Seminario 12 GENERALIDADES DE VIROLOGÍA
VIRUS
Son agentes infecciosos responsables de numerosas enfermedades del hombre, de los animales y plantas.
Pueden afectar también a las bacterias→ Bacteriofogos/Fagos
Son parásitos intracelulares obligados de pequeño tamaño, entre 20-250nM. No es un ser vivo porque no
posee metabolismo propio. Se pueden cristalizar. Poseen una estructura elemental y mecanismo de replicación
(No se reproducen, se replican). Carecen de los constituyentes fundamentales para el crecimiento y multiplicación,
por lo que deben necesariamente utilizar los sistemas de la célula que parasitan. Por eso se denominan parásitos
intracelulares obligados. La mayoría de los virus poseen enzimas especiales necesarias para iniciar su replicación.
Son importantes herramientas de investigación. Utilizando virus se ha avanzado en la biología molecular, en el
conocimiento de genes, en los mecanismos de replicación, etc., ya que no se reproducen.
No son seres vivos porque:
- No tienen metabolismo propio.
- No se reproducen, sino que se replican
- Pueden ser cristalizados
METODOLOGÍA DEL ESTUDIO DE LOS VIRUS
Los virus pueden estudiarse por métodos físico-químicos o bien por medio de procedimientos que demuestren su
capacidad infecciosa.
Métodos físicos- químicos podemos detectar: Los métodos para detección de infectividad
-Partículas virales. Ej. Por microscopía electrónica. puede ser a través de:
-Actividad enzimática. -Huevos embrionados
-Antígenos. -Cultivos celulares
-Ácidos nucleicos. Ej. Por PCR. -Animales de experimentación
Estructura viral: Los virus se observan por microscopía electrónica
El microscopio electrónico brinda dos tipos de información, el recuento total del
número de partículas virales en un preparado, y la apariencia o estructura de
las partículas.
Hay dos tipos básicos de microscopía electrónica:
- De transmisión: permite la observación de la muestra en cortes ultrafinos.
Corte ultrafino: se cortan con un ultramicrotomo cortes muy delgados de
tejido embebidos previamente en resinas epoxi. Se tienen con sales
pesadas. Se observa en blanco y negro. El ME no permite ver en color
Tinción negativa: la suspensión de virus se coloca sobre grillas
(portaobjetos de) y se contrastan con sales de metales pesados. No se los
corta, sino que se ve por contraste.
- De barrido: permite ver superficies. No se utiliza en virología porque no tiene tanta resolución.
Las muestras se observan en blanco y negro al microscopio electrónico.
Lo que vemos negro: Electrón denso
Lo que vemos blanco: Electrón lúcido
ESTRUCTURA VIRAL
Están constituidos por ácidos nucleicos y proteínas. Los
virus poseen un solo tipo de ácido nucleico, ADN o ARN.
Una partícula viral está constituida por el ácido nucleico
protegido por una cubierta proteica denominada cápside,
y a veces por una envoltura lipoproteica.
La cápside está constituida por unidades estructurales
que son los capsómeros: Son las unidades
morfológicas que representan a las unidades estructurales.
El conjunto de cápside y ácido nucleico recibe el nombre de nucleocápside.
Las proteínas estructurales son aquellas que codificadas por el virus se encuentran formando parte del virión, y
las no estructurales son requeridas para la replicación, pero no están en el virión, si no que se sintetizan en la
célula tras ser infectada.
Tamaño: Desde 20 a 250 um (parvovirus; poxvirus). Media: 100un (Retrovirus). 1un= milesima parte de un
micrómetro.
Algunas definiciones:
● Tienen un solo ácido nucleico → ADN o ARN
● Pueden parasitar animales, vegetales o bacterias
● Los mínimos componentes que deben tener para ser viables: Ácido nucleico + cápside
● Cuando un virus es completo e infectivo se le denomina virión
● El proceso de replicación es muy ineficiente, pudiendo generar partículas vacías o que contienen ADN celular
y no viral. Son las “Partículas defectivas”
La mera observación por microscopía electrónica de transmisión no nos permite aseverar que son infectivos, por
eso es que cuando hablamos de lo que observamos en microscopía electrónica hablamos de partículas virales.
Virus envueltos y virus desnudos
Funciones de la cápside:
- Protección del ácido nucléico de la desecación y
enzimas tisulares
- Presentar estructuras→ permite la unión del virus a los R de
membrana de las células que infectan→ En virus
desnudos - carentes de envoltura
- Actúa como complejo antigénico, estimulando la
respuesta inmune del huésped.
La mayoría de los virus desnudos son resistentes al
medio externo, a la desecación y a los solventes
de lípidos.
Algunas familias de virus poseen fuera de la cápside, una
envoltura lipoproteica→ virus envueltos. Todos los virus
con envolturas son muy sensibles a los solventes de
lípidos, tales como el éter y las sales biliares. En la
envoltura se encuentran glicoproteínas que constituyen
importantes antígenos del virus. Las funciones de la
envoltura son similares a las funciones de la cápside. En
los virus envueltos, es la envoltura la que presenta estructuras que permitirán la unión a receptores de la célula
huésped. Se trata de lipoproteínas ancladas en la membrana.
SIMETRÍA
Es la forma que adopta un virus en el espacio y está dada por la estructura de
su nucleocápside. Puede ser helicoidal, icosaédrica, binaria o compleja.
Los virus con simetría helicoidal son aquellos que presentan una
nucleocápside cilíndrica que puede estar extendida, como el virus del
mosaico del tabaco, que infecta a las plantas de tabaco; o en el bacteriófago
M13. Ambos son virus desnudos. O bien la nucleocápside puede estar
enrollada sobre sí misma y recubierta por una envoltura, como por ejemplo
el virus Influenza.
Los virus con simetría icosaédrica son poliedros regulares con caras
triangulares, aristas y vértices. Pueden ser desnudos, por ejemplo el virus de
la polio, o el adenovirus; o estar recubiertos de envolturas como los herpes
virus o los todavirus.
Los virus con simetría binaria poseen una cabeza con simetría icosaédrica
y una cola con simetría helicoidal, por ejemplo algunos bacteriófagos.
Se denominan virus con simetría compleja a aquéllos que presentan una nucleocápside helicoidal o icosaédrica,
recubierta por una envoltura laxa. Pueden ser ovoides, esféricos o pleomórficos, dado que la envoltura no es
rígida, tal como es el caso de los poxvirus que presentan forma de ladrillo.
SISTEMAS DE CULTIVO
Estudio de los virus con su capacidad de infectividad intacta.
Sistemas donde los virus pueden replicar:
● Huevos embrionados
● Animales de laboratorio
● Cultivos celulares (Actualmente es el único sistema para el cultivo
de virus con fines diagnósticos)
Para el empleo de huevos embrionados se inocula el agente en
cuestión en la membrana corioalantoidea en el saco vitelino o en el
embrión, y tras un tiempo de incubación se observa
macroscópicamente las lesiones que pueden producir en dichas
zonas. No se utiliza más en virología.
Con respecto a los animales de experimentación, entre ellos roedores, se
utilizan para el estudio de la patogénesis viral. Se pueden inocular por
diferentes vías, y tras un tiempo determinado, que depende del agente en
cuestión, se pueden observar y estudiar las acciones del virus. No se emplea
para el diagnóstico virológico.
Los cultivos celulares constituyen la herramienta
para el estudio de los virus. Para su preparación
se parte de tejidos que son disociados por disrupción
mecánica seguida de un tratamiento con enzimas proteolíticas en una suspensión
celular simple. Luego son suspendidos en medios de cultivo líquido y depositados en
frascos o placas. Tras dividirse las células cubrirán la superficie, por ejemplo células
epitelioides, fibroblásticas. Se van a adherir, van a formar una monocapa y a partir de
allí se comienza el estudio.
Efecto citopático: Alteración morfológica de las células consecutivas a una infección
viral y observable con el microscopio óptico. Puede observarse lisis, redondeamiento,
formación de sincicios o cuerpos de inclusión, dependiendo del virus
Existen diferentes tipos de cultivo:
-Cultivos primarios: se prepara de tejidos animales. No superan los 5 o 10 pasajes celulares.
-Cultivos de células diploides: son una población de células de un determinado tipo que pueden llegar a
soportar 20-50 pasajes.
-Líneas continuas o heteroploides: es un tipo celular simple que tiene una capacidad de división infinita y por lo
general proviene de tejidos tumorales, no se puede utilizar para vacunas.
¿CÓMO PODEMOS EVIDENCIAR EL CRECIMIENTO VIRAL EN UN CULTIVO CELULAR?
La capacidad lítica de algunos virus sobre las células en las cuales replican pueden evidenciarse por la desunión a
la superficie plástica del soporte donde están cultivadas. A medida que el número de células infectadas va
creciendo los cambios se hacen visibles para dar los efectos o acciones citopáticas. Pueden ser diversos pero
los podemos dividir en dos grandes grupos:
-Los que producen cambios morfológicos: picnosis nuclear, proliferación de membrana nuclear, vacuolas en el
citoplasma, sincicios (células gigantes multinucleadas por fisión celular), redondeamiento y desprendimiento
celular.
-Los que producen la formación de cuerpos de inclusión: viriones en el núcleo, nucleocápsides en citoplasma,
por ej los cuerpos de Negri en el virus de la rabia, y presencia de cuerpos de Guarnieri en los poxvirus. El tiempo
requerido para la aparición de estos efectos puede variar entre 24/48hs hasta varias semanas.
No todos los virus presentan efecto citopático. Muchos se multiplican sin causar un efecto citopático. Para
observar la presencia del virus se requieren técnicas específicas, una de ellas es la inmunofluorescencia indirecta.
CARACTERIZACIÓN BIOQUÍMICA Y MOLECULAR
Ante la presencia de un nuevo virus hay que:
- Cultivarlo en grandes cantidades y purificarlo: Lograr un sustrato donde el virus
replique en altos títulos, es decir, lograr un cultivo celular en donde no solo la
célula sea susceptible, si no también permisiva, que permite la replicación viral
para lograr altos títulos y poder purificar el virus.
- Estudiar su estructura por microscopía electrónica de transmisión.
- Caracterizar sus proteínas tempranas: por electroforesis en geles de
poliacrilamida
- Caracterizar su ácido nucléico: Estudiar el genoma viral, caracterizarlo por
RNAsas y DNAsas.
- Estudiar su patogenia a nivel experimental: Desarrollar un modelo experimental en el cual en lo posible se
puedan cumplir los postulados de Koch para lograr estudiar la patogenia a nivel experimental.
Los postulados dicen que:
El agente patógeno se encuentra presente en animales enfermos y ausente en los sanos.
El agente debe ser cultivado en un cultivo puro, aislado del cuerpo del animal.
El agente aislado en un cultivo debe provocar enfermedad en el animal susceptible al ser inoculado.
- Detectar la presencia o ausencia de envoltura, estudiando la infectividad viral luego del tratamiento con
detergente.
Técnica de electroforesis para caracterizar proteínas estructurales. La electroforesis es
un método por el cual se separan moléculas por tamaño o peso molecular usando un
campo eléctrico. La separación se realiza comúnmente en un gel, que habitualmente es
poliacrilamida. Su principal uso es la separación de mezclas de ácidos nucleicos o
proteínas.
Los ácidos nucleicos disponen de una carga negativa, que cuando son separados en el gel
mediante una corriente eléctrica, se dirigirán hacia el polo positivo.
Las proteínas se cargan mediante una molécula llamada SDS, adquiriendo carga negativa.
Luego al someterlas a una corriente eléctrica se dirigen hacia el polo positivo. Las más
pequeñas van más rápido, y las más grandes van más lento de acuerdo al peso molecular.
Caracterización del ácido nucleico viral:
1- Tratamiento con DNAsa y RNAasa y enzimas de restricción con corrida electroforética. Para saber si
hablamos de RNA o DNA, si son de cadena simple o doble.
2-Tratamiento con enzimas de restriccion.
3- Clonación y secuenciación del genoma.
ESTUDIO DE LA PATOGÉNESIS VIRAL
La patogénesis viral es el espectro de eventos desencadenados por un virus que conducen a un daño y
enfermedad.
¿Cómo entra un virus a la célula?
¿Cómo es la respuesta inmune inicial?
¿Dónde ocurre la replicación viral primaria?
¿Cómo se disemina la infección en el huésped?
¿Qué órganos y qué tejidos se ven afectados?
¿Cómo es transmitida la infección a otros huéspedes?
¿La infección logra ser limitada en modo definitivo o evoluciona a la persistencia?
Tropismo: capacidad de un virus de infectar una población determinada de células de un órgano o tejido. Ésta
está influenciada por factores virales, que tienen que ver con la puerta de entrada, y factores del huésped, ya sea
cofactores celulares o co-receptores; y luego con la susceptibilidad y permisividad celular.
Una célula es susceptible cuando tiene receptores en la superficie que permiten que el virus se adhiera. Una
célula es permisiva cuando logra tener todos los cofactores necesarios para lograr una replicación eficiente.
REQUERIMIENTOS PARA QUE HAYA UNA INFECCIÓN EXITOSA Y PRODUCTIVA EN UN HUÉSPED
SUSCEPTIBLE:
1- Que haya suficiente cantidad de virus disponibles para iniciar la infección.
2- Que se encuentren con células en el sitio de infección susceptibles y permisivas para el virus.
3- Que los mecanismos de defensa locales deben estar ausentes o al menos inicialmente inefectivos.
ESTUDIO DE LA PATOGÉNESIS VIRAL
• Empleado de cultivos celulares (Estudio de receptores, mecanismo de entrada y salida del virus, efecto
citopático, etc)
• Uso de modelos animales experimentales (Estudios de progresión de la infección, rta inmune, patología,
expresión de antígenos e interacción molecular con las proteínas del huésped)
CO-INMUNOPRECIPITACIÓN
• Se desea saber con qué proteínas celulares interactúa una proteína viral determinada.
• a un cultivo celular infectado con el virus se le extraen las proteínas.
• A ese extracto acuoso se le agrega un suero contra la proteína viral.
• Luego le agrega proteína «a» de estafilococos conjugada con bolitas microscópicas de sefarosa.
• se centrifuga. Se obtiene así la proteína viral unida a las proteínas desconocidas.
• se las separa por sds-page.
• luego se caracteriza a las proteínas desconocidas
REPLICACIÓN VIRAL
El proceso se inicia con la absorción del virus a la superficie celular. Produciéndose luego la penetración y el
posterior denudamiento del genoma viral para iniciar su expresión.
Debe tenerse en cuenta que el genoma viral se halla envuelto por una cubierta protectora proteica, la cápside.
Para expresarse dentro de la célula debe liberarse de dicha cápsula: descapsidación o desnudamiento.
La siguiente etapa comprende la expresión y replicación del genoma viral. Estos procesos se realizan con
distintas estrategias que dependen de la estructura y organización de los genomas virales.
Finalmente los productos virales sintetizados, ácidos nucleicos y proteínas son ensamblados. Estas estructuras
usualmente sufren modificaciones para conformar finalmente el virus progenie, que es la etapa de ensamble,
maduración y egreso.
La etapa de absorción constituye la unión específica de una proteína viral con un constituyente de la membrana
celular, que es el receptor. Si no hay receptores no habrá infección viral productiva. La absorción es una etapa de
importancia fundamental en el ciclo de replicación viral, ya que el tropismo celular está vinculado a la
naturaleza de la glicoproteína de superficie viral y al receptor celular.
Posteriormente, ocurre la penetración. Se realiza por uno de los dos mecanismos siguientes:
-Endocitosis mediada por receptor
-Fusión
Todos los virus desnudos penetran en la célula siguiendo el camino de la Endocitosis mediada por receptor. Los
virus utilizan un mecanismo celular preexistente. Los virus absorbidos a los receptores celulares son englobados
formando una vesícula pequeña cubierta externamente por moléculas de clatrina, y luego rápidamente se forman
endosomas desde donde se libera al citoplasma la nucleocápside viral: genoma y proteínas.
Los virus con envoltura que contiene glicoproteínas con actividad fusionante, pueden promover luego de
absorberse el receptor celular la fusión entre la membrana celular con la envoltura viral, ingresando la
nucleocápside directamente al citoplasma.
Posteriormente tenemos el desnudamiento, que en algunos virus se produce a nivel
de los poros de la membrana nuclear liberándose el genoma al interior de la célula
infectada.
A la izquierda: Virus aftosa unido a una integrina de la membrana plasmática celular.
A la derecha: Avance de foliomavirus hacia el núcleo celular por microtúbulos. A, B y
C: avance del virus por microtúbulos. Esto no ocurre si se despolimerizan los
microtúbulos (D, E y F)
Receptores celulares para virus
● No están destinados para combinarse con virus sino con otras molec de importancia en la biología de la cel
● Los virus se adaptaron a los mimos, tomandolos como propios a lo largo de la evolución biológica
● Determinan la especificidad de un virus por una especie animal dada y por un órgano dado
● Si no hay receptores no habrá infección viral productiva
TIPOS DE GENOMAS VIRALES
• ADN DE DOBLE CADENA • ARN DE DOBLE CADENA
• ADN DE CADENA SIMPLE • ARN Y TRANSCRIPCIÓN INVERSA
• ARN DE CADENA SIMPLE • ARN SEGMENTADO
CICLO DE REPLICACIÓN VIRAL
El virus ingresa, a través de la absorción, o un receptor celular. Puede
ingresar a través de fusión, como es el caso de los virus envueltos, o a
través de endocitosis mediada por receptor.
En el caso de endocitosis mediada por receptor cuando ingresan a la
célula, el virus ingresa por un endosoma y libera la nucleocápside.
Cuando es por fusión libera directamente la nucleocápside, porque la
envoltura queda en la superficie de la célula.
Posteriormente, después del desnudamiento, queda listo el genoma para
producir la síntesis de proteínas y la replicación del genoma. Entonces se
van a sintetizar proteínas estructurales, enzimas que van a intervenir en la
replicación del genoma, y proteínas inhibitorias de la función celular.
Cuando tenemos replicación genómica y la presencia de proteínas, se ensambla todo, forma la nucleocápside con
el genoma, y esas partículas virales pueden salir por brotación o por lisis de la célula.
En el caso de los virus envueltos, la salida
de ellos en células que están polarizadas
determina el grado de diseminación. Los que
brotan por apical van a producir infecciones
localizadas, mientras que los que brotan por
la membrana basolateral suelen producir
diseminación con viremia. La polaridad
determina la diseminación posterior de los
virus envueltos. El virus influenza brota por el
borde apical, mientras que el VSV lo hace por
la membrana basolateral. El primero no producirá viremia, mientras que el segundo, sí lo hará.
PATOGÉNESIS VIRAL
Es el conocimiento de los procesos mediante los cuales un virus produce enfermedad en el huésped. Un virus
puede ingresar y replicarse en un huésped y aún inducir una respuesta inmune, pero sin producir signos ni
síntomas de enfermedad.
A nivel temporal las infecciones pueden ser de corta duración y autolimitadas, infecciones agudas; o pueden ser
de duración prolongada produciendo infecciones persistentes, que pueden permanecer durante toda la vida del
huésped.
VÍAS DE ENTRADA
Para que un virus pueda propagarse eficientemente en la naturaleza debe poseer la capacidad de pasar de un
huésped infectado a otros huéspedes susceptibles.
Existen varias rutas para la diseminación viral:
- Fecal-oral: los virus entéricos son diseminados en altos títulos y por períodos prolongados a través de la materia
fecal.
- Respiratoria: se diseminan por aerosoles producidos por la tos o estornudos.
- Otros se diseminan a través de la saliva, secreciones nasales, por contacto directo con estas sustancias.
- Los virus que infectan el tracto genital están frecuentemente en las secreciones genitales. La transmisión
sexual a través del semen infectado tiene un rol muy importante en la transmisión del virus Herpes, HIV.
- Los virus presentes en la leche y el calostro pueden ser causantes de algunas infecciones perinatales, ej, HIV.
Aunque muchos virus se pueden encontrar en la orina, ésta no constituye una fuente muy importante de
transmisión viral. Una excepción importante a esta regla pueden ser los arenavirus y hantavirus, para los que la
orina de roedores es una fuente de transmisión viral, y el contacto con los aerosoles resultantes de la orina
deshidratada puede provocar infecciones en las manos.
En otros casos, la sangre u otros tejidos infectados pueden ser una fuente importante de transmisión viral, como
es el caso de hepatitis B, C, HIV. Esta vía de infección se ve facilitada por diferentes prácticas médicas,
transfusión de sangre, productos derivados, procedimientos quirúrgicos, como trasplante de órganos, prácticas
culturales como los tatuajes, uso de drogas ilegales endovenosas.
En el caso de los arbovirus la transmisión mediante un artrópodo desde un huésped virémico a un individuo no
infectado constituye una parte esencial del ciclo de vida natural de los virus. La probabilidad de transmisión está
afectada por la magnitud y la duración de la viremia, y por varios factores específicos del vector, tales como el
grado de replicación viral en el vector, sus hábitos nutricionales y el ciclo de vida estacional.
La transmisión de la infección por material contaminado con sangre infectada es también una parte integral del
ciclo vital de muchos virus que producen síndromes de fiebres hemorrágicas.
TIPOS DE INFECCIONES VIRALES
• PRODUCTIVAS:
En general de curso agudo (en poco tiempo). replicación viral con altos títulos y respuesta inmune efectiva.
ej, gripe, sarampión, rotavirus.
• PERSISTENTES:
• crónicas: los virus replican a títulos bajos y la respuesta inmune existe pero es ineficiente para erradicarlos
del todo. ej, hepatitis b ó c; hiv.
• latentes: luego de la infección los virus replican pero luego se acantonan en el interior de las células como
mecanismo de evasión de la respuesta inmune. ésta es eficiente. periódicamente se reactivan. ej, virus herpes.
• lentas: raras. algunos virus establecen infecciones de muy larga data luego de la primoinfección, con poca
respuesta inmune. ejemplo: panencefalitis esclerosante subaguda mucho tiempo después de haber tenido
sarampión. Actualmente se acepta que las denominadas «encefalopatías espongiformes» no son producidas por
«virus lentos» sino por priones.
• transformantes: luego de un ciclo de replicación los virus se integran al genoma celular. con poca respuesta
inmune. son cofactores en la inducción de cánceres.
CONCLUSIONES: FACTORES DETERMINANTES DE UNA INFECCIÓN VIRAL
• existencia de receptores celulares para el virus en el organismo.
• tamaño del inóculo.
• estado general del paciente (nutrición, patologías previas, edad, factores socioambientales y laborales)
• funcionalidad de la respuesta inmune (inmunidad innata e inmunidad adquirida)
• el curso de una infección (viral o de cualquier otro tipo) dependerá de un equilibrio entre la magnitud y velocidad
de la infección y la rapidez y eficiencia de una respuesta inmune adecuada.
