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  • Polisacáridos Antivirales Carragenina

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    Polisacáridos antivirales carragenina

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    Rev Esp Quimioterap, now. 1988; vot (1): 31-36 © LR. Prous, S.A. - Sociedad Expafla de Quimioterapie Original Accién antiviral de polisacaridos M* E. Gonzdlez y L. Carrasco Centro dle Biologia Molecular (CSIC-UAM), Universidad Auténoma, Canto Blanco, 28049 Madrid, RESUMEN {a carrgenina es un poisacérite sulatado muy abundant en alga que present un gran efecto antiviral rete a varios vis animales, incuido Sharpes simples tipo (HSV-1), Ese efecto se observa a concentrociones muy bas, del orden de? ne/nl, ments que d conecniconee ae, 2 auperoes no presenta ees tices: La acin anvil se manta en elas my lepine infeceon vil, de enna ee lone Le replacin de! DNA vel come is iranserictn de genes indies (a), tempranas () 0 tard (y), estén profundamente Bowsers per Carasenina Sin embarg, 1a fjcion y enirada del HSV 1 en la céula no $e iahiben por este polsectido aulatade, Ex més nets ek or en le céuia Incrementa enormemente el paso de pollsecridas al Intrir clu Palabras clave: Actividad antiviral - Polisacéridos - Virus herpes simplex Antiviral Action of Polysaccharides SUMMARY Gartazecra ia sulphaed poyscecharde very abundant i algae tha shows © poten antiviral effect aginst a mumber of onal viruses, including heroes siplex type 1 (SV-1). Ths inhibitory effects observed a concentrations ofcartgecnan as low as 2 uy whence one horn Leu ater concentrations of ts polysaccharide have no one effects dis culture cls. The anil effec ofthis compound is locred ely Sans of nil veplication, since vl DNA replication an ranseription of immediate fa), ery () and lee Cy yomes ae prefredy, Deced bs ‘Grmseinan. However, the atsorotion and entry af HSY 1 into the culture cells are nat inkibted by ts pobsaccharite Moreover the inane tion of labeled potsuccharide into ets i enhanced by vius entry. Key word INTRODUCCION Los polisacéridos son un grupo muy complejo de mo- lculas bioldgicas que tienen un efecto inhibidor sobre va- ros virus animales (1), Desde que se desarrollé el método de placas de lisis para la valoracin de virus animales se fencontté que existian inhibidores del crecimiento viral con- taminando el agar (2). Pronto se vio que estos inki Tes correspondian a polisacéridos sulfatados (3). La he- Darina también resulté ser un inhibidor potente de la re- plicacién de los herpesvirus (4), y se pensé que, debido al cardcter polianiénico de esta molécula, podria interac- clonar con las cargas positivas presentes en la particula viral, y de esta forma inhibirfa la fijacién del virus a la ntiviral activity - Polysaccharides - Herpes simplex virus célula (5). Sin embargo, esta suposicién no es correcta ya ue en nuestro laboratorio hemos encontrado que los vi- rus herpes se siguen fijando a las célufas en presencia de heparina. Es més, la entrada de este compuesto estd entor- ‘memente incrementada por la fijacién y entrada del her- pes simplex tipo I (HSV-1) en células HeLa (6). Bn una biisqueca de compuestos antivirales llevada a cabo en ‘uestro laboratorio encontramos que entre los compues. tos antivirales que presentaban mayor poder inhibidor y ‘menor toxicidad para las células se encontraban determi- nados polisacdridos sulfatados. En este trabajo presenta. ‘mos el mecanismo de accién inhibidor de estos compues- tos frente al HSV-1 32 MEE, Gonzilez y L. Carrasco MATERIALES ¥ METODOS ‘Células y virus Las células HeLa (epiteliales humanas) y Vero (fibro- blastos ce mono) crecieron en medio Eagle modifieado por Dulbecco y suplementado con un 10% de suero de terme- ra recién nacida, 10 UL/ml de penicilina y 50 g/ml de estreptomicina, En las infecciones con el virus herpes sim. plex tipo I (HSV-1) Ia concentracién del suero fue del 2%. Crecimiento y titulacién del virus ara el crecimiento de HSV-1 se infectaron eélulas Ve- ro con 0,1 ufp/ml. Cuando la totalidad de las células es tuvieron infectadas se recogieron las fracciones correspon- dientes al virus intracelular, y virus extracelular, libres de restos celulares. La preparacién viral obtenida se valoré por.el método esténdar de plaqueo, en células Vero (1). Proteccién del efecto citopatico de HSV-1 Se hizo crecer células HeLa en placas multipocillo (con pocitlos de 16 mm de didmetro); cuando Hegaron a con- fluencia se infectaron con el virus a una multiplicidad de infeccion de 0,5 ufp/célula, en 200 xl de medio DMEM.2%% ST. Inmediatamente se afiadié la carrageni- nna (Sigma) y se dejé incubando a 37°C, Cuando toda Ja monocapa celular del control sin tratar estuvo infectada se observ el efecto citopatico (ECP) producido por el vi- ras en la monocapa y [a proteccidn por el antivirésico, con ‘un microscopio invertido de contraste de fase. Como pa- rémetro cuantitativo se empleé la determinacion de la ra- diactividad incorporada en material insofuble en TCA, des- pués de 1 hora de marcaje con 1 4Ci/ml de [*S}-metionina (4100 Ci/mmol, Amersham). Cuantificacién del DNA viral por dot-blot Se infectaron células HeLa con HSV-1 a multiplicidad de infeccidn 30, Después de 1h de adsorcién se retiré el virus y se lavé la monocapa celular con medio de cultivo, A las 16 b.p.i. se recogieron las células y se extrajo el DNA ‘con fenol, segiin ha sido descrito (7). El DNA extraido fue depositado sobre nitrocelulosa en varias diluciones se- riadas y finalmente hibridado con el CDNA de la sonda correspondiente al gen timidina quinasa de HSV-1 (TK). El procedimiento seguido es el de Thomas (8). Cuantificacién del RNA viral por dot-blot Se infectaron células HeLa con HSV-I a multiplicidad de infeceién 30, Después de 1 h de adsorcién se retiré el virus y se lavé la monocapa celular. A las 8 h.p.i. se ex- trajo el RNA citopkismico con fenol, segin el método des- crito por Favaloro y cols. (9). El RNA extraido se deposi- 16 sobre una membrana de celulosa, en concentraciones seriadas, y se hibridé con cDNA sonda de HSV-1, gene- rosamente facilitado por el Dr. E. Tabarés, correspondien- tea los genes «22, BTK y 70. Las condiciones de hibrida- cién fueron las desritas por Thomas (8). Rev Es QuiMlorERAr Obtencién de particulas de HSV-1 ‘mareadas radiactivamente ‘Se obtuvieron particulas de HSV-1 marcadas con (*S]- metionina infectando eélulas Vero con HSV-1 a multipli- cidad de infeccién 10 y afladiendo 5 xCi/ml de FSI- metionina ala 10* hora de infeccién, A las 20 h de infec- cin se recogié el virus, se clarifies y se concentré centri- fugindolo sobre un colchén de sacarosa al 30% (10). Determinacién de Ia entrada de particulas en Ia célula Monocapas confluentes de células HeLa, erecidas en placas Petri de 35 mm de didmetro, fueron infectadas con HSV-1 marcado con ['°S}-metionina e incubadas a 37°C. ‘A distintos tiempos se retiré el medio con el virus y se la- v6 la monocapa celular con PBS. Seguidamente se traté con PBS-proteinasa K $0 g/ml durante 15 minutos y a 4°C. Se recogieron las células, se lavaron con PBS y el precipitado se trato con TCA 5%. La radiactividad rete- nida en filtros GE/C se cuantified en un contador de cen- telleo LKB Rackbeta. les Determinacién dela entrada de [*H}-neparina en la célula CCélulas HeLa crecidas en placa multipocillo fueron in- fectadas con 100 ufp/célula de HSV-1. Después de I h de adsorcién a 4°C se afiadié 1,5 aCi/ml de PH]-heparina (0,34 mCi/mg, New England Research). A distintos tiem- pos de incubacién se lavé a monocapa celular con PBS. yy se determiné la radiactividad insoluble en TCA. RESULTADOS Proteccién del efecto citopitico de HSV-1 En ensayos de actividad antiviral llevados a cabo por nuestro grupo (11) destacé la carragenina por st fuerte actividad antiherpética. La Fig. 1 muestra el efecto pro- tector de la carragenina en Ia infeccién de células HeLa por el virus HSV-1. Tan slo 2 ug/ml de carragenina pro- tegen al S0% de las eétulas del efecto citopstico produc do por el virus. La carragenina, a concentracin de 10 ng/ml, bloquea totalmente la replicacién viral permitien- cdo que los niveles de sintesis de proteinas en células infec- tadas a baja multiplicidad de infeccién scan semejantes 2 los niveles de sintesis en eélulas control no infectadas. Otros ensayos realizados con concentraciones mayores de carragenina (1) mostraron que incluso 200 ug/ml de ca- rragenina no presentan ningiin efecto toxico para la mo- rnocapa celular y por tanto el indice antiviral de la carra- genina es superior a 100. Efecto en la replicacién del DNA viral El aislamiento del DNA de células infectadas con HSV-1 en presencia de concentraciones crecientes de carragenina yy su posterior hibridacién con una sonda cDNA de HSV-1 evidencia que la sintesis de DNA viral también es afecta- da por la carragenina, En la Fig. 2 se observa la ausencia ascis yale tula Line h de rina iem- PBS por verte pro ela pro- duci- ie 10 tien nfec- antes adas. es de le ca 4 mo" cara iSV-1 senina 1SV-1 ectar sencia 1988; Vou. 1, 1 is de proteinas (4) & Carragenina [ug/ml] Fig. 1. Proteccién del efecto citopttico (BCP) de HSV-1 El efecto etopético inducido pore virus (dt fe valoda al mispos-

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