LABORATORIO DE MICROBIOLOGA MDICA REPORTE DE PRCTICAS # 3

Materia: Microbiologa Mdica Profesor: Q.F.B Marco Antonio Hernndez Jara Alumno: Erika R. Zazueta Len Carrera: Qumico Farmacutico Bilogo Grado: 9 Sem.

Instituto de Ciencias y Estudios Superiores de Tamaulipas, A.C

03 de noviembre de 2011, Tampico Tamaulipas

PRCTICA # 3 DETERMINACIN DE BACILOS NO FERMENTADORES Objetivos

Al alumno se le entregar una muestra problema de bacilos no fermentadores para identificar a al microorganismo presente mediante pruebas bioqumicas (TSI).

Introduccin
Generalidades Al grupo de bacilos gram negativos no fermentadores pertenecen bacterias taxonmicamente muy diversas, pero esta agrupacin es til para la clasificacin en el diagnstico clnico. Muchas de estas especies son incapaces de acidificar medios como el TSI y crecen considerablemente mejor en condiciones aerobias que en condiciones anaerbicas. Incluso se encuentran algunas cepas que son incapaces de crecer anaerbicamente.

Este grupo de bacterias se consideran como patgenos oportunistas, especialmente de infecciones intrahospitalarias, donde los principales factores de riesgo para los pacientes son tratamientos con antimicrobianos y/o ciruga, instrumentacin y permanencia del paciente en salas de cuidados intensivos por perodos prolongados. Adicionalmente, es importante considerar la resistencia natural a los antibiticos que muchas de estas bacterias presentan y la facilidad con la que adquieren resistencia a otros antibiticos.

A las pruebas de escrutinio que se utilizan para su identificacin como morfologa microscpica, oxidasa, movilidad, produccin de indol y acidificacin de carbohidratos, se le han agregado pruebas como el crecimiento a temperatura ambiente y crecimiento en medios selectivos como el agar MacConkey. Algunas cepas solamente crecen a temperatura ambiente y son incapaces de crecer en agar MacConkey. En este grupo se encuentran gneros como Acinetobacter, Moraxella, Eikenella, Flavobacterium, Alcaligenes (Achromobacter), Actinobacillus, Capnocytophaga, Cardiobacterium, Stenotrophomonas y Kingella, entre otras de menor importancia mdica.

Pseudomonas aeruginosa es la especie ms frecuentemente aislada del grupo de bacilos Gramnegativos no fermentadores, seguida de Acinetobacter spp. y Stenotrophomonas maltophilia. Estos

dos ltimos agentes se caracterizan por producir infecciones intrahospitalarias y en su gran mayora se asocian al uso de respiradores o al implante de catteres. Como una caracterstica importante, estos dos agentes presentan una elevada resistencia natural a los antibiticos y son capaces de adquirir resistencia contra otros antibiticos con facilidad. Por lo anterior, estos agentes son importantes en el ambiente hospitalario y son cada vez ms frecuentes los aislamientos de estas bacterias produciendo infecciones severas.

La especie Stenotrophomonas maltophilia ha sufrido una serie de cambios taxonmicos. Inicialmente, fue clasificada como Pseudomonas maltophilia, luego se reclasific en el gnero Xanthomonas y hasta aos recientes que se le asign a un nuevo gnero denominado Stenotrophomonas.

Esta bacteria es un bacilo no fermentador, que produce colonias en agar sangre de tono amarillento, crema claro o verde lavanda, opacas y con un fuerte olor amoniacal. Si se crece en agar nutritivo, sus colonias presentan una coloracin amarillenta, con un pigmento soluble en agua pero que no difunde al agar. Esta especie es mvil, utiliza la maltosa, es oxidasa negativo y ONPG positiva. S. maltophilia se asocia como agente de neumonas primarias e infecciones nosocomiales como septicemias, infecciones urinarias, bronconeumonas por aspiracin, infecciones de heridas, mastoiditis y ectima gangrenoso. Es importante en infecciones de pacientes con cncer.

Las especies de Acinetobacter se caracterizan por ser bacilos pequeos o bien cocobacilos, son no mviles, oxidasa negativa y pueden tener una morfologa en pares (diplococo). Sus colonias en agar sangre no son caractersticos (producen colonias planas, opacas y pequeas), crecen bien en agar MacConkey, pero con colonias de pequeo tamao, incoloras o bien escasamente pigmentadas de rosado. En infecciones vaginales, es importante descartar la presencia de Acinetobacter spp. ya que puede presentar una morfologa semejante Neisseria gonorrhoeae. La diferenciacin se puede hacer mediante la prueba de crecimiento en agar MacConkey y la prueba de citocromo C oxidasa. A diferencia de Acinetobacter spp, Neisseria gonorrhoeae no crece en MacConkey y es oxidasa positivo. Las especies de Acinetobacter estn ampliamente distribuidas en la naturaleza tanto en ambientes hmedos como en superficies secas y pueden ser parte de la flora normal de la piel y mucosas de los seres humanos. Las especies ms frecuentes aisladas son A.baumannii, A. iwoffi, A. haemolyticus, y A. johnsonii.

Otros bacilos gram negativos no fermentadores tienen bajos porcentajes de aislamiento en muestras clnicas, por lo que su importancia es mucho menor. Sin embargo tienen caractersticas epidemiolgicas y reacciones bioqumicas semejantes a los dos agentes indicados anteriormente. Todos los bacilos Gram negativos no fermentadores presentan una amplia resistencia a los antimicrobianos, son organismos que causan infecciones intrahospitalarias y tienen su origen en ambientes acuticos.

Las especies de Moraxella son cocobacilos oxidasa positiva, no mviles y se presentan como asacaroltico porque es inerte a los carbohidratos. Estas especies pueden encontrarse como flora normal de piel y mucosas. Se ha demostrado que por lo menos Moraxella osloensis, M. liquefaciens y M. lincolnii son flora normal de vas respiratorias humanas, aunque rara vez se encuentran produciendo bacteremia, endocarditis, conjuntivitis y meningitis. Moraxella catarralis es frecuente en infecciones ticas en nios. Oligella spp. son un grupo de cocobacilos, siendo las especies ms importantes de este grupo Oligella urethralis y Oligella ureolytica, que se han encontrado produciendo infecciones urinarias. Eikenella spp. son tambin flora normal gingival e intestinal. La especie ms importante es Eikenella corrodens, un bacilo Gram negativo oxidada positivo, se ha encontrado produciendo infecciones locales por mordeduras humanas.

La especie Chryseobacterium (Flavobacterium) meningosepticum es una bacteria no mvil, oxidasa positiva que produce un pigmento amarillo. Es un agente causante de meningitis y sepsis neonatal, aunque es muy raro encontrar esta especie en infecciones de adultos. Esta especie coloniza vas respiratorias, por lo que es frecuente encontrarlo en aislamientos de muestras clnicas humanas. Las especies de Alcaligenes son bacilos mviles por flagelos peritricos que estn bioqumica y filogenticamente muy relacionados con Bordetella. Al cultivarlas, las colonias presentan olor a frutas y produce un color verdoso en el agar sangre. Se encuentran frecuentemente contaminando nebulizadores y respiradores. Las especies ms importantes en muestras clnicas son A. faecalis, A. piechaudii, A. xylosoxidans subsp. denitrificans y A. xylsoxidans subsp. xylosoxidans.

Otros grupos menos frecuentes incluyen Actinobacillus actinomycetemcomitans, un cocobacilo involucrado en enfermedad periodontal y Capnocytophaga, bacilos fusiformes filamentosos de la flora normal de boca, aunque C. gingivalis produce enfermedad periodontal en humanos y C. canimorsis es flora normal de perros por lo que se encuentra produciendo infecciones en heridas por mordeduras de perros.

Adicionalmente se incluyen en este heterogneo grupo de bacterias a Cardiobacterium hominis, un bacilo pleomrfico causante de endocarditis que crecen lentamente en agar sangre, por lo que se debe incubar el medio por dos o tres semanas. Chromobacterium violaceum es una bacteria muy similar a Pseudomonas pero se diferencia por producir un pigmento violeta. Esta especie produce abscesos y diarrea y las infecciones con esta bacteria, aunque infrecuentes, tienen una alta tasa de mortalidad.

2. Clasificacin de los diferentes gneros y especies de bacilos Gram negativos, no fermentadores, distintos a Pseudomonas y Burkholderia

A continuacin se brindan una serie de cuadros que pueden ser utilizados como una gua para la identificacin de bacilos Gram negativos, no fermentadores, diferentes a Pseudomonas y Burkholderia. Ntese que se utilizan las mismas pruebas bioqumicas para la identificacin de este grupo-. El cuadro 1 puede ser utilizado para la orientacin inicial en la identificacin. Mientras que los cuadros 2-7 se utilizan en la identificacin final a nivel de especie.

Cuadro 1. Esquema para la identificacin de bacilos Gram-negativos no fermentadores diferentes a Pseudomonas y Burkholderia.

Material y Equipo
2 Asas de Platino 1:1000 1 mechero de Fisher 1 manguera Laminillas Cuba de tincin con varillas de vidrio Papel Estraza 1 Gradilla de plstico Material para preparar medios

Materiales biolgicos y reactivos

Muestra problema de bacilos no fermentadores proporcionados por el profesor. Pruebas Bioqumicas Agar TSI SIM MIO UREA

Procedimiento Seguido

Realizar la lectura del TSI. Realizar la prueba de la catalasa Realizar la lectura del resto de las pruebas bioqumicas.

Observaciones

En esta imagen se observa la muestra problema que nos proporcion el titular de la materia: una muestra recolectada de medio ambiente en un medio de cultivo de Mc Conkey.

Aqu se aprecian los resultados de las pruebas Bioqumicas inoculadas a partir de la muestra anteriormente descrita. Primer tubo - Medio TSI: El medio permaneci de color naranja, lo cual nos indica que no hubo fermentacin de carbohidratos por parte de la bacteria. Segundo tubo Medio SIM: No hubo cambio completo de la coloracin del medio, ste permaneci en su mayora con su caracterstica coloracin verde. Tercer tubo Medio MIO: No hubo movilidad, ya que no se apreci turbidez, la prueba de Indol result negativa como se mostrar en imgenes posteriores y no hubo produccin de Ornitina ya que no se apreci un vire en la coloracin del medio. Cuarto tubo: Medio Urea: No se observ cambio o vire en la coloracin del medio

Primera imagen: Aqu se aprecia la prueba de Indol que se le realiz a la muestra inoculada, con el reactivo de Kovacs el cual result negativo al no observar ningn aro rojizo en el medio. Segunda imagen: Podemos observar claramente una coloracin negra sobre el sensidisco impregnado con el reactivo de oxidasa, lo cual hace como positiva la prueba. Tercera imagen: No se logr apreciar la formacin de burbujas con la prueba de catalasa, la solucin permaneci completamente homognea y sin cambios aparentes al agregar un poco de muestra del medio de Mc Conkey.

Resultados

PRUEBA BIOQUMICA TSI SIM MIO UREA CATALASA OXIDASA

Resultado Negativo Negativo Negativo Negativo Negativo Positivo

Probable bacteria identificada: Moraxella s.p.p.

Conclusiones
El titular de la materia nos proporcion una muestra de medio ambiente inoculada en medio Mc Conkey, a la cual se le realizaron las respectivas pruebas bioqumicas, en las cuales sali negativa en todas a excepcin de la prueba con oxidasa en la cual sali positivo. Al observar las caractersticas de los bacilos no fermentadores pensamos en 2 principales bacterias sospechosas: Acinetobacter s.p.p y Moraxella s.p.p, ya que ambas crecen en Medio de McConkey y son negativas en la mayora de las pruebas bioqumicas y son no mviles, la gran diferencia es que Acinetobacter s.p.p es Ureasa positiva y segn nuestra prueba bioqumica nuestra ureasa result negativa lo cual descarta a Acinetobacter s.p.p y confirma la presencia de Moraxella s.p.p en el medio proporcionado por el titular de la materia.

Cuestionario
1. Cules son las principales diferencias fenotpicas entre las especies de Pseudomonas, Burkholderia estudiadas en la prctica anterior y los otros gneros de bacilos Gram negativos no fermentadores estudiados en esta prctica? R = Pseudomonas y Burkholderia son en general catalasa y oxidasa positivos, son bacilos rectos o ligeramente curvos, son aerobios estrictos, no forman esporas y no son mviles, son no fermentadores, inertes a los carbohidratos. En cambio otros bacilos negativos no fermentadores son incapaces de acidificar TSI, son bacilos pequeos o cocobacilos, pueden ser oxidasa positiva o negativa, pueden ser mviles o no mviles. 2. Por qu algunos de los bacilos Gram-negativos no fermentadores, a pesar de tener estructura de Gram-negativo, no crecen en agar MacConkey? R= Porque no fermentan la lactosa que es el carbohidrato principal del medio de Mac Conkey.

3. Por qu algunos de los bacilos Gram-negativos no fermentadores, a pesar de tener metabolismo aerbico, no producen la enzima citocromo C oxidasa? R = La citocromo C oxidasa, es una enzima esencial que permite a los organismos emplear oxgeno en la generacin de energa y que es el compuesto final de la cadena de transporte de electrones, sin embargo existen bacterias que no utilizan el oxgeno en la cadena de transporte de electrones y por lo tanto dan negativa esta prueba. La presencia de citocromo C oxidasa en la cadena de trasporte de e- puede detectarse utilizando un aceptor de e- artificial p-fenilendiamina. Esto se usa para diferenciar pseudomonas (positivo) de enterobacterias (negativo).

4. Explique la importancia clnica del aislamiento e identificacin de este grupo de bacilos Gram-negativos no fermentadores en un laboratorio de bacteriologa clnica. R = Es muy importante ya que estos se caracterizan por producir infecciones intrahospitalarias y en su gran mayora se asocian al uso de respiradores o al implante de catteres y presentan una elevada resistencia natural a los antibiticos.

Bibliografa
Bacteriologa diagnstica de Norman Rojas , Esteban Chaves y Fernando Garca, edicin 2006. Manual de teora y prcticas de laboratorio bacteriologa mdica