TEMA

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MICOBACTERIAS. MEDIOS DE CULTIVO E IDENTIFICACIN. PATOLOGA Y TIPOS DE TUBERCULOSIS: PRUEBAS DE LABORATORIO

BIBLIOGRAFA
Mercedes Rodrguez Buenavida. Tcnicos Especialistas de Laboratorio en anlisis clnico. Editorial Kronos S.A. 1998 Martin Frobisher, Ronald D.Hinsdill, Koby T. Crabtree y Clyde R. Goodheart. Microbiologa. Editorial Salvat. 1978 Ismael Caballero. Revista EcoHabitar.2004

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1.

MICOBACTERIAS: MEDIOS DE CULTIVO E IDENTIFICACIN

Las Micobacterias pertenecen a la familia de las Mycobacteriaceae y el gnero Mycobacterium, que comprende multitud de especies que podemos encuadrar en tres grupos: Complejo tuberculosis: M. tuberculosis, M. africanum y M. bovis. Complejo Lepra: M.leprae Micobacterias atpicas.

Todas las bacterias del gnero Mycobacterium, presentan una serie de caractersticas generales: Acido alcohol resistencia: capacidad que tienen las micobacterias, una vez teidas por determinados colorantes como la fucsina, para resistir la decoloracin con una solucin de cido y alcohol. Esta caracterstica parece deberse a la riqueza en lpidos de la pared de estas bacterias. La tcnica de tincin ms clsica para demostrar la cido alcohol resistencia es la de "Ziehl Neelsen" aunque tambin se utiliza mucho la "tincin fluorescente con auramina" por ello se las suele llamar bacilos cido alcohol resistentes (BAAR). Se dividen por fisin binaria y tienen una gruesa pared celular de estructura compleja. El metabolismo vara mucho entre las distintas especies, desde las de crecimiento rpido, que se desarrollan en medios simples, hasta Mycobacterium leprae que no es cultivable en medios sin clulas pasando por Mycobacterium tuberculosis que requiere para cultivarse en el laboratorio ms de 15 das en medios slidos, complejos y muy ricos. De crecimiento rpido, crecen en menos de 7 das. De crecimiento lento, tardan ms de una semana en crecer. Escotocromgenas, pigmentan en oscuridad Fotocromgenas, pigmentan slo tras exposicin a la luz

Las micobacterias se clasifican segn velocidad de crecimiento en: -

Segn la produccin de un pigmento, se clasifican en:

1.1

Mycobacterium tuberculosis

Es el agente productor de la tuberculosis, que es una enfermedad transmisible de declaracin obligatoria. M. tuberculosis fue descubierto por Koch en 1882 (bacilo de koch). Aunque menos frecuente, M bovis, micobacteria responsable de la tuberculosis bovina, puede tambin producir tuberculosis en el husped humano. M. tuberculosis es un bacilo delgado y de aspecto filamentos o, que en ocasiones puede presenta formas cocoides. Es comn la tendencia a crecer como largos agregados trenzados que han sido llamados "cuerdas de serpentina".

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Micobacterias: medios de cultivo e identificacin

En cuanto a su estructura, la caracterstica ms llamativa es la abundancia de lpidos en la pared celular a los que debe su acido alcohol resistencia; entre ellos destaca el "cido miclico" y el denominado "factor Cord" que le confiere la propiedad de crecer encadenados formando cordones. M. tuberculosis es un aerobio estricto; su ritmo de crecimiento es particularmente lento (23 semanas), se cultiva en medio de Lowenstein-Jensen.

1.2

Mycobacterium leprae
Es el agente causal de la lepra.

M. leprae fue descrito por Hansen en 1837 como agente productor de lepra (bacilo de Hansen). Este microorganismo no es cultivable en medios sin clulas, lo cual ha limitado su conocimiento. El reservorio de la enfermedad es exclusivamente humano. La va de transmisin es por medio de aerosoles. El periodo de incubacin es largo, puede variar de 2 a 12 aos. La lepra puede presentar gran variedad de manifestaciones clnicas, en relacin al grado de respuesta inmunolgica: Cuando un individuo es incapaz de desarrollar respuesta inmune, se produce una gran multiplicacin de los bacilos: lepra lepromatosa. Cuando el individuo es capaz de desarrollar respuesta inmune: lepra tuberculoide.

Entre estos dos cuadros existe una amplia gama de presentaciones. El diagnstico bacteriolgico de M. leprae se basa en la demostracin directa de los bacilos en muestras de lesiones cutneas, raspado de moco nasal, linfa del lbulo (en casos de enfermedad activa se agrupa en masas denominadas globis), linfa del glbulo de la oreja. Para ello se utilizan las tinciones cido alcohol resistentes de Ziehl-Neelsen y auramina. La lepromina es una suspensin de bacilos de lepra inactivados que se inyectan va intradrmica; la lectura de la prueba se hace a los 21 das. Los pacientes con lepra lepromatosa dan resultado negativo y los pacientes con lepra tuberculoide dan resultado positivo.

1.3

Micobacterias atpicas

No todas las micobacterias atpicas son capaces de producir enfermedad ni todas las que la producen lo hacen con igual virulencia. Se define micobacteriosis aquellas enfermedades producidas por micobacterias distintas de M. leprae y M. tuberculosis. Actualmente la infeccin por micobacterias atpicas ms frecuente es la producida pro micobacterias del complejo avium-intracellulare.

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La patologa que producen podra clasificarse en: Pulmonar (suele parecerse a la tuberculosis). Extrapulmonar (adenitis cervical es la forma mas frecuente). Diseminada (se produce en pacientes con inmunodeficiencias).

1.4

Medios de cultivo

A la hora de realizar el cultivo lo primero que debemos hacer es eliminar la mxima cantidad de microorganismos, que no sean Micobacterias, de la muestra. Esto facilitar el cultivo de las mismas. Debemos tener en cuenta que el crecimiento de las Micobacterias es muy lento (20-22 h), mientras que el resto de las bacterias presentes pueden duplicarse en 40-60 minutos; si esta duplicacin se hiciese efectiva los desperdicios de estas bacterias haran imposible o muy difcil el crecimiento de las Micobacterias inoculadas. Para esto utilizaremos la tcnica de Tacquet y Tison. Si la descontaminacin de la muestra no ha sido efectiva o la muestra estaba muy contaminada utilizaremos tcnicas ms agresivas como la de Kubica y Krasnow o la de Petroff y Lwenstein. Las muestras que son estriles, no necesitan descontaminacin. Una vez descontaminada la muestra, concentraremos y homogenizaremos, y despus procederemos a su cultivo, utilizando la mnima cantidad posible y evitando los trozos o el lquido excesivo. El cultivo se puede realizar en medios lquidos o slidos. Una vez inoculados se incubarn a 37 C en la oscuridad (los medios de cultivo no deben estar expuestos a la luz) y se observar su crecimiento cada pocos das, tiendo la muestra con la tincin de Ziehl-Neelsen. Los medios de cultivo lquidos, se componen de glicerina, solucin de oligoelementos y suero de buey. El desarrollo se inicia en el fondo del tubo, siendo visible a los seis das, y presentar un velo en su superficie a las tres semanas de la inoculacin. Para demostrar su virulencia el bacilo adoptar formas serpenteantes similares a cuerdas. Los medios lquidos ms empleados son los de Dubos, Youmans y Migit. Los medios de cultivo slidos se componen de huevo, soluciones de aminocidos y minerales y verde malaquita. Los principales medios de cultivo slidos son: Lowenstein-Jensen: podemos observar el crecimiento a las 2-4 semanas, apareciendo colonias rugosas, secas e irregulares. Este medio posee como colorante el verde malaquita. Agar Middlebrook: en este medio las colonias son lisas, siendo su desarrollo ms abundante y rpido. Lowenstein con piruvato. Coletsos: contiene huevo.

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Micobacterias: medios de cultivo e identificacin

Cuando se observa que en el medio de cultivo han crecido bacterias susceptibles de ser micobacterias, se hace una tincin de Ziehl-Neelsen, antes de la identificacin de la colonia.

1.5

Identificacin de las Micobacterias

Como en la identificacin de cualquier bacteria, sta se realizar teniendo en cuenta los resultados hallados en las pruebas realizadas. No todos los laboratorios presentan el material y el personal necesarios para llevar a cabo todo el proceso, en caso de tener que enviar las muestras a otro laboratorio deberemos aseguramos que la identificacin y la conservacin de la muestra en cuestin son correctas. Existen tablas y procesamiento de pruebas en cualquier manual de laboratorio, por esta razn y como resumen a continuacin insertamos una tabla con las principales pruebas y los resultados de las diferentes Micobacterias:

2.
2.1

PATOLOGA Y TIPOS DE TUBERCULOSIS: PRUEBAS DE LABORATORIO

Clasificacin de la tuberculosis

La enfermedad tuberculosa tiene mltiples formas de presentacin; segn sus localizaciones puede clasificarse en: Tuberculosis pulmonar Tuberculosis extrapulmonar Tuberculosis diseminada

Una de las formas ms importante de tuberculosis es la meningitis tuberculosa que se produce por la rotura de una granuloma tuberculoso en el espacio subaracnoideo. M. tuberculosis es parsito intracelular obligado y el hombre es su nico reservorio; el mecanismo de transmisin mas importante es por medio de aerosoles, aunque tambin puede ser digestivo (leche contaminada) y excepcionalmente cutneo. Generalmente la infeccin tuberculosa se inicia con un inculo bacteriano muy bajo, son suficientes unos pocos bacilos inhalados de los aerosoles producidos por las secreciones respiratorias de un enfermo. Cuando el bacilo tuberculoso es inhalado, llega hasta el alveolo del husped donde es fagocitado por los macrfagos alveolares y comienza a multiplicarse. Los macrfagos infectados son transportados por los vasos linfticos a los ganglios linfticos regionales desde donde pueden diseminarse hasta el resto del organismo. Durante esta primera fase de la infeccin, la multiplicacin intracelular del bacilo se produce sin problemas; comienzan a ponerse en marcha

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mecanismos de inmunidad celular con desarrollo de clulas especializadas, que se organizan en granulomas rodeando a las clulas infectadas. Al desarrollarse la respuesta inmunitaria (el test de la tuberculina se hace positivo) de 3 a 8 semanas despus de la infeccin, se limita la multiplicacin de los bacilos, se destruye la mayora de ellos y se impide su diseminacin, aunque algunos bacilos permanecen viables durante aos despus de la infeccin inicial. Habitualmente la infeccin se detiene en este estadio (primoinfeccin) y no progresa a enfermedad clnica. Los pacientes con infeccin latente presentan habitualmente un test de tuberculina positivo, pero son asintomticos y no infecciosos. El bacilo tuberculoso se duplica cada 20 horas aproximadamente, si no es controlado por las defensas del husped, puede llegar a provocar necrosis de los tejidos circundantes y formacin del llamado caseum; estas zonas necrticas se lican y se producen las cavernas, con comunicacin a vas areas y siembras mltiples en ambos pulmones.

2.2

Pruebas de laboratorio

Para el diagnstico, la muestra puede ser de casi cualquier lado, siempre que se encuentre alterado por la presencia del M. tuberculosis: sangre, orina, secreciones gstricas, punciones, LCR... Debemos aseguramos que el paciente no est tomando ninguna medicacin antimicrobiana que pudiera alterar los resultados de las pruebas; si fuera as se suspender el tratamiento durante los 5 das previos a la toma de la muestra. La muestra deber ser recogida en el recipiente adecuado a su naturaleza y en cantidad suficiente para poder realizar las pruebas pertinentes. Debido a la eliminacin aleatoria de los microorganismos, las muestras deben ser recogidas de forma secuencial durante varios das y han de ser llevadas en el menor tiempo posible al laboratorio para su anlisis. Esputo: recoger a primera hora de la maana, es preferible tres muestras (una cada da). La presencia de 3-5 Micobacterias, confirmar una tuberculosis activa. Nos podemos encontrar, M .tuberculosis, M. bovis y M. Kansaii. Orina: recoger la primera orina de la maana, se toma del tramo medio de la miccin. La orina de 24 h no es recomendable por poder daar al M. tuberculosis. LCR: la positividad indicara meningitis tuberculosa. Biopsia: machacar en el mortero junto a polvo de alumdum u homogeneizador de tefln e inocular en el medio de cultivo. Exudados: inocular directamente.

Cuando nos llegue la muestra al laboratorio realizaremos las pruebas en cabinas de seguridad y con personal cualificado. La luz natural afecta negativamente al procesamiento de la muestra. Para observar la muestra de forma microscpica realizaremos una tincin de Ziehl-Neelsen o de Kinyoun, dado el carcter cido-alcohol resistente de estas bacterias la fucsina penetrar en ellas y podremos observar los bacilos de color rojo sobre fondo azul.

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Micobacterias: medios de cultivo e identificacin

Tambin podemos realizar una observacin por tcnicas de fluorescencia con auramina,' rojo de tiazina o naranja de acridina, observando la muestra bajo luz ultravioleta para poder distinguir la presencia del M. tuberculosis. Las visualizaciones debern ser informadas de forma cuantitativa segn la siguiente tabla:

Ausencia de bacilos por 100 campos 1-9 bacilos por 100 campos 10-99 bacilos por 100 campos 1-10 bacilos por 1 campo > 10 bacilos por 1 campo

0 Cifra + ++ +++

Si hay ms de 50 micobacterias en una lnea, no es necesario seguir con la observacin. La tincin de Ziehl-Neelsen es muy fcil de realizar y nos ayuda a distinguir de forma clara la presencia de bacterias cido-alcohol resistentes. Los pasos a seguir son: Preparar la muestra sobre un portaobjetos. Verter el colorante (fucsina bsica) con fenol al 5% sobre el portaobjetos preparado. Calentar el portaobjetos suavemente durante 3-5 minutos. ( Si la tincin se hiciera en fro, la muestra debe de estar como mnimo una hora sumergida en la fucsina. Decolorar con HCl al 3% en etanol. Lavar la muestra. Aadir azul de metileno como contraste de fondo.

Las muestras as preparadas, nos ofrece los bacilos teidos de rojo sobre un fondo azulado. Si observamos al microscopio los bacilos tuberculosos, siempre se realizar el cultivo de estos. Para determinar la presencia del M. tuberculosis podemos utilizar tambin otro tipo de pruebas, el denominado diagnstico indirecto. La principal prueba para determinar este diagnstico es la de la tuberculina, consistente en inocular al paciente una muestra de tuberculina y esperar los resultados. La inoculacin se realiza por la tcnica de Mantoux. Antes se usaba tuberculina normal, actualmente se usan tuberculinas ms purificadas. Para realizar la tcnica de Mantoux elegiremos una zona del brazo libre de lesiones anteriores o eritemas que puedan dar lugar a equivocaciones en la lectura. La zona elegida normalmente es la cara anterior del antebrazo. Una vez elegido el sitio inocularemos de forma intradrmica 0,1 ml de tuberculina de 2 unidades y rodearemos el pinchazo con un crculo para determinar de forma exacta el lugar de la inoculacin.

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Al paciente se le dir que no se puede mojar la zona, ni frotar ni rascar, aunque aparezcan picores, ni borrar el crculo pintado. La lectura se realiza a las 24, 48 Y 72 horas, midiendo el dimetro transverso de la induracin, si la hubiera, y se interpreta segn la siguiente tabla:

En personas no vacunadas una induracin de 6 mm o superior ser considerada como positiva.

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Microbacterias: medios de cultivo e identificacin

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MICROBACTERIAS: MEDIOS DE CULTIVO E IDENTIFICACIN

Las Micobacterias pertenecen a la familia de las Mycobacteriaceae y el gnero Mycobacterium, que comprende multitud de especies que podemos encuadrar en tres grupos: - Complejo tuberculosis: M. tuberculosis, M. africanum y M. bovis. - Complejo Lepra: M.leprae - Micobacterias atpicas.

Mycobacterium tuberculosis
Es el agente productor de la tuberculosis, que es una enfermedad transmisible de declaracin obligatoria. M. tuberculosis fue descubierto por Koch en 1882 (bacilo de koch).

Mycobacterium leprae
Es el agente causal de la lepra. M. leprae fue descrito por Hansen en 1837 como agente productor de lepra (bacilo de Hansen). Este microorganismo no es cultivable en medios sin clulas, lo cual ha limitado su conocimiento. El reservorio de la enfermedad es exclusivamente humano. La va de transmisin es por medio de aerosoles. El periodo de incubacin es largo, puede variar de 2 a 12 aos.

Micobacterias atpicas
No todas las micobacterias atpicas son capaces de producir enfermedad ni todas las que la producen lo hacen con igual virulencia. Se define micobacteriosis aquellas enfermedades producidas por micobacterias distintas de M. leprae y M. tuberculosis. Actualmente la infeccin por micobacterias atpicas ms frecuente es la producida pro micobacterias del complejo avium-intracellulare.

Medios de cultivo
A la hora de realizar el cultivo lo primero que debemos hacer es eliminar la mxima cantidad de microorganismos, que no sean Micobacterias, de la muestra. Esto facilitar el cultivo de las mismas. Debemos tener en cuenta que el crecimiento de las Micobacterias es muy lento (20-22 h), mientras que el resto de las bacterias presentes pueden duplicarse en 40-60 minutos; si esta duplicacin se hiciese efectiva los desperdicios de estas bacterias haran imposible o muy difcil el crecimiento de las Micobacterias inoculadas.

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Los medios de cultivo lquidos, se componen de glicerina, solucin de oligoelementos y suero de buey. El desarrollo se inicia en el fondo del tubo, siendo visible a los seis das, y presentar un velo en su superficie a las tres semanas de la inoculacin.

Identificacin de las Micobacterias

Como en la identificacin de cualquier bacteria, sta se realizar teniendo en cuenta los resultados hallados en las pruebas realizadas. No todos los laboratorios presentan el material y el personal necesarios para llevar a cabo todo el proceso, en caso de tener que enviar las muestras a otro laboratorio deberemos aseguramos que la identificacin y la conservacin de la muestra en cuestin son correctas. Existen tablas y procesamiento de pruebas en cualquier manual de laboratorio, por esta razn y como resumen a continuacin insertamos una tabla con las principales pruebas y los resultados de las diferentes Micobacterias:

PATOLOGA Y TIPOS DE TUBERCULOSIS: PRUEBAS DE LABORATORIO Clasificacin de la tuberculosis

La enfermedad tuberculosa tiene mltiples formas de presentacin; segn sus localizaciones puede clasificarse en: - Tuberculosis pulmonar - Tuberculosis extrapulmonar - Tuberculosis diseminada

Pruebas de laboratorio
Para el diagnstico, la muestra puede ser de casi cualquier lado, siempre que se encuentre alterado por la presencia del M. tuberculosis: sangre, orina, secreciones gstricas, punciones, LCR... Debemos aseguramos que el paciente no est tomando ninguna medicacin antimicrobiana que pudiera alterar los resultados de las pruebas; si fuera as se suspender el tratamiento durante los 5 das previos a la toma de la muestra. La muestra deber ser recogida en el recipiente adecuado a su naturaleza y en cantidad suficiente para poder realizar las pruebas pertinentes. Debido a la eliminacin aleatoria de los microorganismos, las muestras deben ser recogidas de forma secuencial durante varios das y han de ser llevadas en el menor tiempo posible al laboratorio para su anlisis. Cuando nos llegue la muestra al laboratorio realizaremos las pruebas en cabinas de seguridad y con personal cualificado.La luz natural afecta negativamente al procesamiento de la muestra. Si observamos al microscopio los bacilos tuberculosos, siempre se realizar el cultivo de estos. La principal prueba para determinar este diagnstico es la de la tuberculina, consistente en inocular al paciente una muestra de tuberculina y esperar los resultados.

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