DEPARTAMENTO ACADEMICO DE ZOOTECNIA NOMBRE DEL CURSO: VIROLOGIA VETERINARIA NOMBRE DE LA PROFESORA: M.C.

MARA DEL ROSARIO SALAZAR LOMEL

TEMA X. EL DIAGNSTICO VIRAL POR EL LABORATORIO OBJETIVO: Que el alumno conozca los diferentes mtodos diagnostico para la identificacin viral. INTRODUCCION: El diagnstico de las entidades virales es uno de los mayores retos a los que se enfrenta la medicina actual, por lo cual se emplean mtodo serolgicos para el dx viral: Los mtodos serolgicos, se basan en la deteccin de la respuesta del hospedero a la infeccin. En muchos casos el diagnstico de infeccin viral se hace por el cuadro clnico del paciente y la presencia de anticuerpos contra el agente viral sospechoso; sin embargo, hay algunas tcnicas rpidas para demostrar los antgenos virales y tambin se sabe de tcnicas para amplificar su material gentico.

Mtodos serolgicos utilizados en el laboratorio para reconocer las infecciones por virus se clasifican: METODOS SEROLOGICOS DIRECTOS METODOS SEROLOGICOS INDIRECTOS

Ambos usados para demostrar la presencia del virus o de alguno de sus constituyentes (antgeno o genoma viral) o bien la respuesta de anticuerpos especficos por parte del husped en el curso de la infeccin. A continuacin se describen las principales tcnicas para diagnstico viral. METODOS DIRECTOS: Son los metodos de laboratorio utilizados para evidenciar al virus o algunos de los antgenos virales que se pueden encontrar presentes en los tejidos o fluidos, mediante las siguientes tcnicas de laboratorio 1. Por aislamiento viral y cultivos celulares (El virus como agente infeccioso) 2. Tcnicas inmunolgicas como: Inmunofluorescencia (IF),prueba de aglutinacion 3. PCR, electroforesis, hibridacin del acido nucleico (La presencia de cidos nucleicos virales) 4. Microscopa electrnica (El virus como partcula viral) A CONTINUAICON SE DESCRIBEN CADA UNO DE LOS METODOS ANTES MENCIONADOS 1. Por aislamiento viral y cultivos celulares (El virus como agente infeccioso). Procedimiento que permite mantener y reproducir clulas in vitro vivas en un medio nutritivo artificial (In Vitro) o en organismos vivos (In vivo) 2. Tcnicas inmunolgicas como: Inmunofluorescencia (IF), Test de Aglutinacin (La presencia de antgenos virales) Inmunofluorescencia directa (IF): tcnica cualitativa, puede ser utilizada para detectar antgenos virales presentes en clulas infectadas o para detectar anticuerpos generados contra antgenos virales. En el primer caso es necesario enfrentar clulas infectadas a anticuerpos especficos o antisueros generados contra un determinado virus. En el segundo caso, el suero problema se enfrenta a clulas infectadas con un virus conocido. El principio bsico de la inmunofluorescencia directa consiste en que las muestras clnicas son recolectadas y colocadas sobre portaobjetos donde se dejan secar y fijar. Luego se agregan anticuerpos especificos marcados con isotiocianato de fluorescena que difunden a travs de la membrana celular y se combinan con los antgenos vricos en el interior de las clulas. La reaccin antgeno anticuerpo se visualiza con el microscopio de fluorescencia, por la aparicin de fluorescencia de color verde manzana. Esta tcnica se sigue para el diagnstico del virus de influenza, coronavirus, ADV, y CMV Tambin es til para confirmar los hallazgos de cultivo viral

Este mtodo es fcilmente aplicable en tejidos que se pueden colocar sobre una placa a manera de huella y a partir de sta aplicar la tcnica; un ejemplo es el caso de biopsias de cerebro para el diagnstico de rabia en cerebros de animales Desventajas de la tecnica: La realizacin de la reaccin es laboriosa, depende mucho de la calidad de los reactivos, requiere un microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para llegar a un diagnstico certero, as como una recoleccin y preparacin de la muestra adecuada. Prueba de Aglutinacin.: Es un mtodo simple, de un solo paso. Los ensayos de aglutinacin, dependen de la fijacin inicial de anticuerpos antivirales especficos sobre eritrocitos.Luego se incuba con la muestra clnica en la cual se investiga el antgeno y las partculas se aglutinan si el antgeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado porcentaje de reacciones inespecficas.El test de aglutinacin ha sido usado para detectar antgeno de Rotavirus en heces. VENTAJAS: tcnica rpida y barata. 3. PCR, electroforesis, hibridacin del acido nucleico (La presencia de cidos nucleicos virales) 1.- LA PRESENCIA DE CIDOS NUCLEICOS VIRALES (PCR). Reaccin en cadena de la polimerasa (PCR). La PCR consiste en una reaccin enzimtica mediante la cual se amplifica selectivamente una secuencia especfica de ADN en relacin a la de otras secuencias presentes en la misma mezcla de reaccin. Mediante el empleo de sta tcnica es posible en pocas horas obtener millones de copias de la secuencia en estudio a partir de unas pocas de copias dicha secuencia contenidas en una muestra. Estas muestras pueden provenir de aislamientos en cultivos celulares infectados, as como tambin de muestras clnicas en donde no se conoce el titulo viral del cual se parte. Una vez realizada la amplificacin de la secuencia a estudiar, este producto es analizado por electroforesis en gel de agarosa o poliacrilamida y visualizadas las bandas (productos de amplificacin), por tincin con bromuro de etidio en un transiluminador UV, o por tincin con nitrato de plata y posterior revelado. VENTAJAS DE SU USO: La tcnica de PCR ha experimentado un desarrollo y aplicabilidad muy acelerados, gracias a su alta sensibilidad y a la condicin de no requerir agente vivo. DESVENTAJAS: Su implementacin requiere de infraestructura fsica y personal muy especializados. Diagnostica y caracteriza la mayor parte de los virus conocidos y se considera una gran herramienta para estudio molecular. 2. ELECTROFORESIS: es un mtodo de laboratorio en el que se utiliza una corriente elctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas segn su tamao y carga elctrica a travs de una matriz gelatinosa. La variante de uso ms comn para el anlisis de mezclas de protenas o de cidos nucleicos utiliza como soporte un gel, habitualmente de agarosa o de poliacrilamida. Se pueden detectar algunos virus con genoma segmentado por electroforesis del cido nucleico, observando su patrn de migracin en geles de agarosa o poliacrilamida. El diagnstico de rotavirus representa un buen ejemplo del empleo de esta tcnica, dado que su genoma es RNA segmentado, lo que ha permitido desarrollar un mtodo simple y rpido para su deteccin en deposiciones, que se usa rutinariamente en diversos laboratorios. En los virus que no tienen un genoma fragmentado (adenovirus, herpes simplex, citomegalovirus, etc.) pueden usarse enzimas de restriccin (endonucleasas) que cortan el genoma en secuencias especficas, originando varios segmentos que conforman un patrn de movilidad electrofortica caracterstico que permite identificar al virus y sus variantes genticas. Esta tcnica se usa extensamente en investigacin para estudiar variacin antignica.

3.- HIBRIDACIN DE CIDOS NUCLEICOS. Esta tcnica se basa en la capacidad de las molculas de cido nucleico de una hebra de reconocer, por apareamiento de bases, a hebras de cido nucleico que poseen secuencias nucleotdicas complementarias. La deteccin del hbrido puede realizarse usando sondas de cidos nucleicos marcadas. Hay sondas radioactivas en que se visualiza la formacin del hbrido mediante una autorradiografa; otras sondas son biotiniladas, detectndose la formacin del hbrido mediante una reaccin inmunoqumica. Otras veces se detectan los hbridos por la diferente velocidad de migracin en geles de electroforesis (heteroduplex). Algunos ensayos se pueden realizar por la tcnica de hibridacin en filtro, que emplea como soporte un filtro de nitrocelulosa sobre el cual se realiza la reaccin. La hibridacin in situ se realiza en un corte de tejido o sobre una monocapa de cultivo celular. Esta ltima tcnica constituye en la actualidad un buen mtodo de diagnstico para el virus papiloma.

4. Microscopa electrnica (El virus como partcula viral) Es un mtodo de recuento directo, es decir que los virus pueden medirse en trminos del nmero total de partculas virales, independientemente de su funcin como agentes infecciosos. DESVENTAJA DE SU USO: Esta tcnica no revela las estructuras internas del virus sino su forma y dimensiones, necesita de una alta concentracin de viriones (aproximadamente 109 partculas virales/ml, dependiendo del virus) presentes en la muestra, por ello es poco sensible. Tcnica poco utilizada El uso de equipo especializado y costoso, el elevado nivel tcnico que requiere, la baja sensibilidad cuando hay un bajo nmero de partculas virales y el hecho de que en algunos casos la morfologa no es suficiente para un diagnstico viral definitivo, hacen que este sistema sea poco usado y slo se emplee a nivel investigativo o acadmico. METODOS INDIRECTOS Son las que se utilizan con ms frecuencia porque detectan el agente viral mediante anticuerpos especficos contra el virus Reconocen la respuesta inmune (humoral o celular) por parte del husped

Deteccin de anticuerpos especficos antivirales por tcnicas inmunolgicas como 1. 2. 3. Inhibicin de la hemaglutinacin (IHA) Fijacion del complemento ELISA

1.-Inhibicin de la hemoaglutinacin (IHA) es una de los mtodos indirectos ms comunes para cuantificar antgeno virales hemoaglutinantes en suspensin. Algunos virus poseen protenas en sus superficies capaces de aglutinar a eritrocitos de ciertas especies, lo cual al unirse a los receptores en la superficie de los glbulos rojos de algunas especies, y al unirse a ms de un glbulo rojo producen la aglutinacin fenmeno que se usa en el laboratorio para diagnstico. En los cultivos infectados con este virus se encuentran hemaglutininas en el medio de cultivo, o en el caso de los huevos embrionados en el lquido amnitico o alantoideo. Al colocar esos lquidos en presencia de glbulos rojos se produce la hemoaglutinacin. Esta tcnica se hace en microplacas de plstico en forma manual y demora 3 a 5 horas en dar resultados. VENTAJAS DE SU USO: Actualmente se usa principalmente en diagnstico y caracterizacin de virus influenza. Los anticuerpos inhibidores de la hemaglutinacin tienen buena correlacin con los neutralizantes en reflejar nivel de inmunidad, y su medicin es ms sencilla.

2. FIJACIN DEL COMPLEMENTO. La fijacin del complemento por el anticuerpo unido al antigeno hace que se genere un complejo de ataque de membrana. Si el anticuerpo se une al eritro cito este se destruye y sobreviene la hemolisis. Se realiza cuando un antgeno se pone en contacto con un anticuerpo especfico en presencia de complemento. En esta tcnica el complejo virus-anticuerpo especfico utiliza glbulos rojos de cordero sensibilizados con hemolisina (anticuerpo anti-glbulos rojos de cordero). Si en la reaccin se forma el complejo antgeno-anticuerpo, se fija el complemento que hay en el medio y al agregar los glbulos rojos sensibilizados no se produce la hemlisis porque no hay complemento libre y los eritrocitos sedimentan al fondo del tubo o pocillo formando un botn. En cambio, si no se forma el primer complejo, el complemento queda libre, se une a los glbulos rojos sensibilizados y los lisa. DESVENTAJAS: Esta tcnica es relativamente compleja, pues usa muchos reactivos, los que deben estar debidamente estandarizados. Su sensibilidad y especificidad no son muy altas y han sido superadas por otras tcnicas. Los anticuerpos fijadores del complemento duran slo algunos aos despus de la infeccin, de modo que son indicadores de un proceso reciente.

3.- VALORACION INMUNOABSORBENTE LIGADA A ENZIMA (ELISA) es una tcnica inmunoenzimtica, cuantitativa, se basan habitualmente en la captura del antgeno viral presente en la muestra clnica (suero problema), al combinarse con el anticuerpo fijado a una fase slida conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o fosfatasa alcalina. La reaccin se revela a travs de la accin enzimtica de dicha enzima sobre un sustrato, que al combinarse desarrolla una coloracin de intensidad proporcional a la cantidad de antgeno o anticuerpo presente, cuantificable mediante un espectrofotmetro.

VENTAJAS DE SU USO: Por esta tcnica se puede procesar gran nmero de muestras en forma rpida y automatizada, no requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados, ya que estos se leen por medio de espectrofotmetros especialmente diseados, siendo entonces una tcnica ms objetiva. CONCLUSION El diagnstico de las entidades virales es uno de los mayores retos a los que se enfrenta la medicina actual, por lo tanto, la tendencia en el diagnstico virolgico consiste en emplear nuevas y ms sensibles tecnologas de deteccin de antgenos y de investigacin de cidos nucleicos con el propsito de lograr un diagnstico viral ms rpido.

En muchos casos el diagnstico de infeccin viral se hace por el cuadro clnico del paciente y la presencia de anticuerpos contra el agente viral sospechoso; sin embargo, hay mtodos serolgicos, para demostrar los antgenos virales y tambin se sabe de tcnicas para amplificar su material gentico, que se basan en la deteccin de la respuesta del hospedero a la infeccin, para demostrar los antgenos virales. LITERATURA CITADA

Brock, D. 1990. Clnica y Diagnstico Microbiolgico. Biologa de Microorganismos. Prentice Hall. New Jersey. 13: 488-489. Fettner, A.G., 2004. Disease Causes and Theories of Causation, Virus: Agent of Change McGraw-Hill, New York,USA. Goldstein, B.G. 2002. Introductory Experiments in Virology William C. Publishers, Dubuque. Mohanty, S.B. 1991: Virologa Veterinaria. Interamericana, Mexico. Pp.89-99 Zinsser E. 1994. Diagnstico Viral Rpido. Microbiologa. 20ed. Editorial Mdica Panamericana. 62: 1249-1260.