Descripción general de la tinción con

H&E: Una guía de mejores prácticas

Cindy SampiasJD CT(ASCP)HTL

Geoffrey RollsBAppSc, FAIMS

Para el diagnóstico rutinario, los patólogos prefieren de lejos el uso de
hematoxilina y eosina (H&E) para ver los detalles de la estructura celular y tisular.
La variación de la intensidad de la tinción a menudo viene determinada por la
experiencia de aprendizaje y las preferencias personales del patólogo. Debido a
que esta tinción demuestra una gama tan amplia de características citoplásmicas,
nucleares y de matriz extracelular, casi todos los textos didácticos utilizan imágenes
de H&E. Hoy en día seguimos utilizando esta simple y esencial tinción, que ha
permanecido sin cambios durante más de un siglo.
Fig. 1: H&E de la piel. Observe la coloración equilibrada en esta sección de la piel.
Los núcleos se tiñen de morado, mientras que los componentes citoplásmicos son
de color rosa.
El procedimiento de tinción H&E sigue un protocolo básico:

 Desparafinado
 Deshidratación
 Hematoxilina
 Diferenciación
 Azulado
 Eosina
 Deshidratación
 Aclaramiento
 Montaje

El formato se reproduce fácilmente y los reactivos son lo suficientemente

resistentes como para permitir la tinción uniforme de grandes cantidades de
preparaciones antes de tener que cambiar los reactivos.

Fig. 2: H&E de colon. Observe la coloración equilibrada en esta sección del colon.
Las microvellosidades del epitelio columnar son muy nítidas. Crédito de la
fotografía: Stanley Hansen
En el pasado, las tinciones y sus componentes se fabricaban de forma rutinaria en
el laboratorio. Los reactivos prefabricados y disponibles comercialmente eran poco
frecuentes y caros. Por lo tanto, como forma económica de realizar este tipo de
tinción, los técnicos aprendieron a fabricar los tintes según era necesario. El reto
era asegurarse de que la calidad de la tinción fuera uniforme. Los diferentes
técnicos siguen las recetas utilizando su propio enfoque individual, por lo que la
fabricación de tintes normalmente se deja a cargo de una persona. Dicho esto,
también había más técnicos en el laboratorio, por lo que el tiempo necesario para
preparar los reactivos no afectaba la carga de trabajo general del equipo.

Fig. 3: H&E de placenta. Los glóbulos rojos de esta sección placentaria representan
la coloración clara que puede experimentarse con esta simple tinción
Muchos laboratorios consideran que pedir las tinciones es la forma más sencilla de
garantizar una calidad uniforme y repetible. Una gran variedad de combinaciones
de tinción de hematoxilina y eosina proporcionan la capacidad de personalizar los
resultados deseados con muy poco esfuerzo. A medida que más técnicos se jubilan
y las empresas se vuelven más eficientes, la reducción de personal hace que el uso
de reactivos disponibles comercialmente sea ideal porque los técnicos pueden
centrarse en la inclusión y el corte, que son las áreas del laboratorio que cuentan
con la menor automatización.
 Fig. 4: H&E, con glomérulos (flecha roja) y túbulos (flecha azul). Los núcleos se
tiñen de morado, mientras que los componentes citoplásmicos de color rosa.
Para los nuevos profesionales que entran en el campo de la histología, los días de
fabricación de reactivos se están convirtiendo rápidamente en algo del pasado.
Creo que este cambio puede ser problemático, principalmente porque parte del
arte que es típicamente histología se pierde. Uno de mis desafíos personales al
trabajar con estudiantes es ayudarles a solucionar anomalías de tinción. Cuando el
laboratorio realiza tinciones, el equipo aprende de la experiencia práctica, lo que
ocurre cuando falta un componente o se añade un componente incorrecto a la
mezcla. Estos cambios pueden hacer alteraciones sutiles en las preparaciones
teñidas, lo que se espera que el equipo de histología arregle en última instancia.
Por último, los equipos de histología más nuevos pueden tener dificultades a la
hora de abordar estos cambios sutiles de fácil arreglo, sin tener la experiencia de
producir reactivos y las lecciones aprendidas en ese proceso.
¿Qué contiene una tinción H&E?

Las tinciones de hematoxilina y eosina se utilizan en muchas áreas del laboratorio

de histología, incluidas secciones congeladas, aspiraciones con aguja fina y tejidos
incluidos fijados en parafina. Para comprender mejor cómo debe ser una
preparación bien teñida, es importante comprender los componentes de la tinción.

La hematoxilina se utiliza para ilustrar los detalles nucleares en las células. La

profundidad de la coloración no solo está relacionada con la cantidad de ADN en
los núcleos, sino también con el tiempo durante el que la muestra se deje en
hematoxilina.
La hematoxilina es un colorante razonablemente simple de preparar. El propio
colorante se extrae del árbol Haematoxylon campechianum. La oxidación de la
hematoxilina produce hemateína, que es el colorante utilizado en una tinción H&E.
La adición del mordiente mejora la capacidad de la hemateína para unirse a los
componentes aniónicos (cargados negativamente) de los tejidos.

Fig. 5: En esta imagen de un meduloblastoma anaplásico de células grandes, la

hematoxilina juega un papel clave en el diagnóstico. Observe las figuras mitóticas,
que indican un tumor de crecimiento rápido. La irregularidad nuclear y la
aglutinación de cromatina también se observan en las células. Crédito de la
fotografía: Frontalcortex.com
Las hematoxilinas se clasifican típicamente según el mordiente utilizado antes de la
tinción. Los mordientes refuerzan la carga iónica positiva de la hematina. Esto
ayuda a la unión de la hematina al componente de tejido aniónico, que es la
cromatina más común. El tipo de mordiente también influye en el color final de los
componentes teñidos. El mordiente más común utilizado en la histología de rutina
es el sulfato de aluminio y amonio (alum). Este mordiente hace que los núcleos se
vean de color rojo, que luego cambia al azul más familiar cuando la muestra se
enjuaga posteriormente con una solución débilmente básica.

La hematoxilina de Mayer es una hematoxilina alumínica, una tinción de uso común

que puede emplearse para tinciones progresivas y regresivas. Se utiliza a menudo
como contratinción nuclear para tinciones especiales e inmunohistoquímica. Para
estas aplicaciones, la solución de Mayer se utiliza para teñir los núcleos y luego
teñir de azul sin utilizar un diferenciador. La de Mayer es una tinción a base de
agua.
La hematoxilina de Harris es otra hematoxilina alumínica de uso frecuente que
puede utilizarse para la tinción progresiva de muestras citológicas, pero también
para la tinción progresiva o regresiva en histología. La tinción tiende a
proporcionar detalles nucleares claros. Uno de los retos al utilizar Harris es que se
diferencia mejor con un ácido suave, en lugar de los diferenciadores a base de
ácido clorhídrico más utilizados. Harris es una tinción a base de alcohol. La
hematoxilina de Gill es una hematoxilina alumínica. Puede utilizarse como tinción
progresiva o regresiva y está disponible en diferentes concentraciones. Debido a
que se fabrica con agua y etilenglicol, la autooxidación de la tinción se evita
normalmente durante meses, lo que la hace más estable que la hematoxilina de
Harris. Sin embargo, la naturaleza de la de Gills hace que pueda producirse tinción
extranuclear. La mucina e incluso los adhesivos utilizados en la preparación pueden
contaminarse con Gills.

Las hematoxilinas que utilizan sales de hierro como mordiente se utilizan

normalmente en tinciones especiales. Esto se debe a que pueden mostrar más
estructuras tisulares que las hematoxilinas alumínicas, como las fibras de mielina y
elastina. Uno de las más conocidas es la de Weigert, que se utiliza en la tinción
Verhoff-Van Gieson, que se muestra en la imagen.

Fig. 6: Observe las fibras de elastina en la aorta teñidas con Verhoff-Van Gieson,
también conocida como tinción elástica. Los cambios en estas fibras sugieren
procesos patológicos que, de otro modo, no se detectarían. Crédito de foto:
Stanley Hansen
Una vez revisadas las tinciones nucleares, hablemos de los tintes del componente
citoplásmico. La eosina es la contratinción más comúnmente utilizada que
distingue entre el citoplasma y los núcleos de las células. Suele ser rosa, con
diferentes tonos de rosa para diferentes tipos de fibras de tejido conjuntivo

La eosina Y es la forma de eosina más utilizada y puede utilizarse tanto en agua

como en alcohol. La adición de una pequeña cantidad de ácido acético definirá aún
más la tinción de la eosina. La eosina con floxina añadida realzará los rojos
observados con la tinción con H&E. Por lo tanto, para aquellos que quieran ver
rojos más intensos, se puede añadir floxina.

Fig. 7: Los núcleos de esta imagen tienen un buen contraste con el citoplasma y los
eritrocitos dentro del vaso sanguíneo. Nótese la intensidad de los eritrocitos en
comparación con el rosa del citoplasma de las células circundantes.
Muchos laboratorios consideran que pedir las tinciones es la forma más sencilla de
garantizar una calidad uniforme y repetible. Una gran variedad de combinaciones
de tinción de hematoxilina y eosina proporcionan la capacidad de personalizar los
resultados deseados con muy poco esfuerzo. A medida que más técnicos se jubilan
y las empresas se vuelven más eficientes, la reducción de personal hace que el uso
de reactivos disponibles comercialmente sea ideal porque los técnicos pueden
centrarse en la inclusión y el corte, que son las áreas del laboratorio que cuentan
con la menor automatización.

A veces se utilizan otras mezclas de eosina, como EA50 y EA65. Estas tinciones se
utilizan principalmente para citología y, además de la eosina Y, incluyen el verde
claro, el amarillento y el marrón Bismarck. La adición de estos dos tintes
proporciona las variaciones de color del citoplasma azul pálido al rosa, que se
aprecia mejor en las células escamosas de una citología vaginal. La concentración
de la mezcla determina la designación de 50 o 65.

Fig. 8: En esta imagen de una citología vaginal de una paciente que muestra
carcinoma escamoso, se puede apreciar la belleza de la variada coloración
citoplasmática. La flecha roja indica un núcleo maligno con muy poco citoplasma.
La flecha negra ilustra una célula inflamatoria aguda normal, similar en tamaño a
los eritrocitos de la imagen anterior. Nótese cómo el tamaño de la célula maligna
es mayor en comparación con el de los núcleos normales de la imagen anterior.
La diferenciación de las tinciones permite eliminar de forma selectiva la tinción de
los tejidos al gusto del técnico. En el caso de la hematoxilina, el ácido clorhídrico
(para una diferenciación rápida) y el ácido acético (para una diferenciación más
lenta y más controlada) se utilizan con mayor frecuencia. Aunque el ácido
clorhídrico (HCl) ha sido históricamente el estándar, se utilizan ácidos más suaves
para proporcionar una eliminación más suave del tinte. Parte de esta tendencia se
debe al uso de la tinción automatizada, que debe adaptarse al movimiento del
brazo robótico además del tiempo empleado en el reactivo.

Los reactivos que confieren coloración azul, como el agua corriente de Scott, se
utilizan para cambiar la hematoxilina del rojo al color azul tradicional que
esperamos. Estas soluciones ligeramente básicas alteran químicamente el colorante
para producir este cambio de color. En algunos lugares, el agua del grifo contiene
minerales en tales cantidades que el pH hace que el agua sea lo suficientemente
básica como para permitir la tinción de color azul de los núcleos sin necesidad de
un reactivo específico para el azulado. Sin embargo, en la mayoría de los casos, los
laboratorios normalmente añaden este paso para garantizar un azulado adecuado.
En combinación, estos componentes constituyen la tinción estándar más utilizada
en el laboratorio de histología.
Selección del protocolo de tinción H&E

El siguiente paso para obtener una buena tinción es determinar qué tipo de tinción
H&E se desea. Por lo general, hay 3 tipos de tinciones H&E: progresivas,
progresivas modificadas y regresivas.

La tinción progresiva se produce cuando la hematoxilina se añade al tejido sin ir

seguida de un diferenciador para eliminar el exceso de colorante. Debido a que no
hay un paso de diferenciación, puede producirse tinción de fondo, especialmente
con preparaciones cargadas o tratadas. Los patólogos a veces prefieren este tipo
de tinción, porque el material no celular, como la mucina, se tiñe con la
hematoxilina. Esta tinción extracelular puede ser un indicador de tumores bien
diferenciados.

Fig. 9: En esta sección del colon, la mucina sigue siendo visible con las células
caliciformes.
Tabla: Este protocolo es una tinción simple regresiva que proporciona un buen
equilibrio de tinciones nucleares y citoplasmáticas. Este protocolo está diseñado
con un diferenciador de ácido suave en mente.

Una vez seleccionados los componentes de tinción, se recomienda comenzar con el

protocolo inicial. A partir de ahí, se varía la hematoxilina en incrementos de 30
segundos o la eosina en incrementos de 15 segundos. Recuerde que la eosina
tiende a penetrar mucho más rápido. A menos que sea necesario aclarar u
oscurecer significativamente la intensidad de la tinción con eosina, los incrementos
más cortos son los más convenientes. También es importante que solo se cambie
una tinción cada vez. Puede parecer que la hematoxilina manifieste una tinción
excesiva, cuando en realidad es la eosina la que debe ser más intensa.

A medida que los laboratorios siguen creciendo, es esencial la necesidad de

resultados uniformes y un rendimiento continuo. La reproducibilidad es una parte
importante de la calidad de las tinciones de laboratorio. Cuando se realiza la
tinción manual, las variables humanas pueden hacer que cada rack de
preparaciones teñidas tenga un aspecto diferente respecto al anterior. La
automatización del proceso no solo elimina la posibilidad de introducir
incoherencias, sino que también libera tiempo a los técnicos, el cual podrán dedicar
a otras tareas del laboratorio.

Es importante lograr el equilibrio adecuado de los tintes. Una tinción excesiva con
hematoxilina puede crear la ilusión de eosina insuficientemente teñida, al igual que
la una tinción excesiva con eosina puede hacer que la hematoxilina parezca más
clara de lo que realmente es. Por lo tanto, al optimizar la tinción, asegúrese de
editar solo la hora de uno de los componentes. Esta técnica ayudará a eliminar la
necesidad de dedicar tiempo adicional a ajustar la tinción.

Xileno 2 minutos
Xileno 2 minutos
Etanol al 100% 2 minutos
Etanol al 100% 2 minutos
Etanol al 95% 2 minutos
Lavado con agua 2 minutos
Hematoxilina 3 minutos
Lavado con agua 1 minuto
Diferenciador (ácido
1 minuto
suave)
Lavado con agua 1 minuto
Azulado 1 minuto
Lavado con agua 1 minuto
Etanol al 100% 1 minuto
 Eosina 45 segundos
Etanol al 95% 1 minuto
Etanol al 100% 1 minuto
Etanol al 100% 1 minuto
Xileno 2 minutos
Xileno 2 minutos
Cubreobjetos

Fig. 10: En esta imagen, los núcleos de esta muestra de colon parecen abrumar los
demás componentes celulares. Incluso los glóbulos rojos parecen atenuados. Un
tiempo inferior en hematoxilina o un tiempo superior en eosina puede
proporcionar un mejor equilibrio.
 Fig. 11: Los núcleos de esta sección del riñón se pierden en el rosa de la eosina. El
tiempo adicional en hematoxilina haría que estos núcleos fueran mucho más fáciles
de ver.
Con la tinción progresiva regresiva y modificada, se utiliza un diferenciador. Si el
diferenciador se fabrica internamente, existe la posibilidad de que sea demasiado
débil o demasiado fuerte. Ambos escenarios afectarán a la tinción. Si el
diferenciador es más fuerte de lo previsto, eliminará más hematoxilina y hará que
los núcleos se vuelvan más pálidos. El tiempo también es importante. El exceso de
tiempo en un diferenciador adecuadamente preparado también eliminará más
hematoxilina y acabará dando lugar a una tinción insuficiente de los núcleos.

Una acidez leve es fundamental para la vida útil de la hematoxilina. Sin ella, la
alcalinidad del aclarado con agua del grifo elevará el pH, lo que hará que el lago de
tinte pueda precipitarse y que el color cambie de rojo cereza a rojo púrpura. La
adición periódica de pequeñas cantidades de ácido acético a la hematoxilina
ayudará a mantener un pH adecuado y puede prolongar la vida útil de la tinción.

El agua se utiliza como diferenciador de la eosina. Es común seguir el paso de

eosina con etanol al 95 %. El etanol ayuda a enjuagar la preparación, mientras que
el agua extrae el exceso de eosina del tejido. Este paso puede ayudar con el control
de la coloración, pero al extender el tiempo se obtienen tinciones más claras,
mientras que acortándolo se mantiene una coloración más brillante. Sin embargo,
el exceso de agua en xileno puede continuar el proceso de diferenciación y puede
verse después del montaje como una opacidad rosa en la preparación.
No todos los tejidos se crean de la misma forma. Los quistes y las muestras de
grasa, incluso cuando se procesan correctamente, pueden ser muy difíciles de ver a
simple vista una vez que se ha teñido la preparación. Estas muestras a menudo
tienen espacios abiertos donde había líquidos o grasa en la célula, y la delgadez de
las paredes celulares puede dar la apariencia de ser que son claras cuando la
coloración es simplemente un artefacto del tipo de tejido.

Las muestras altamente celulares (p. ej., amígdala o ganglio linfático) pueden dar
muchos problemas. Recuerde que los linfocitos tienen poco citoplasma y que no
hay casi material celular entre las células como ocurre con otros tejidos. Por este
motivo, la hematoxilina no tiene que competir con la eosina. La naturaleza
compacta de las células también concentra el ADN, lo que proporciona a estos
tejidos altamente celulares la apariencia de estar excesivamente teñidos, cuando en
realidad, es posible que simplemente necesiten cortarse más finos.

Fig. 12: Ganglio linfático

 Fig. 13: Riñón: Observe las diferencias entre esta sección del ganglio linfático y la
del riñón, ambas cortadas a 4 µm. Estas muestras, teñidas con el mismo protocolo,
tienen un aspecto muy diferente debido a la celularidad.
El uso de reactivos desparafinantes limpios y frescos es esencial para la eliminación
de la parafina de la preparación antes de añadir los tintes. Aunque el xileno es el
disolvente utilizado con más frecuencia, los sustitutos del xileno están ganando
popularidad porque se consideran menos peligrosos y más ecológicos. La
presencia de agua en los disolventes, ya sea proveniente de la contaminación de
reactivos o de un entorno con alta humedad, reduce la capacidad del disolvente
para eliminar la parafina. Los restos de parafina evitan que los tintes penetren en
los tejidos, lo que da un aspecto desigual.

La forma más sencilla de evitar que esto ocurra es cambiar los reactivos con más
frecuencia. La adición de una pequeña cantidad de gránulos de desecante
(aproximadamente una cucharada por recipiente de reactivo) también reducirá la
contaminación del agua en los disolventes. Estas medidas son especialmente
importantes cuando se utiliza un sustituto del xileno, ya que estos reactivos tienden
a ser mucho menos tolerantes a cualquier contaminación con agua en
comparación con el xileno.
Guía paso a paso para realizar una tinción H&E

La tinción con hematoxilina y eosina (H&E) es la más utilizada en laboratorios de

histología e histopatología. Cuando se realiza correctamente, tiene la capacidad de
demostrar una amplia gama de componentes celulares y tisulares normales y
anómalos, y es una tinción relativamente sencilla para realizar en secciones de
parafina o congeladas. En histopatología, un patólogo experimentado puede
diagnosticar una alta proporción de casos utilizando solo una tinción H&E.

Se puede teñir manualmente de forma efectiva un pequeño número de

preparaciones en laboratorios con un alto rendimiento. Se puede realizar con éxito
y de forma sistemática mediante estaciones de tinción de preparaciones
automatizadas.

Hay una serie de diferentes formulaciones de hematoxilina y eosina de uso

popular, cada una con varias ventajas y desventajas. Algunos laboratorios prefieren
preparar sus propias soluciones, mientras que otros eligen productos comerciales
listos para usar.
Introducción

La tinción H&E proporciona una imagen completa de la microanatomía de órganos

y tejidos. La hematoxilina tiñe con precisión los componentes nucleares, incluidos
la heterocromatina y los nucléolos, mientras que la eosina tiñe los componentes
citoplasmáticos, como el colágeno y las fibras elásticas, las fibras musculares y los
glóbulos rojos. En una H&E de alta calidad, existen diferencias sutiles en los tonos
de color producidos por las tinciones, especialmente la eosina, y esto ayuda a la
detección e interpretación de los cambios morfológicos asociados con la
enfermedad.

Es importante que las personas que realizan y evalúan las tinciones H&E para
verificar la calidad sean conscientes de las sutilezas de la tinción, conozcan lo que
se puede lograr cuando la tinción se realiza correctamente con reactivos de alta
calidad y sepan qué buscar microscópicamente. El mantenimiento de tinciones
H&E uniformes y de alta calidad es un requisito fundamental en los laboratorios de
histopatología.

En las secciones siguientes se describen los pasos básicos para realizar una tinción
con H&E.

Retire la parafina

Tras la preparación de una sección de parafina, todos los elementos se infiltran y

rodean con cera de parafina, que es hidrófoba e impermeable a los reactivos
acuosos. La mayoría de los componentes celulares y tisulares no tienen color
natural y no son visibles. El primer paso para realizar una tinción H&E es disolver
toda la cera con xileno (un disolvente hidrocarbonado).
Hidratar la sección

Después de eliminar completamente la cera, se hace pasar la preparación por

varios cambios de alcohol para eliminar el xileno y luego se enjuaga a fondo con
agua. La sección ahora está hidratada para que los reactivos acuosos penetren
fácilmente en las células y los elementos tisulares.

Aplicar la tinción nuclear de hematoxilina

La preparación ahora se tiñe con una tinción nuclear como la hematoxilina de

Harris, que consiste en un colorante (hematoxilina oxidada o hemateína) y un
mordiente o agente aglutinante (una sal de aluminio) en solución. Inicialmente,
esto tiñe los núcleos y algunos otros elementos de color morado rojizo.

Complete la tinción nuclear mediante el “azulado”

Después de aclarar en agua del grifo, la sección se vuelve azul mediante el

tratamiento con una solución débilmente alcalina. Este paso tiñe la hematoxilina de
un color azul oscuro. Ahora se puede enjuagar y comprobar la sección para ver si
los núcleos están correctamente teñidos y muestran el contraste adecuado y para
evaluar el nivel de tinción de fondo.

Elimine el exceso de tinción de fondo (diferenciación)

En la mayoría de las ocasiones, cuando se emplea hematoxilina de Harris, se

requiere un paso de diferenciación (destinción) para eliminar la tinción de fondo no
específica y mejorar el contraste. Se utiliza un alcohol ácido débil. Después de este
tratamiento, se requiere de nuevo el proceso de azulado y enjuagar a fondo. Los
métodos de tinción que incluyen un paso de destinción o diferenciación se
denominan tinciones “regresivas”.

Aplicar la contratinción con eosina

La sección se tiñe ahora con una solución acuosa o alcohólica de eosina

(dependiendo de la preferencia personal). Esto tiñe muchos elementos no
nucleares en diferentes tonos de rosa.

Enjuague, deshidrate, aclare y monte la preparación (aplicación del

cubreobjetos)
Tras la tinción con eosina, la preparación pasa por varios cambios de alcohol para
eliminar todos los restos de agua, y luego se aclara con varios baños de xileno, el
cual “limpia” el tejido y lo hace completamente transparente. Se aplica una fina
capa de medio de montaje de poliestireno, seguida de un cubreobjetos de vidrio.
Si la tinción y todos los pasos posteriores se han realizado correctamente, la
preparación revelará todos los componentes microscópicos importantes y
permanecerá estable durante muchos años.
Resolución de problemas con tinciones con H&E

Aunque la tinción con H&E es relativamente sencilla de realizar, existen diversos

artefactos que pueden interferir con una buena tinción.

Los artefactos pueden atribuirse a diversas causas.

Resolución de problemas con tinciones con H&E

Pasos para una mejor tinción de rutina (H&E) y colocación del
cubreobjetos

Desde el paciente hasta el patólogo, la preparación de muestras de tejidos para su

examen histológico requiere cuidado, habilidad y un procedimiento delicado. Esta
guía proporciona asesoramiento práctico sobre las mejores técnicas, así como
formas sencillas de evitar errores comunes.

En esta sección se proporcionan consejos para una mejor tinción rutinaria y la

colocación del cubreobjetos. Esperamos que cada paso proporcione un valioso
recordatorio de buenas prácticas histológicas y también ayude a solucionar
problemas cuando se produzcan resultados inaceptables.

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Paso 52: Usar un tiempo preciso

Cada paso del protocolo de tinción se cronometra con precisión.

Los tiempos de los pasos de la tinción son aproximados y, “si tenemos prisa”, se
saltan algunos pasos. Esto puede producir resultados incoherentes.
 Estas secciones se cortaron del mismo bloque con el mismo grosor y las tiñeron
manualmente con H&E diferentes miembros del personal utilizando el que se
suponía que era el mismo método. Incluso puede observarse macroscópicamente
la irregularidad de la tinción.
Paso 53: Supervisar con regularidad la calidad

Se tiñen con regularidad preparaciones de control para supervisar la calidad de la

tinción.

Nunca se utilizan preparaciones de control para tinciones con H&E. Esto puede
dificultar mucho la determinación de si un problema de tinción se debe a reactivos
de mala calidad, a un protocolo inadecuado o a una mala fijación.
 Esta sección del riñón incluye diversos elementos de tejido eosinofílicos y núcleos
bien conservados que permiten una evaluación fiable de la calidad de la tinción
con H&E. La placenta es otro tipo de muestra que puede utilizarse como control
útil.
Paso 54: Estandarizar las condiciones de tinción

Los tiempos de agitación, lavado y drenaje se optimizan para todos los pasos
durante la tinción.

Los tiempos de agitación, lavado y drenaje son incoherentes. Los disolventes y los
reactivos se contaminan rápidamente. La tinción se vuelve incoherente.

Una de las ventajas de utilizar un instrumento de tinción automático es que los

tiempos de agitación, lavado y drenaje son constantes. Si se controlan
adecuadamente otras variables, se garantizan resultados buenos y coherentes.
Paso 55: Garantizar una eliminación completa de la parafina

Se optimiza la eliminación de parafina de las preparaciones.

La eliminación de parafina de las preparaciones a veces es incompleta y las

preparaciones contienen parches de parafina residual. Esto produce zonas sin
tinción o con tinción irregular en las secciones.

Esta sección teñida con H&E muestra una gran zona sin tinción a la izquierda y
varias zonas más pequeñas que están parcialmente teñidas o sin tinción. Esto se
debe a la eliminación incompleta de la parafina antes de la tinción
Paso 56: Renovar los reactivos con regularidad

Los disolventes y los reactivos de tinción se sustituyen regularidad en función del

número de preparaciones teñidas o de racks procesados.

La sustitución de los disolventes y los reactivos de tinción es aleatorio. No se

sustituyen hasta que la calidad de la tinción disminuye.
 Esta sección muestra una tinción con hematoxilina turbia y de mala calidad. Este
reactivo debe sustituirse inmediatamente.
Paso 57: Hidratar las secciones a fondo

Las preparaciones se hidratan a fondo antes de la tinción con hematoxilina.

La solución de hematoxilina se contamina rápidamente con alcohol y a veces con

xileno. Esto provoca una tinción irregular.

La tinción irregular con hematoxilina visible en la epidermis en esta sección de piel

fue provocada por xileno residual (y restos de parafina) presentes cuando se aplicó
la hematoxilina.
Paso 58: Supervisar la calidad de la hematoxilina
El rendimiento de las soluciones de hematoxilina se supervisa minuciosamente.
Durante su vida útil, las soluciones de hematoxilina se diluyen progresivamente por
el arrastre de preparaciones y racks y también se ven afectadas por la oxidación
continua.

La tinción con hematoxilina es variable de un día a otro y no se intenta entender

por qué. Por ejemplo, la zona de la superficie del baño de tinción, el grado de
aireación durante la tinción y la temperatura ambiente pueden afectar a la
velocidad de oxidación.

Se muestran dos preparaciones del mismo bloque de control. Se tiñeron con H&E
utilizando protocolos idénticos en una estación de tinción automática, pero con un
intervalo de siete días entre ciclos. Incluso macroscópicamente, la variación en el
nivel de tinción es obvia.
Paso 59: Garantizar el “azulado” nuclear completo

Después de la tinción con hematoxilina, siempre se realiza un “azulado” profundo

de los núcleos con el sustituto de agua corriente alcalina de Scott o agua
amoniacal. Este requisito se ve influido por el pH neutro del agua corriente local.

A veces, los núcleos aparecen rosáceos en secciones completadas debido al

“azulado” incompleto en el agua corriente alcalina después de la tinción con
hematoxilina. Los núcleos que están subteñidos con hematoxilina (o
sobrediferenciados) y sobreteñidos con eosina también aparecen de color rosa.
 A. En esta sección, los núcleos epidérmicos están mal definidos y son de color
rosáceo. Esta sección no se ha “azulado” correctamente en agua alcalina después
de la tinción con hematoxilina (piel, H&E). B. Se muestra otra sección que se “azuló”
correctamente después de la tinción nuclear. Aquí los núcleos están mucho mejor
definidos (piel, H&E).
Paso 60: Evitar la tinción irregular con eosina

El “azulado” va seguido de un lavado muy a fondo con agua corriente para eliminar
los álcalis residuales que pueden impedir la tinción con eosina y provocar una
tinción débil e irregular.

El lavado ineficaz después del “azulado” (que deja álcalis residuales) hace que la
tinción con eosina sea débil e irregular.

Esta sección demuestra el efecto de los álcalis residuales en la tinción con eosina.
Observe la naturaleza irregular de la tinción (bazo, H&E).
Paso 61: Supervisar el pH de la eosina

Se supervisa el pH de la solución de eosina. Se mantiene cerca de un pH de 5,0

para mantener una tinción óptima. Se puede añadir un par de gotas de ácido
acético como medio cómodo para reducir el pH.
No se intenta supervisar el pH de la eosina. Cuando disminuye la intensidad de la
tinción, se sustituye la solución (el arrastre de agua corriente alcalina puede hacer
que el pH de las soluciones de eosina aumente).

Sección de pulmón teñida con H&E. La tinción con eosina es uniformemente muy
débil y bastante inaceptable. Tenga en cuenta que los únicos componentes teñidos
con eosina son los glóbulos rojos
Paso 62: Deshidratar completamente antes del aclaramiento y del
montaje

Las secciones se deshidratan completamente antes de colocarlas en xileno para su

limpieza.

Las secciones a veces pasan rápidamente por alcohol hasta xileno. El aclaramiento
con xileno contaminado con agua puede provocar la presencia de pequeñas gotas
de agua en el tejido que se ven microscópicamente como zonas opacas sin
detalles.

Esta sección carece de claridad (parece opaca a simple vista). Un análisis minucioso
revela la presencia de pequeñas gotas de agua.
Paso 63: Evitar el secado y la formación de cristales
El cubreobjetos siempre se aplica antes de que la sección pueda secarse y se debe
utilizar un material de montaje de alta calidad. Las propiedades de almacenamiento
a largo plazo del medio de montaje deben conocerse porque pueden aparecer
cristales en un material de montaje de baja calidad, a veces después de un largo
periodo (meses o años).

Se permite que las secciones se sequen parcialmente antes de aplicar el

cubreobjetos, lo que hace que algunos núcleos aparezcan negros. El medio de
montaje elegido basándose únicamente en el precio puede desarrollar cristales
durante el almacenamiento a largo plazo y los cubreobjetos pueden levantarse.

A. Esta sección se dejó secar parcialmente antes de montar. Esto ha provocado que
queden atrapadas diminutas burbujas de aire sobre algunos núcleos, haciendo que
aparezcan negros (a veces denominados “corn-flaking”). B. Sección con
cubreobjetos teñida con H&E que muestra una multitud de esferocristales
refractarios que se desarrollaron debido a la mala calidad del material de montaje
en los seis meses siguientes al montaje.

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UNA MEJOR HISTOLOGÍA

About the presenters

Cindy Sampias , JD CT(ASCP)HTL

Cindy Sampias is a board certified Cyto- and Histo-technologist. With more than 25
years of experience, she is a guest speaker at histology and cytology meetings
around the country. She is a technical author for Media Lab, publishing a variety of
technical courses and sharing best practices in histology.

Geoffrey Rolls , BAppSc, FAIMS

Geoffrey Rolls is a Histology Consultant with decades of experience in the field. He
is a former Senior Lecturer in histopathology in the Department of Laboratory
Medicine, RMIT University in Melbourne, Australia.

Referencias
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profesionales sanitarios. Este ha sido preparado a partir de la literatura disponible.
Aunque se ha hecho todo lo posible por mostrar la información de forma fiel, Leica
Biosystems no se hace responsable de su exactitud. Este documento no pretende
ser ni debe interpretarse como asesoramiento médico. Para cualquier uso, se
deben consultar las guías de información del producto, los folletos y los manuales
de funcionamiento de los distintos fármacos y dispositivos. Leica Biosystems y los
editores renuncian a cualquier responsabilidad que surja directa o indirectamente
del uso de cualquier fármaco, dispositivo, técnica o procedimiento descrito en este
documento de referencia.