin C y por ltimo se diluy la solucin C 10 veces obtenindose D. a) Cules son las concentraciones finales de las soluciones A, B, C y D? b) Cuntas veces respecto de la solucin A se diluy B, C y D?
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c) 8)

Cuntas veces respecto de la solucin B se diluy C y D?

Se desea preparar 500 ml de una solucin de NaCl (PM: 58) 10-1 M: a) Cuanta droga slida debo pesar? b) Cuntas veces debo diluir la solucin madre para obtener una solucin 10-4 M?

9) Necesito para mi experimento 10 ml de una solucin de K (OH) 50 mM y poseo una solucin madre 2 M. Para realizar las diluciones dispongo de pipetas de 10, 5 y 1 ml. Cmo preparara esta solucin teniendo en cuenta que el volumen mnimo a pipetear es de 1 ml? Molaridad = Nmero de moles/litro de solucin Normalidad = Nmero de equivalentes/litro de solucin Osmolaridad = Nmero de osmoles/litro de solucin

Problema 1. a) Cuales son los dos procesos celulares esquematizados? b) Requieren de energa? c) Como se une las vesculas a la membrana plasmtica? Explique brevemente

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SEGUNDA PARTE Problema1- Laboratorio: Controles experimentales

Un experimento es llevado a cabo generalmente, para poner a prueba una hiptesis acerca del rol de una variable (variable independiente) sobre otra (variable dependiente). La experimentacin cientfica requiere, de un diseo experimental y de ciertas condiciones para que los ensayos tengan validez, como ser la realizacin de rplicas de las muestras, y la implementacin de controles positivos y negativos. Un control positivo es un procedimiento, que tiene condiciones similares al experimento principal, pero que se conoce por la experiencia previa, que el resultado del ensayo es positivo. Un control negativo, es el ensayo del que se espera el resultado negativo. El control positivo confirma que las condiciones del experimento son capaces de generar un resultado positivo. El control negativo muestra la lnea de base (background o ruido) que se obtiene cuando la prueba no produce un resultado positivo. Muchas veces este valor, se sustrae al resultado experimental de las muestras. Cualquier resultado distinto al esperado de los controles, invalida el experimento, cualquiera haya sido el resultado de este. Lea atentamente las siguientes situaciones experimentales e indique en cada caso cual es la variable estudiada y qu ensayos CONTROL necesita. 1) Anlisis de la presencia de bacterias en la orina de un paciente mediante la tcnica de Gram. 2) Evaluacin de la presencia de protenas en una muestra diluda en PBS, utilizando el mtodo de Bradford 3) Evaluacin del efecto de una mutacin en el crecimiento de una bacteria. 4) Anlisis de la capacidad de inhibir la fagocitosis de un compuesto aislado de un extracto vegetal 5) Se quiere demostrar que una dieta hipocalrica incrementa la supervivencia en ratones 6) Se quiere evaluar la hiptesis de que un incremento de T de 37 C a 39 C, trae aparejado Lactococcus lactis. 7) Evaluacin de la fagocitosis de una bacteria a pH 4. 8) Evaluacin de la induccin de la sntesis de una protena recombinante en un cultivo de E.coli cuando se utiliza 10 veces menos del inductor IPTG. 9) Evaluacin del efecto de una droga en pacientes un incremento en la produccin de cido lctico en

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Problema 2. Durante los aos 50 exista un gran debate con respecto a cul de las macromolculas era la encargada de portar la informacin gentica. Dos macromolculas se disputaban la funcin, las protenas y los cidos nucleicos. Con el objetivo de dilucidar ese debate, los investigadores Martha Chase y Alfred D. Hershey realizaron el siguiente experimento. Utilizaron unos virus capaces de infectar clulas baterianas, denominados bacterifagos, que consisten en una cpisde proteica que engloba a una nica molcula de ADN.

La cpside proteica de una poblacin viral fue marcada radiactivamente con S35. El ADN de otra poblacin viral fue marcado con P32. Luego cada preparacin de bacterifagos se utiliz para infectar bacterias. Una vez procedida la infeccin se lav para eliminar la marca que no fue incorporada al interior celular, y se cuantific la marca que qued retenida dentro de la clula, observndose los siguientes resultados:

Fraccin marcada Protena marcada con S35 ADN marcado con P32

Nivel de radiactividad Cultivo 1 Cultivo 2 Cultivo 3 Cultivo 4 5 2 10 4 87 89 95 90

1) Cules son las hiptesis del momento? 2) Qu resultados obtuvo el grupo de investigacin? 3) Cul es la conclusin ms importante? 4) Grafique los resultados si el paso de lavado se hubiese obviado.

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Problema 3.
El Vibrio cholerae es la bacteria responsable de la diarrea aguda caracterstica del clera. El proceso infeccioso implica supervivencia de V. cholerae al pH cido del estmago, su motilidad a travs del intestino y la secrecin por parte del vibrin de una toxina proteica (CT) de 87 kilodaltons (KDa) compuesta por los productos de 2 genes (cistrones) llamados ctxA (ro arriba) y ctxB (ro abajo), que forman parte de un mismo opern bicistrnico. El producto de ctxA es un polipptido de 27 KDa y el de ctxB, uno de los 12KDa. El polipptido A sufre una modificacin post-traduccional. Se realizaron los siguientes geles de poliacrilamida con la toxina purificada: Sin SDS Sin -Me Toxina pH 7 Polo 40KDa Con SDS MPM CT Con SDS y -Me MPM CT

40KDa

22KDa 10KDa 5KDa Polo +

22KDa 10KDa 5KDa

a. Dibuje la molcula de toxina que muestre el n de subunidades de cada clase, el tipo de unin entre las mismas y la caracterstica saliente del producto del gen ctxA. b. Cul es la carga elctrica neta de la protena a ph=7? c. Qu modificacin post-traduccional sufre in vivo el producto de ctxA para explicar el resultado del gel con SDS y mercaptoetanol? d. Se le ocurre alguna manera para identificar especficamente cada tipo de subunidad???

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Problema 4. La toxina colrica (CT) es el principal factor de virulencia producido por V. cholerae. Es una protena oligomrica constituda por una unica subunidad A y 5 subunidades B que forman un anillo pentamrico con la subunidad A unida al core pentamrico B. La accin biolgica de CT es iniciada por la unin de las subunidades B al receptor en la membrana de las clulas epiteliales intestinales. Esta unin induce un cambio conformacional en la molcula, que permite la internalizacin de la subunidad A (CTA) a la clula. Esta subunidad tiene actividad ADP-ribosil transferasa, adiciona un residuo de ADP-ribosa a la subunidad de la protena G (G) -ver material suplementario al final de la gua-. Esto provoca la activacin constitutiva de la adenilato ciclasa. Como consecuencia, se acumula excesiva sal y agua en el lumen intestinal que finaliza en las diarreas caractersticas de la enfermedad. Las formulaciones Kampo, son medicinas tradicionales utilizadas en Oriente hace ms de 2000 aos. Las formulaciones son de origen natural, incluyendo hojas de plantas, races y hongos. El tipo de prescripcin vara de acuerdo al diagnstico. Estas formulaciones han sido empleadas para el tratamiento de la diarrea de origen bacteriano, por ese motivo se examin su efecto en la actividad de CT estudiando loops ligados de leon de ratn o conejo y actividad ADP-ribosil-transferasa. A continuacin se muestran algunos de los resultados obtenidos, evaluando las distintas formulaciones y en sobre asas cultivos ligadas celulares de ratn (actividad (fludo ADP-ribosil acumulado): transferasa)

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1-Qu tipo de modificacin representa la ADP-ribosilacin?. Proponga un mecanismo que explique el efecto observado (activacin constitutiva de la adenilato ciclasa)Qu efecto espera en la clula?. 2-Cul de los preparados es el ms efectivo?

3- Cul es el objetivo del segundo experimento en asas ligadas, mostrado en la figura 2? Por qu se utiliza conejo en lugar de ratn? 4- La ADP-ribosilacin se realiza a partir del precursor NAD+ (ver material suplementario del problema). Para analizar la ADP-ribosilacin producida por la CTA y el posible efecto de los taninos de RG, se realiza un ensayo incubando las protenas totales (membrana) de clulas intestinales Caco-2 en presencia de NAD+ marcado radiactivamente y CTA. A partir de los resultados de la fig. 3. -Explique la tcnica de anlisis. -Podra decir sobre qu evento acta el compuesto estudiado (RG-tannin)?
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-Para este experimento podra haber utilizado otra lnea celular? Justifique.

En base a los resultados obtenidos, se pudo conocer el fundamento de la medicina tradicional china en la utilizacin de Kampo para el tratamiento del clera? Problema 5. Para que los espermatozoides sean funcionales (y ser capaces de fecundar los oocitos) luego de la liberacin del tracto reproductivo de los mamferos, se requieren desde unas pocas a varias horas, dependiendo de la especie. A travs del tiempo, el espermatozoide sufre una serie de eventos de maduracin post-liberacin colectivamente conocidos como capacitacin. El pptido promotor de la fertilizacin (FPF), la adenosina y calcitonina, presentes en el

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plasma seminal, son molculas que promueven y regulan la capacitacin. La evidencia actual seala a estas molculas como primeros mensajeros que regulan la produccin de un segundo mensajero, cAMP por la adenilato ciclasa (AC). Dnde se encuentran los Receptores para estas molculas y cul es su estructura?. Dibuje. Cul es la molcula que transduce la seal?

La Calcitonina es una hormona peptdica de 32 aa involucrada en la homeostasis sea. Sin embargo, se encuentra en cantidades muy superiores en el lquido seminal respecto del plasma sanguneo. El siguiente experimento muestra el efecto de la Calcitonina (Cal) y FPP sobre suspensiones de espermatozoides:

Qu puede decir del grfico?? Cmo explica la disminucin del cAMP en los espermatozoides capacitados?

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El calcio es un in que acta como segundo mensajero. Puede decr quin es el transductor de la seal en este tipo de mecanismo?. Sin embargo, este catin bivalente puede actuar tambin a partir de otros mecanismos. En el siguiente experimento se analiz la produccin de AMPc en espermatozoides no capacitados, as como tambin la capacidad de fecundar oocitos.

-Cul es el objetivo del experimento? - Qu estrategia experimental podra utilizar para verificar el resultado?? Dibuje el resultado esperado. -Qu se puede concluir a partir de la figura? Puede hipotetizar algn mecanismo con estos elementos?.

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Material suplementario Problema 4: 1) ADP-ribosilacin

2) Leyendas de figuras
Fig1. Efectos inhibitorios de R. rhizoma sobre la ADP-ribosilacin catalizada por CT. Se agreg 1 ug de CT con las cantidades indicadas de R. rhizoma (), Taninos de RG (), gallato epigallocatecin (), emodina () y seredina(). Los valores representan duplicados de un experimento representativo de tres. B) Efectos de R. rhizoma en la acumulacin de fluidos en loops del leon. Cada ratn fue inyectado con 0,1 ml de una solucin conteniendo 100 ng de CT y las cantidades indicadas de R. rhizoma (), Taninos de RG (), gallato epigallocatecin (), emodina ()y seredina(). El ratn fue sacrificado a las 6 horas y se determin la proporcin de la acumulacin de fludos (mg/cm). Fig 2. Efectos inhibitorios de los taninos de RG en la acumulacin de fluidos inducidos por CT en los loops de leon (ratn). Los loops contenan: 1) sin aditivos; del 2 al 7: 250 ng de CT; 3 y 8: 10 ug de taninos de RG; 4: 3 ug de taninos RG; 5: 1 ug de tanino RG; 6: 300 ng de tanino RG y 7: 100 ng de tanino RG. Los experimentos fueron repetidos por quintuplicado. Fig 3. Efecto de los taninos de RG sobre la ADP-ribosilacin catalizada por CTA en membranas de clulas Caco-2. Lnea 1: sin aditivos, lneas 2-5, 2,5 ug de CTA; lneas 3 y 6, 15 ug de taninos de RG, lneas 4 y 7, 10 ug de taninos RG, y lneas 5 y 8, 5ug de taninos RG. 3) La lnea celular Caco-2 es una lnea celular inmortalizada generada a partir de clulas epiteliales humanas de adenocarcinoma colorectal.

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