UNIVERSIDAD AUTNOMA DE BAJA CALIFORNIA UNIDAD DE CIENCIA Y TECNOLOGA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGA LABORATORIO DE MICROBIOLOGA Y BIOTECNOLOGA

PRCTICA No. 10 USO DE LOS MEDIOS DE CULTIVO (EFECTO DE LOS NUTRIENTES, AGENTES INHIBIDORES Y SUSTANCIAS QUE DETERMINAN LA SELECTIVIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.) Objetivo: al terminar la prctica el estudiante podr seleccionar el medio de cultivo que le permita al microrganismo exhibir las propiedades bioqumicas que sern base para su identificacin. Introduccin: se entiende por crecimiento microbiano el aumento del nmero de microrganismos a lo largo del tiempo, es decir, al crecimiento de bacterias, el estudio que se hace puede servir tambin para entender el crecimiento de levaduras y de otros hongos. Denominamos ciclo celular al proceso de desarrollo de una bacteria aislada. A lo largo del ciclo celular tiene lugar la replicacin del material gentico, la sntesis de componentes celulares, la elongacin de la bacteria para alcanzar un tamao doble del inicial y su divisin por biparticin para dar lugar a dos clulas hijas. La duracin del ciclo celular coincide con el tiempo de generacin y depende, en general, de los mismos factores de los que depende este. El crecimiento de una poblacin resulta de la suma de los ciclos celulares de todos los individuos de dicha poblacin. La mayora de los cultivos de microorganismos son del tipo denominados asincrnicos, puesto que en ellos cada microorganismo se encuentra en un punto diferente del ciclo celular. Por consiguiente, en un momento determinado en un cultivo se encuentran clulas que acaban de dividirse, otras que estn replicando su ADN, otras que estn creciendo, otras que estn iniciando la divisin celular, etc. Por el contrario, en un cultivo sincrnico todas las clulas se encuentran simultneamente en la misma fase del crecimiento celular. Los cultivos sincrnicos son muy difciles de mantener por lo que su importancia est principalmente ligada a los estudios bsicos de biologa microbiana. Sin embargo, en la naturaleza, las bacterias del suelo se encuentran en condiciones de crecimiento prximas a la fase estacionaria (en la que se produce una cierta sincronizacin del cultivo) y, por consiguiente, durante cierto tiempo las poblaciones naturales probablemente se comporten como relativamente sincrnicas. Las poblaciones de bacterias crecen de forma explosiva acumulando grandes nmeros en un periodo de tiempo muy reducido. Puesto que el efecto de los microrganismos en la mayora de los casos depende de su nmero, entender cmo se produce el crecimiento microbiano es importante para poder evitar o reducir sus efectos nocivos y potenciar los beneficiosos o aplicados.

Cultivo de microrganismos: el cultivo de microorganismos consiste en proporcionarles las condiciones fsicas, qumicas y nutritivas adecuadas para que puedan multiplicarse de forma controlada. Engeneral, podemos distinguir cultivos lquidos y slidos en funcin de las caractersticas del medio y cultivos discontinuos y continuos en funcin de la disponibilidad de nutrientes en el medio. Medios de cultivo: un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en auttrofos si es el CO2 atmosfrico (microorganismos que fotosintetizan) y hetertrofos si utilizan carbono orgnico. La frmula elemental de un microorganismo es, aproximadamente, C4H7O2N lo que supone que los componentes de las clulas son: carbono que representa alrededor del 50% del peso seco, oxgeno (32%), nitrgeno (14%), fsforo (3%), azufre (en torno al 1%) y otros elementos traza entre los que se encuentran Fe, K, Mg, Mn, Co, Mo, Cu y Zn. La elaboracin de medios de cultivo requiere proporcionar los elementos antes citados en una forma asimilable. As, por ejemplo, el C debe estar en forma de carbono orgnico para los hetertrofos y como CO2 para los auttrofos, el N en forma de NH4, de NO3 o de NO2 o en forma de aminocidos a los que se pueda tomar su grupo amino; el P debe estar en forma de PO4-3, el S procede de aminocidos sulfurados o de SO4-2, etc. Adems, en ciertos casos, es necesario aadir a los medios de cultivo algunos aminocidos o vitaminas que determinados tipos de microorganismos no pueden sintetizar. En el caso de la levadura del pan (Saccharomyces cerevisiae) la frmula elemental ms concreta es:C3.72H6.11O1.95N0.61S0.017P0.035K0.056, esta composicin puede variar ligeramente en funcin de las condiciones de cultivo o de fase de crecimiento. El conocimiento de la frmula elemental del microorganismo que se cultiva, facilita la formulacin del medio de cultivo ms adecuado para el mismo. Clasificacin: los medios de cultivo se pueden clasificar en definidos o simples, cuando su composicin qumica se conoce totalmente y complejos cuando no es el caso porque estn compuestos por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de levadura, extracto de carne, etc.). Por otra parte, los medios de cultivo pueden ser lquidos o slidos si se aade algn agente solidificante que no sea consumible por los microorganismos (normalmente agar). En funcin de los microorganismos que pueden crecer en ellos, los medios pueden ser, selectivos cuando favorecen el crecimiento de ciertos microrganismos mientras suprimen el de otros (por ejemplo, el medio SPS para clostridios). La eleccin de un medio selectivo debe ser apropiado para el aislamiento del organismo que interesa. Las sustancias inhibitorias pueden ser colorantes, antibiticos, sales biliares y sustancias que afecten el metabolismo enzimtico de algunas especies. Los medios selectivos para especies Gram- , pueden incluir cristal violeta el cual inhibe el crecimiento de muchas bacterias Gram+. La penicilina con una concentracin de 5.50 unidades/ml inhibe la mayora de las bacterias Gram+ y por lo tanto el medio se hace selectivo para bacterias Gram-. Los medios selectivos para bacterias Gram+, incluyen Telurito de Potasio, azida sdica, etc. Que inhiben el crecimiento de bacterias Gram-. Diferenciales cuando alguno de sus componentes permite identificar las colonias de un tipo de microorganismos (por ejemplo medios con hemates para identificar colonias de microorganismos hemolticos), selectivo-diferenciales cuando combinan las dos

caractersticas anteriores (por ejemplo, el agar de MacConkey para identificar Escherichia coli), y medios de enriquecimiento que permiten aislar un tipo determinado de microorganismo a partir de una mezcla de una poblacin mixta de gran tamao. Crecimiento microbiano en medio lquido: si la bacteria crece en un medio lquido, en la mayora de los casos las clulas que se producen en cada divisin continan su vida independientemente formndose una suspensin de clulas libres. En un cultivo discontinuo de bacterias en medio lquido, se pueden diferenciar, mnimamente, cuatro fases en la evolucin de los parmetros que miden el crecimiento microbiano: 1.- Fase lag o de adaptacin: durante la que los microorganismos adaptan su metabolismo a las nuevas condiciones ambientales (abundancia de nutrientes y condiciones de cultivo) para iniciar la fase de crecimiento exponencial. 2.- Fase exponencial o logartmica: en ella la velocidad de crecimiento es mxima y el tiempo de generacin es mnimo. Durante esta fase las bacterias consumen a velocidad mxima los nutrientes del medio. La evolucin del nmero de clulas durante esta fase se explica con modelos matemtico. 3.- Fase estacionaria: en ella no se incrementa el nmero de bacterias (ni la masa u otros parmetros del cultivo). Las clulas en fase estacionaria desarrollan un metabolismo diferente al de la fase exponencial y durante ella se produce una acumulacin y liberacin de metabolitos secundarios que pueden tener importancia industrial. Los microorganismos entran en fase estacionaria porque se agota algn nutriente esencial del medio o porque los productos de desecho que han liberado durante la fase exponencial hacen que el medio sea inhspito para el crecimiento microbiano. La fase estacionaria tiene gran importancia porque probablemente represente con mayor fidelidad el estado metablico real de los microorganismos en los ambientes naturales. 4.- Fase de muerte: se produce una reduccin del nmero de bacterias viables del cultivo.

Procedimiento de enriquecimiento Cuando se necesita obtener un cultivo de un organismo determinado es necesario una tcnica de enriquecimiento adecuada para esa especie. Los mtodos se basan en cualquier caracterstica fisiolgica del organismo deseado, por ejemplo, pH o temperatura ptima, requerimientos nutricionales o tolerancia a algunos inhibidores. En algunos casos se puede hacer un tratamiento trmico de suspensiones de suelo para el aislamiento de organismos esporulados y otros organismos termo-resistentes, seguido por un plaqueo en medio slido. Otras veces se puede usar diferentes temperaturas de incubacin, de manera que el organismo deseado aumente su nmero en relacin con el de los otros organismos presentes. El procedimiento de enriquecimiento en medio lquido es inadecuado para dar un cultivo puro, y el procedimiento final de aislamento, comprende la obtencin de colonias separadas en medio slido. La preparacin de medios terminados a partir de materiales deshidratados debe hacerse de acuerdo a las instrucciones. Slo debe usarse equipos y cristalera qumica lmpios. El agua debe ser siempre destilada o desmineralizada, salvo indicacin en contra. La pesada exacta de los materiales y la medida correcta de agua son esenciales. El calor debe ser directo o en bao de agua hirviendo o recipientes envueltos en vapor con agitacin. El calentamiento excesivo debe evitarse. La homogeneidad tambin es esencial, especialmente para medios que contienen agentes gelificantes. El mezclado debe ser suave para lograr homogeneidad sin espuma ni burbujas. La esterilidad se hace de varias formas, generalmente por autoclave o filtracin. Casi todos los medios se esterilizan a 121C durante 15 minutos para volmenes de hasta 500 ml. Para volmenes mayores el tiempo debe extenderse a 20, 30 ms minutos segn sea necesario. Para verificar la esterilizacin placas y tubos con el medio se deben incubar a 20-25C 30-35C durante uno o dos das. Los medios deben guardarse en un refrigerador. Material Muestras de microorganismos 1 caja con agar EMB 1 caja con MacConkey sorbitol 4 portaobjetos Colorantes para gram 1 piceta con alcohol 2 tubos con caldo nutritivo 1 caja con agar nutritivo 1 mechero Fisher 1 asa bacteriolgica Colorantes para esporas 1 puente de coloracin 1 piceta con agua destilada

Procedimiento: 1. Divide cada una de las cajas en dos partes. 2. Marca una mitad como A y la otra como B 3. Siembra por estria abierta un microrganismo en cada una de las mitades A y en la mitad B siembra el otro microrganismo. 4. Incuba las cajas a 37 0C por 24 a 48 horas. 5. Observa y reporta si hay diferencias entre las mitades de los diferentes medios.

6. Determina si son gram + o gram y verifica si son esporgenos por medio de la tinciones adecuadas. Cuestionario: 1. Cul es la composicin qumica de cada medio? 2. A que tipo corresponde cada medio? Clasifcalos. 3. Segn el crecimiento se puede saber de que microrganismos se trata? 4. A que tipo de gram pertenece cada uno? 5. Cul es la razn de los diversos componentes de los diferentes medios? Referencias:
NORMA Oficial Mexicana NOM-065-SSA1-1993, Que establece las especificaciones sanitarias de los medios de cultivo. Generalidades.