( POSGRADO EN

~. ) CIENCIAS
CICY ( BIOLÓGICAS

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.

Posgrado en Ciencias Biológicas

COMPARACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE GENES EN

CEPAS DE Mycosphaerella fijiensis AISLADAS DE
PLANTACIONES DE BANANO CON Y SIN MANEJO
DE FUNGICIDAS

Tesis que presenta

YAMILYYAZMIN BURGOS CANUL

En opción al título de

MAESTRO EN CIENCIAS

(Ciencias biológicas: Opción Biotecnología)

Mérida, Yucatán, México

Julio, 2013
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.BECONOCIMIENTO
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) CIENCIAS
( BIOLÓGICAS
Por medio de la presente, hago constar que
el trabajo de tesis titulado "Comparación de la expresión de genes en cepas de
l'!!J!cosphaerella {ijiensis aisladas de plantaciones de banano con y sin manejo de
fm tgícidas" fue realizado en los laboratorios de la Unidad de
Biotecnología del Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
··- .. '
bajo la dirección _de la Dra. Blondy Beatdz Canto .Canché, dentro de la
Opción de Biotecnología de plantas, perteneciente al Programa de
Posgrado en Ciencias Biológicas de este Centro.

Atentamente,

Dr.
Docencia
Centro de Investigación Científica de Yucatán, AC.
Mérida, Yucatán, México a de 2013

¡¡¡
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD

Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos

Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de
Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en
contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados,
dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la
Propiedad Industrial, le pertenece patrimonialmente a dicho Centro de Investigación.
Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado, reconozco que de igual manera los
productos intelectuales o desarrollos tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo
correspondiente a dicha información, le pertenecen patrimonialmente al Centro de
Investigación Científica, A.C., y en el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este
trabajo productos intelectuales o desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se
regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley
de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo expuesto en la presente Declaración.

V
AGRADECIMIENTOS
...'·
Al CE:intro de Investigación Científica de Yucatán (CICY) y a la Unidad de
'
Biótecnologíá por las instalaciones prestadas durante mi estancia para el desarrollo de
te~is de mae~tría.
,~ '
Al CONACyT por la beca otorgada , con número de registro 25t427, para cbntinuar
mis estudios y al proyecto titulado "Programa Integral para el manejo deÍ cultivo de
plátano impulsando las buenas practicas de campo e inocuidad, basados en la
investigación y aplicación de herramientas biotecnológicas (FORDECYT 116886) bajo la
dirección de la Dra. Blondy Canto Canché.

A la Dra. Blondy Canto Canché, por ser mi asesora de tesis y permitirme ser
parte de su grupo de trabajo. Por su paciencia , disposición , sugerencias, consejos y
conocimiento transmitido, durante la maestría.

A mi comité tutorial conformado por la Dra. Blondy Canto Canché, el Dr. Ignacio
Islas Flores, la Dra. Cecilia Rodríquez García y al Dr. Jairo Cristóbal Alejo, por su
disposición, tiempo y recomendaciones para mejorar el trabajo de tesis desarrollado.

A mis revisores de tesis, Dra. Blondy Canto Canché , Dr. Ignacio Islas Flores, Dra.
Cecilia Rodríquez García, Dr. Luis Sáenz Carbonell y el Dr. Jairo Cristóbal Alejo , por
sus comentarios, recomendaciones y por dedicar su tiempo a la revisión de este trabajo.

Al Instituto Tecnológico de Conkal , al Dr. Jairo Cristóbal Alejo y al Dr. Eduardo

Villanueva, por el espacio en el invernadero prestado.

Al Dr. Roberto Vázquez Euán, por su apoyo técnico en PCR tiempo real.

Al M.C. Miguel Tzec Simá por el apoyo técnico en diversos aspectos del
laboratorio.

A la Dra. Rosa M. Escobedo Gracia Medrano y su estudiante el IBT. Carlos l. Cruz

Cárdenas , por el apoyo y asesoramiento en los programas estadísticos.

vii
 Al Dr. Andrew James, por los datos proporcionados de la cepa C1233.

A la Q.F.B. Rosa Grijalva Arango, por proporcionarme las plantas de

invernadero para realizar los experimentos en este trabajo.

A la M.C Leticia Peraza Echeverría, por el asesoramiento técnico y material

vegetal infectado proporcionado.

A la Dra. Nuvia Kantún Moreno por el asesoramiento estadístico, sugerencias y

consejos técnicos.

Al grupo de trabajo del laboratorio de la Dra. Blondy Canto Canché conformado

por Dr. Roberto Vázquez, Dra. Yeny Couoh , Dra. Resalía Núñez, Dra. Nuvia Kantún , M.C
Bartolome Chi , M.C Miguel Tzec y los estudiantes Abraham , Miguel, Inés, loreni, Efrén y
Sergio. Que alegraron mi estancia en el laboratorio, por ayudarme a crecer
académicamente y como persona , por sus recomendaciones y tips , durante los
seminarios y experimentos , por su amistad , apoyo y comprensión .

También a José Antonio , Eduardo y Muhilan por su agradable convivencia y a

todos mis compañeros de esta institución , por todo el apoyo brindado y experiencias
compartidas .

A mis amigos que a pesar de la distancia siempre estuvieron al pendiente y

apoyándome en las buenas y en las malas. A mis nuevos amigos por su solidaridad y por
todos los momentos agradables que pasamos juntos, desde que iniciamos la Maestría,
gracias por su valiosa amistad .

A la familia Enríquez Valencia por todo su apoyo incondicial y consejos brindados,

para continuar creciendo y por ser parte de mi familia durante estos 6 aRos , les agradezco
todo su amor y cariño .

viii
 Al Ingeniero Bioqu ímico Adrián José Enríquez Valencia, por haber estado siempre
a mi lado compartiendo ilusiones, metas , desafíos, sueños , paciencia, momentos difíciles
y alegres, por su confianza y amor brindado durante todo este recorrido , MUCHISIMAS
GRACIAS amor por ser mi amigo, compañero e impulsarme a mejorar cada día, por
permitirme compartir parte de tu tiempo todos estos años.

A mis padres (Ruben y Rafaela ) y hermanas (Wigelmi y Lupita) , por su confianza ,

comprensión , apoyo, motivación , consejos y valores, que me han permitido alcanzar todas
mis metas, a mejorar y seguir adelante a pesar de los tropiezos y por todo su amor y
apoyo en toda mi vida , los amo. De manera muy especial a Dios, por brindarme a mi
familia , el amor y gozar de salud , así como todo lo necesario para finalizar esta etapa de
mi vida , por todas las personas que puso en mi camino para ser posible cada uno de los
logros obtenidos. Gracias.

ix
X
DEDICATORIA

A Dios, por brindarme la salud para concluir esta etapa de mi vida y colocar a las
personas exactas en el momento preciso, por la fortaleza y sabiduría durante mí recorr;,.¡,....
por la vida .

De manera muy especial dedico este logro a mi familia , que con su esfuerzo,
templanza y amor hicieron posible que pudiera continuar mi caminar. Gracias por estar a
mi lado siempre y cada segundo para que pueda concluir con la tesis, los amos y muchas
gracias por ser mi familia.

xi
xii
 Índice

INDICE GENERAL

IN DICE GENERAL .......................•......................................................................... ...... ......•.................. XIII

ABREVIATURAS .............................•.......................••..... •.•. .•.• •...•......................................................... XVI

ÍNDICE DE FIGURAS ...................•... •...•................................................•............................................... XXI

ÍNDICE DE CUADROS .............................................•......•.............. .• ....•.............••.......•....•......•.•..•...... XXIII

RESUMEN ......................................................................................................................... ..................... 1

INTRODUCCIÓN .............................................................. ....................................................................... 5

CAPÍTULO 1•••••••••••••• •••••••••••••••••••••••••••••• •••••••••••••••••••• ••••••••••••••••• ••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••••• ••• ••• •••• •••••• •7

1.- ANTECEDENTES ............................. •...... ................................................................ •.•..••.. •................... 7

1.1.-Distribución del género musa ........ .... ............ .. ...... .... ....... ...... ... ..... .. ... ...... .... ....... ...... .... .... 7
1.1.1.- Importancia del banano .............. ........ .................. .. ...... .. .. .. .... .. .... .. ............................ 8
1.1.2.- Clasificación de los bananos y plátanos .... .... ........................ .. .... .. ............ .. .......... .... 8
1.1.3.- Descripción del banano ................................ .. .......... .. .......... .... .. ........ .... .. ...... .... ........ 9
1.1.4.- Producción de banano ...... .. ...... .. ........ .. ...... .... .. .. .. .. .. ... ...... .. .. ...... .. ............ .......... .. .. 1O
1.1.5.- Amenazas al cultivo de banano .... ........ ...... .. ............................ .. .. .. .... .................. .. . 11
1.2.- MYCOSPHAERELLA SPP .................................. .............................................................................. 12

1.2.1.- Distribución del género Mycosphaerella; un hongo patógeno del banano . ...... .... ...... . 12
1.2.2.- Distribución de Mycosphaere/la fijiensis .............. .. .. .. ....... .. .. ............. .. .. .. .. ... ........ .. . 13
1.2.3.- Síndrome de la Sigatoka negra ...................... ........ .... .... .... .. .. .. .... .... .. .. .... .. .. .... ...... . 14
1.2.4.- Reproducción de Mycosphaerella fijiensis ...... ..... .. .. .... ...... ........ .......... .......... .. .. ... .. . 15
1.2.5.- Ciclo de infección de Mycosphaerella fijiensis ................ .. ...... ........... .. .................... 17
1.2.6.- Ensayos de infección con Mycosphaerella fijiensis .................. .. ........... .... .. ...... .. .. .. 19
1.2.7.- Manejo integral para combatir a la Sigatoka negra .. .... .... .... .. .. ........ .... .... ........ .. ..... 20
1.2.8.- Control químico ........ .. ..... .............. .. .... ...... ........... .... .. .. .. .. .. ........ .............................. 21
1.3.- VARIABILIDAD GENÉTICA DE Mycosphaerella fijiensis ..................................... ............................ 24

1.4.- VIRULENCIA DE PATÓGENOS Y FUNGICIDAS ... ............................................................................. 25

1.5.- INTERACCIÓN PLANTA-PATÓGENO ................ ... ........ ................................................................... 26

1.5.1.- Estrategias de colonización de los patógenos .. ...................... .. ............. .. .. ...... .......... .. 27

1.5.2.- Efectores ..... ............. ....... ..... ...... .. ........... ... ....... ........ .... ........ ... ... .... .. ....... ....... .. ...... ... .. 30
1.6.-IMPORTANCIA DE LOS GENESAVR4 Y ATR4 ........................................................................... ...... 32

1.6.1 .- Selección de genes marcadores para estudiar el proceso infectivo de M. fijiesis .. .. ... 34
l . 7 .-JUSTIFICACIÓN ............................................................... ............................................................... 34

1.8.- HIPÓTESIS .................................................................................................................................... 35

1.9.- OBJETIVO GENERAL ............... ....... ............. .................................................................................. 35

1.9.1 .- Objetivos específicos ... ... ......... .................... ................ .. .. ...... ... ........................ ........... 35
1.9.2.- Diseño experimental ............. .. .... .. .... .. ........ .... ...... .. .............. .. .. .. .............. .. ........ ...... ... 37
1.9.3 .- Bibliografía ... ........ ........ .... ..... .. ...... ... ..... ............ ....... ......... ... .... .. .. ... .. ... ..... ... .. ... ..... ...... 39

xiii
 Índice

CAPÍTULO 11 .................................................................................. ........................................................ 49

2.- DETERMINACIÓN DE LA VIRULENCIA .............................................................................................. 49

2.1.-lntroducción .. ... .. .. ............. ........ ... ........ ..... ................... ....... ....... ....... .. .... ... .. .................... . 49
2.2.- MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................................................ S2

2.2.1.-Reaislamiento de cepas de M. fijiensis a partir de fragmentos foliares de banano

infectados in vitro (recuperación de cepas siguiendo el postulado de koch) .. ........ ... ....... .. .... 53
2.3.- METODOLOGÍA PARA EL PROCESO DE INFECCIÓN IN VITRO DE FRAGMENTOS FOLIARES DE BANANO
............................................................................................................................................................ S3

2.3 .1.- Propagación de las cepas de M. fijiensis ......... .. .. .... .. ........................ .. ...... ..... .. .. ......... 53
2.3 .2.-Conservación del micelio de M. fijiensis en glicerol ......................................... .. ....... 54
2.3 .3.-Siembra de Mycosphaerella fijiensis en medio v8 para esporulación .................... .. 54
2.3.4.- Cosecha de esporas asexuales .. .. .. .. .. ....... ........................ .................... .. .. .. .... .. .... .. 54
2.3.5.- Conteo de esporas asexuales ..... .. .... .......... ........... ........ ..... ... .. ..... .... .... ................. .. 54
2.3.6.- Determinación de contaminación bacteriana ...... .................. ..... .......... .............. ...... 55
2.4.- VERIFICACIÓN DE IDENTIDAD DE LAS CEPAS ................................................................................ SS

2.S.- PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE SOPORTE PARA LOS FRAGMENTOS FOLIARES DE BANANO ... SS

2.5.1.- Fragmentos foliares ...... .. .... ..... ........ .. .... ... .... .. ....................................... ... .. .... ......... 56
2.5.2.- Infección artificial de los fragmentos con esporas asexuales de M. fijiensis .... .. ..... 56
2.5.3.- Tiempo de muestreo ....... ...... .. .. .......... ........ ....... ... .. .. ..... .. .......... .............. .. ........... .. . 56
2.6.- RESULTADOS ................................................................................................................................ S6

2.7.- DISCUSIÓN ............. ..................................................................................................................... 63

2.8.- BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 67

CAPÍTULO 111 ...................................................................................................................... ................... 71

EXPRESIÓN DE GENES AVR4 Y ATR4 EN CEPAS DE MYCOSPHAERELLA/ijiensis ..................................... 71

3.- EXPRESIÓN DE GENES DE M. F/J/ENS/5 POR PCR EN TIEMPO REAL .................................................. 71

3.1.- Introducción ... .... .. ...... .... ... ..... .......... .... ... .............. .... .... ...... ... ... ... .................... .... ............ 71
3.2.- Tipos de cuantificación en la qRT -PCR ... ............ .... ...... .. ... .. .. ..... ................ .. ... .. .. ...... .... 73
3.3 .-Materiales y métodos ......... ... .. ....... .. .. ....... ... .. ... ... .... .. .. .......... .. ........ ... ..... ... .. ....... .. ...... .... 75
3.3.1- Extracción de ARN .............. .... .. .. ................... .. ........ ...... .. ............ ...... .......... .. ...... ..... 75
3.2.2.- Extracción de ARN de micelio .. .............. ....... .. ... .. .. .. .... .. ............... ...... .... .. ............. .. 76
3.2.4.- Digestión del ARN .... ........ ....... .... ........ ... .... .............. ... ............................. .. .. .. .......... 76
3.4.- RESULTADOS ................................................................................................................................ 77

3.S.- DISCUSIÓN ................................................ .............................................................................. ..... 87

3.6.- BIBLIOGRAFÍA .............................................................................................................................. 91

CAPÍTULO IV ... ..................................................................................................................................... 94

EXISTENCIA DE ALELOS DEL EFECTOR AVR4 .............................................................................. ........... 9S

4.- PRESENCIA DE VARIANTES ALÉLICAS EN M. fijiensis ......... .. ............................................................. 9S

4.1.- Introducción .... ... .... .. ....... .. ..... .......... ... .. .. .. ............ .... ....... ........ ..... ........ .... ........ .... .. ... ... ... 95
4.2 .- Detección de polimorfismo en Avr4 .. ... .. .. ................... ...... .. ...... .... .. .. .. .... ............. ........... 96

xiv
 Índice

4.2.1.- Material biológ ico y extracción de ADN genómico ... ... ............... .... .. ....... ....... .......... 96
4.3.- Análisis de las secuencias ..... .. ....... ... ............. ...... ... .. ...... .. ............................... ..... ... ...... 96
4.4.- Resultados .. ................. ... ........................... ... .......... .... ............... ... ... ....... ............... .. .. ... .. 97
4.5.- Discusión ...... .... ........... ... ... ... .......... .. ........ .. .. .. .. ................... ... ....... ..... ................... ... ..... 101
4.6.- Bibliografía .......... ... ... ......... ............. ..... ... ... .... .... ... ... .............. .... ..... ... .... .. ..... .. ..... ......... 103
CAPÍTULO V ................................................................... ............................. ....................................... 105

5. DISCUSIÓN GENERAL ..................................................................................................................... 105

5.1.- Conclusiones generales ................................ .. .............................................................. 11 O

5.2.- Perspectivas ........ .. .......................... ... ... ..... ... .. .......... ... ........ ... ..... .. ......... ........ ....... ... .... 113
5.3.- Bibliografia general ...... ...... .............. .. ...... ............ ............ .............. .. ............................. 114

XV
 Abreviaturas

Abreviaturas
!JI microlitros

A+A Agar Agar

A+ A-H Agar agar sin hongo

A+B Agar más bencimidazol

A+B-H Agar más bencimidazol sin hongo

ABC Casete de unión a ATP

ALB Alternaría leaf blight =Tizón foliar causado por Alternaría

APs Anilinopirimidinas

ATP Adenosina trifosfato

BAS Proteínas secretadas asociadas a biotrofia

BCMs Bencimidazoles

BLSD Black leaf streak disease = Enfermedad de la raya negra de la hoja

ce Centímetro cúbico

eva Medio sólido Va

ECP Proteínas extracelulares

ETI Inmunidad disparada por efectores

ETS Susceptibilidad disparada por efectores

EV8 Medio de esporulación va

FAO Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la

Agricultura

xvii
 Abreviaturas

Abreviaturas

FRAC Comité de Acción Contra la Resistencia a Fungicidas

h Horas

Peróxido de hidrogeno

HR Respuesta hipersensible

Kg Kilogramo

LB Luria Broth =Medio de cultivo Luria- Bertani

Lt Litro

M Musa

Me Células del mesófilo

MOR Resistencia a mutiples drogas

Milímetro cuadrado

PAMPs Patrones moleculares asociado a los patógenos

PDA Agar papa dextrosa

PDB Caldo de papa dextrosa

ppm Partes por millón

PRRs Receptores de reconocimiento a PAMPs

PRs Relacionada a patogénesis

PTI Inmunidad disparada por PAMP

PCR Reacción en cadena de la polimerasa

xviii
 Abreviaturas

Abreviaturas

Qol lnhibidores de quinona

qRT Tiempo real cuantitativa

RFLPs Restriction Fragment Length Polymorphisms

ROS Especies reactivas de oxígeno

rpm Revoluciones por minuto

SAR Resistencia sistémica adquirida

se Cavidad subestomática

SLP1 Proteina 1 LysM secretada

SN Sigatoka negra

Spp Subespecies

st Estoma

T Tiempo

TMD Dominio transmembranal

Ton Toneladas

vs Versus

xix
 Índice

Índice de figuras

Figura 1.- Distribución del género Musa ..... ....... .............. ... ...................................... ... ... ..... .. ..... . 7
Figura 2.- Partes que conforman la planta de banano ................................................................. 9
Figura 3.- Distribución de la Sigatoka negra , en el mundo .......... .............................................. 13
Figura 4.- Estructura reproductiva de Mycosphaerel/a fijiensis en su estado anamorfo ........... 16
Figura 5.- Estructuras de M. fijiensis . ... .... ....................................................... .. .. ... .... .. .. .. ..... .... . 18
Figura 6.- Ciclo de infección de Mycosphaerella fijiensis ........................................................... 19
Figura 7.- Clases de fungicidas que inhiben diferentes componentes celulares ....................... 22
Figura 8.- Modelo zigzag , ilustra el sistema inmune de la planta .............................................. 28
Figura 9.- Morfología fenotípica de las cepas de Mycosphaerella fijiensis crecidas en medio CV8 y
recuperadas mediante el postulado de Koch ............. ......................................................... 57
Figura 10.- Cepas de Mycosphaerella fijiensis , inoculadas en medio PDB ...... .... .. .... ..... ... ....... 58
Figura 11.- Confirmación por PCR de la identidad de las cepas reaisladas de hojas de banano
infectadas in vitro. Todas dieron positivo a M. fijiensis ......... ..... .... .... ........... .. .... ... .. ...... ..... 59
Figura 12.- Fragmentos del cv E. gigante infectados, con la cepa M. fijiensis Jaguar C3 ........ 60
Figura 13.- Fragmentos del cv E. gigante infectados, con la cepa M. fijiensis C1233 ............ ... 62
Figura 14.- Marcadores de PCR en tiempo real. ........................................................................ 72
Figura 15.- ARN obtenido de fragmentos cv Calcuta IV y E. gigante infectados con cepas de M.
fijiensis ..... .. ... ......... ...... .......... ................. .. ..... ......... ... ........... .. ........................................... .. 77
Figura 16.- Prueba de digestión del ADNg en las muestras de ARN ......................... .. .... ... ...... 78
Figura 17.- Evauación de la digestión de las muestras de ARN , extraído a partir de fragmentos
infectados con cepas de M. fijiensis ............................. ........ .. ....... .. .... ... ...... ...... .. .. ........ .... . 79
Figura 18.- Nivel de expresión de los genes Avr4 y Atr4, en fragmentos foliares de banano cv
Calcuta IV ..... ... .. ..... ... .... ..... ... .... .... ......................................... ................ ... .......... ... ... .... .. .. .. 80
Figura 19.- Nivel de expresión relativa del gen Avr4, en fragmentos foliares de banano cv Enano
gigante, infectados con diferentes cepas de M. fijiensis . .. .... .. ....... .... ...... .............. ............. 83
Figura 20.- Nivel de expresión relativa del gen Atr4, en fragmentos foliares de banano cv Enano
gigante, infectados con diferentes cepas de M. fijiensis ...... ............ ... ................. .... .. ......... 84
Figura 21 .-Amplificación del gen MfAvr4 en diferentes cepas de M. fijiensis .... .... ........ .... .. .... 97
Figura 22.- Poliformismos en cepas de M. fijiensis . ........ ........................................................... 99

xxi
 Índice

Índice de cuadros

Cuadro 1.- Estados productores de banano en México .......................................... ........................ 10

Cuadro 2.- Plagas y enfermedades que afectan al banano ....... .. .................................................... 11
Cuadro 3.- Síntomas que se presentan durante el proceso de infección de Mycosphaerella fijiensis
en las plantas de banano ........................ .......... .. .... .. ............ ... ... ............ ................. ...... ..... .... ....... 15
Cuadro 4.- Fertilizantes empleados para las hojas de banano ...................................................... 21
Cuadro 5.- Fungicidas, Dosis, ciclos y épocas de aplicación para el control de la Sigatoka Negra.22
Cuadro 6.- Escala de Stover (1971) modificada por Gauhl (1989) ............... ........ .. .............. ...... .. . 49
Cuadro 7.- Cepas utilizadas en el presente trabajo ..........................................:...................... ......... 52
Cuadro 8.- Cepas evaluadas mediante PCR tiempo real ................................ .. ...................... .. ....... 75

xxiii
 Resumen

RESUMEN

La Organización de las Naciones Unidas para la Alimentación y la Agricultura

(FAO) sitúa al banano, en el cuarto lugar en la lista de cultivos más importantes del
mundo, después de los principales cereales arroz, trígo y maíz respectivamente. El
banano es una fuente rica de carbohidratos, minerales, almidón , vitaminas, fibra y además
es un alimento básico para los países pobres.

Este cultivo es afectado por la enfermedad foliar más devastadora conocida como
Sigatoka negra, cuyo agente causal es el hongo Mycosphaerella fijíensís. Este hongo
ocasiona la destrucción parcial o total del área foliar y la madurez precoz del fruto. En este
trabajo se analizó por PCR en tiempo real, la expresión de 2 genes asociados a la
patogenicidad y/o virulencia de M. fijíensís , los genes MfAvr4 y MfAtr4 , el análisis se
realizó durante diferentes etapas de la Sigatoka negra y comparando el comportamiento
infectivo de diferentes cepas del patógeno en interacción con diferentes cultivares de
banano.

Los resultados perm itieron observar que en el cultivar Enano gigante, las cepas
Jaguar C3, CR4b y OZ1 b, presentaron mayor nivel de expresión. Sin embargo , las cepas
Jaguar C3 y CR4b provenientes de zonas de manejo intensivo de fungicidas ,
manifestaron los niveles más altos de expresión del gen Avr4, al día 5 de interacción . En
E. gigante la cepa OZ1 b expresó el nivel más alto del gen Atr4 al día 30 en cambio en el
cultivar Calcuta IV fue la cepa Jaguar C3 proveniente de manejo intensivo que tuvo mayor
nivel de expresión de Avr y Atr4 con respecto al día cero.

1
 Abstract

Abstract

Bananas and plantains are the fourth most important fruit crops in the world after
the principal cereals rice, wheat and maize according to the Food and Agriculture
Organization (FAO). Banana contributes a rich source of carbohydrates, minerals, starch,
vitamins and fiber. Moreover, this is the basic staple food resource for the developing and
under developing countries.
Unfortunately, this crop is affected by the most devastating foliar disease known as
Black Sigatoka, whose causal agent is the fungus Mycosphaerella fijiensis. This fungus
causes partial or total destruction of leaf area and early maturity of the fruit. In the present
work, we have analyzed the expression of two genes associated with pathogenicity and 1
or virulence of M.fijiensis by Real-Time PCR (RT-PCR) , and MfAtr4 MfAvr4 genes. The
analysis was performed during different stages of Black Sigatoka and compared the
infective areas from different strains of the pathogen in interaction with different banana
cultivars.
The results indicated that Jaguar C3 , CR4b and OZ1 b strains from the giant dwarf
cultivar showed higher level of expression. However, Jaguar C3 and CR4b strains from
intensive fungicides management zones showed higher level of gene expression of the
Avr4 gene at the 51h day of interaction. In giant dwarf cultivar, OZ1 b strain expressed the
highest level of Atr4 gene change at 30 days, whereas the Calcutta cultivar IV, Jaguar C3
strain from intensive management had the greatest level of expression of Av4 and Atr4
with respect to day zero.

3
 Introducción

INTRODUCCIÓN

Los bananos son una rica fuente de carbohidratos, almidón y vitaminas para más
de 100 millones de personas en todo el mundo (Nwakanma et al. , 2003); por lo tanto la
preservación de este cultivo es de suma importancia, a nivel mundial.

En México, gran cantidad de familias producen banano, por lo que este cultivo es
importante para la economía nacional. Para fines comerciales muchos productores lo
siembran en monocultivo; su comercialización se realiza ya sea como fruta fresca o como
alimento procesado (Banana Biodiversity lnternational , 2011 ). En México desde los años
80 's y hasta la fecha el banano es afectado por la Sigatoka negra (SN), enfermedad
causada por el hongo Mycosphaerella fijiensis (Robert et al. , 2012).

Los agricultores tienen pérdidas importantes en sus cultivos, debido a la SN por lo

tanto existe la necesidad de prevenir dicha enfermedad. Para contrarrestar al patógeno se
establece un manejo convencional o el uso de fungicidas (Pérez et al. , 2006), pero ésto
no ha sido suficiente por lo que es importante estudiar y caracterizar al patógeno durante
la interacción M. fijiensis-Musa.

En otros patosistemas se ha demostrado que la aplicación intensiva de fungicidas

incrementa la virulencia de la cepa del pátogeno (Beltrán- Aguilar, comunicación
personal). Es razonable que los genes que sean importantes para la virulencia se
expresen de manera más temprana y/o más intensa durante la infección con las cepas
más virulentas . Si esto es así, el ensayo de expresión cuantitativa sería una prueba que
permita identificar genes claves en la virulencia de este patógeno. En este trabajo se
evaluarán los niveles de expresión de los genes MfAvr4 y MfAtr4 durante la infección de 2
genotipos de banano con cepas de M. fijiensis que fueron aisladas de plantaciones con
diferente número de aplicaciones de fungicidas. Por lo tanto existe gran interés por
identificar genes que modulan la patogenicidad y/o virulencia, ya que representan posibles
blancos moleculares para el control del patógeno.

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 Capítulo 1

CAPÍTULO 1

Mycosphaerel/a fijiensis EL AGENTE CAUSAL DE LA ENFERMEDAD FOLIAR

MÁS DESTRUCTIVA DEL BANANO

1.· ANTECEDENTES

1.1.-DISTRIBUCIÓN DEL GÉNERO MUSA

La distribución natural del género Musa se extiende al norte de Nepal y al sur de la

parte montañosa de China , Indonesia y Nueva Gu inea; el límite occidental es la India
(Figura 1). También se han encontrado unos cuantos cultivares en la isla de Pemba, cerca
de la costa Este de África. Los bananos silvestres se encuentran en Melanesia, y unos
cuantos cultivares en Samoa. Se considera que el área limitante de la distribución de
Musa es el continente Africano y Americano, respectivamente (De et al., 2009).

Figura 1.- Distribución del género Musa (Guinard et al., 2006). Color verde: Pa íses considerados como
centro de diversidad del banano. Amarillo: Países centro de origen del banano.

Se ha propuesto que Nueva Guinea y el sureste de Asia son el centro de origen

del banano , y que se produce desde India hasta la Polinesia; el centro de diversidad se
sitúa en Malasia o Indonesia (Robert et al., 2012; Resmi et al., 2011; OGTR, 2008).

7
 Capítulo 1

1.1.1.- IMPORTANCIA DEL BANANO

Coloquialmente se denominan bananos aquellos que se consumen frescos o

crudos , también conocidos como "de postre o dulces". Mientras que aquellos cuyos frutos
son sometidos a cocción se les llama plátanos y contienen gran cantidad de almidón
(Heslop y Trude, 2007). En México, se le llama plátano indistintamente a ambos, pero lo
que más se produce comercialmente en el mundo son los bananos. En toda
Latinoamérica con excepción de México se hace una clara distinción entre bananos y
plátanos. Sin embargo, para ser homogeneos, este trabajo se referirá en su mayor parte
al banano. El cultivo de banano tiene un gran impacto económico y social debido a que es
un producto accesible, económico y nutritivo, el cual contiene vitaminas A, C, 86 y
minerales (Roux et a/., 2008). Es un alimento básico para millones de personas,
principalmente aquellas que viven en las regiones húmedas de los trópicos y subtrópicos .
El banano se consume de diversas formas , yá sea como alimento fresco y/o empacado ,
culturalmente se piensa que fue una de las primeras especies de plantas que fueron
domesticadas (Perrier et a/., 2009). En México el banano también es un producto
importante, generador de miles de empleos e ingresos (FAO, 2009).

1.1.2.- CLASIFICACIÓN DE LOS BANANOS Y PLÁTANOS

Los bananos y plátanos , cuyo nombre científico es Musa spp. pertenecen a la

familia Musaceae, compuesta por los géneros Musa, Ensete y posiblemente , Muse/la. El
género Musa ha sido clasificado en las siguientes cuatro secciones: Rhodochlamys y
Eumusa (2x = 22), Australimusa y Callimusa (2x = 20) (De et a/. , 2009). Esta clasificación
se basa principalmente en el número de cromosomas (refiriéndose a 2x como el número
de cromosomas en el estado diploide). De la sección Eumusa surgen las 2 especies
progenitoras denominadas M. acuminata, representada con el genoma A, y M. balbisiana ,
representada con el ~enoma B; de estas dos especies se generaron diferentes grupos,
entre ellos el Cavendish que es el más popular de los bananos comerciales y constituye
el 47% de la producción mundial (IICA, 2007). Así mismo , existen varios cultivares con
difer~nte COITlposiciór1 genómica, ya sea genoma A o B, por ejemplo AA y AB (diploides) ,
y, AM, MB y ABB (triploides) o MM, AMB, AABB y ABBB (tetraploides) (De et a/. ,
' '·

~01 Q; Arvanitoyannis ~t a/., 2008).

8
 Capítulo 1

Cada cultivar posee características particulares , como son la forma, tamaño y color
(verde, café , amarillo} del pseudotallo , inflorescencia (morado, rojo), sabor del fruto y la
morfología de las semillas, esto permite inferir diferencias fenotípicas de un cultivar de
otro (Roux et al., 2008; Wong et al., 2002).

1.1.3.- DESCRIPCIÓN DEL BANANO

Los bananos son plantas herbáceas gigantes, que alcanzan de 2 a 15 metros de

alto. Son monocotiledóneas, perennes, crecen rápidamente, la planta de banano es estéril
y partenocárpica (Heslop y Trude, 2007). Tienen un pseudotallo conformado por hojas
sobrepuestas unas sobre otras que le brindan soporte, dándole forma de tronco; alrededor
de la planta surgen unos retoños conocidos como hijuelos, los cuales sirven para su
posterior propagación vegetativa (Figura 2). Poseen inflorescencia y un conjunto de frutos
que se conoce como mano (FAO , 2011 ).

• ma

Figura 2.- Partes que conforman la planta de banano (Arosemena, 2007). Se observan los hijos ,
que son la forma de propagación vegetativa del banano. La inflorescencia para la polinización y el
rizoma con el que adquiere sus nutrientes.

9
 Capítulo 1

1.1.4.- PRODUCCIÓN DE BANANO

De acuerdo a la FAO , en el año 2011 se produjo un total de 14,938 , 800 toneladas

(Ton) de bananos en el mundo. Entre los principales países exportadores se encuentran
Ecuador con 5,480,200 Ton , Filipinas con 2,046,400 Ton , Colombia con 1,915,300 Ton , y
Costa Rica con 1,902,200 Ton , mientras que los principales importadores son Estados
Unidos con 4,122 ,600 Ton , seguido por Japón con 1,064 ,700 Ton y China con 818,700
(FAO, 2011 ). En cuanto a producción , India ocupa el primer lugar con 29, 780 ,000 Ton ,
seguida por China con 9, 848,895 Ton , mientras que México ocupa el 15° lugar en
producción, con 2,103,360 Ton (FAOSTAT, 2011 ). Como cultivo , el banano ocupa el
cuarto lugar, después del arroz, trigo y maíz, generando más de 80 mil empleos (FAO,
2009-1 ). En México, se está sembrando un total de 77 ,303 .66 ha, siendo los estados de
Chiapas y Tabasco los principales productores (Cuadro 1).

Cuadro 1.- Estados productores de banano en México.

Ubicación Su p. Su p. Producción
Sembrada Cosechada
(Ha) (Ha) (Ton)
CHIAPAS 24 ,355.57 24,205 .57 792 ,892.43
TABASCO 10,678 .02 10,660 .02 475 ,612.77
VERACRUZ 14,937.17 14,673.17 270,799.61
COLIMA 5,130.56 4,115.56 150,985.98
MICHOACAN 4,197.00 3,920 .00 142,077.90
JALISCO 2,869.50 2,143.00 81 ,504.25
GUERRERO 3,173.00 3,145.00 73 ,098.32
NAYARIT 5,926 .00 5,500 .00 66 ,659 .32
OAXACA 3,287.90 3,219.90 50 ,090.95
PUEBLA 2,055.44 2,055.44 29,092.01
QUINTANA ROO 319 .5 279 .5 2,989.30
YUCATAN 255 254 1,286.80
CAMPECHE 75 75 849.3
MORELOS 19 14 428.91
ESTADO DE 22 22 295
MEXICO
HIDALGO 2 2 24
77,303.66 74,284.16 2,138,686.85
Fuente: SIAP 2011.

10
 Capítulo 1

1.1.5.- AMENAZAS AL CULTIVO DE BANANO

El banano es afectado por diversas plagas: picudos, ácaros; y enfermedades

causadas por hongos, bacterias y nematodos (Cuadro 2) (Nelson et al., 2006; Almodóvar
et al., 2001 ; Marín et al. , 1998). No obstante, l.os peores daños a nivel foliar en los cultivos
de banano son ocasionados por los hongos patógenos Mycosphaerella musicola
(Sigatoka Amarilla), M. eumusaea y M. fijiensis , siendo este último el que mayores daños
ocasiona (Jones, 2002).

Cuadro 2.- Plagas y enfermedades que afectan al banano.

Descripción
Acaro blanco: Organismos que viven en el envés de las hojas.
Tetranychus urticae Reduce el área fotosintética , produciendo un bronceado
característico.
Picudo negro: Esta es una plaga de la raíz, cuyas larvas se
Cosmopolitas alimentan del cormo, originando una reducción del peso y
sordidus, Germ. de la calidad de la fruta.
Nematodos: Genera raquitismo y bajo peso de los racimos ,
Radophulos propician la pudrición del cormo y el volcamiento de las
similis plantas con racimo en desarrollo.
Araña roja: Suele localizarse cerca del racimo , notándose unos
Tetranychus puntitos de color rojo junto con las telas de araña y los
cinnabarinus huevos, causan daños en la fruta por la aparición de zonas
de color blanco plateado, que poco a poco se van haciendo
oscuras.

Enfermedad Descripción
Moko: Enfermedad vascular, causa amarrillamiento de las
Ralstonia hojas más jóvenes y necrosis, la hoja cigarro siempre se
solanacearum manifiesta march ita o "dormida"

Este hongo penetra por las raíces e invade el

11
 Capítulo 1

Mal de Panamá: sistema vascular.

Fusarium oxysporum
f. sp
Sigatoka negra: Se caracteriza por manchas en las hojas que
Mycosphaerella destruyen parcial o totalmente el área fotos intética .
fijiesis
Fuente: Nelson et al., 2006; Almodovar et al., 200 1; Marín et al., 1998.

1.2.- Mycosphaerella spp

1.2.1.- DISTRIBUCIÓN DEL GÉNERO Mycosphaerella; UN HONGO

PATÓGENO DEL BANANO.

Mycosphaerella musicola (estado teleomorfo pseudocercospora musae)

originalmente llamada Cercospora musae (estado anamorfo), causante de la Sigatoka
amarilla , fue descrita por primera vez en la isla Java en Indonesia, en 1902, y fue el
primer patógeno que causó serios problemas en las plantaciones comerciales de
bananos (Jones, 2002; Jones, 2000). Este hongo se adapta a climas fríos y a altitudes
mayores a 1500 metros; entre sus características morfológicas se puede mencionar que
las esporas de M. musicola poseen una pared celular delgada. Otra especie es
Mycosphaerella eumusae , la cual es causante de la mancha foliar; fue aislada en el
sureste Asiático en 1990 y aún es poco lo que se conoce de su biología y virulencia
(Pérez, 2002; Pineda et al., 1997).

Por último Mycosphaerella fijiensis causante de la Sigatoka negra, también

conocida como raya negra o BLSD por sus siglas en inglés, fue detectada en las Islas
Fiji en 1963 y es considerada la enfermedad foliar más importante y devastadora del
banano en todo el mundo (Jones, 2002; Jones 2000). Debido a su rápida distribución
geográfica M. fijiensis causa pérdidas entre 20 y hasta 100% de la producción , mismas
que se traducen en pérd idas económicas. M. fijiensis ha demostrado ser más virulento
que M. musicola, porque causa síntomas tempranos (en 1O días), afecta a más
cultivares del grupo Cavendish (genoma AAA) y a cultivares con genoma AAB , los
cuales son resistentes a la Sigatoka amarilla; incluso se ha adaptado a altitudes hasta
de 1300 metros (Churchill, 201 O; Arzanlou et al., 2007).

12
 Capítulo 1

1.2.2.- DISTRIBUCIÓN DE Mycosphaerella fijiensis

La forma natural de dispersión de los fitopatógenos es mediante la dispersión de

sus esporas, sin embargo, el traslado de cultivos infectados por el ser humano, también
ha favorecido la dispersión. Se sabe que el banano, hospedero de M. fijiensis, fue
introducido a diferentes países, principalmente en los trópicos y subtrópicos (Perrier et al.,
2011 ).

Robert y colaboradores (2012) propusieron una coevolución entre M. fijiensis y su

anfitrión durante el proceso de domesticación de Musa, y se ha propuesto como centro de
origen del hongo Mycosphaerella fijiensis la isla de nueva Guinea, debido a la alta
variabilidad molecular encontrada con el análisis de microsatélites y RFLPs en las cepas
aisladas de esa región (Robert et al., 2012). Se ha propuesto que el centro de la
diversidad de este patógeno podría abarcar todo el Sureste de Asia, al igual que en el
caso del género Musa (Jones 2002). En la figura 3, se puede observar la distribución del
hongo M. fijiensis en el mundo, los colores representan los diferentes orígenes de las
muestras que se usaron para el estudio (Robert et al., 2012).

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Figura J.-Distribución de la Sigatoka negra , en el mundo, Robert et al. , 2012.

En México, la Sigatoka negra se identificó por primera vez en 1980 en los estados
de Chiapas y Tabasco (Contreras, 1983), dispersándose, posteriormente a los estados de
Veracruz y Oaxaca (1985), Colima (1989), Michoacán, Jalisco y Guerrero en 1990. En

13
 Capítulo 1

diez años ya había abarcado todas las reg iones productoras de banano de México,
ocasionando grandes pérdidas , principalmente en los cultivares comercialmente
importantes como Enano gigante (AAA), Valery (AAA), Macho (AAB), Dominico (AAB),
Manzano (AAB), Pera (ABB) y Dátil (AA) (Orozco y Orozco 2004; Orozco et al., 2001 ).

1.2.2.1.- CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA DE M. fijiensis

Mycosphaerella fijíensís durante su ciclo de infección se puede encontrar en dos

estados: el perfecto y el imperfecto, siendo ambos estados infectivos (Aiexoupoulos y
Mims, 1979 citado por Manzo-Sánchez, 200 1). En el estado perfecto o teleomorfo se le
conoce como M. fijíensís Morelet mientras que el estado imperfecto o anamorfo se conoce
como Pseudocercospora fijíensís (Morelet) Deighton. Cabe mencionar que
Paracercospora es sinónimo de Pseudocercospora (Crous et al. , 2002).

Estado perfecto Estado imperfecto

Estado: T eleoformo Estado: Anamorfo

Clase: Loculoascomycetes
Orden: Dothideales
Familia: Dothideaceae
Género: Mycosphaerella
Especie: Mycosphaerella fijíensís
Clase: Hyphomycetes
Orden: Moniliales
Familia: Tuberculariceae
Género: Paracercospora
Especie: Paracoscospora fijiensis

1.2.3.- SÍNDROME DE LA SIGATOKA NEGRA

La Sigatoka negra afecta a las hojas del banano. En plantas adultas de

banano el progreso de la enfermedad está clasificado en 6 etapas (Cuadro 3) de
acuerdo a la escala propuesta por Fouré (1985) (revisado en Henderson , et al. ,
2009; Herrera-Fonseca y Naranjo-Villacís, 2007).

14
 Capítulo 1

Cuadro 3.- Síntomas que se presentan durante el proceso de infección de Mycosphaerel/a fijiensis
en las plantas de banano.

Aparecen pequeños puntos amarillentos que se convierten

1 ráp idamente en color rojizo marrón, visibles solo en la parte abaxial
de la hoja. También se le conoce como fase inicial.

Los puntos rojo marrón se alargan convirtiéndose en rayas , las

2 cuales ya son visibles tanto en la superficie abaxial como adaxial
de la hoja. También se le conoce como raya inicial.

Aparecen las estrías , aumentando su grosor y longitud de 20-30

3 mm y se observa cambio de color de entre café oscuro y negro.

Las estrías cambian de forma a manchas elípticas oscuras en

4 ambos lados de la hoja.

Las manchas negras empiezan a rodearse de un halo clorótico

5 amari llo

La mancha vuelve a cambiar de color, empieza a hundirse y el

centro presenta un color gris, seco y pálido. Los peritecios y
6 ascosporas están presentes en la etapa 6. Las lesiones siguen
siendo visibles incluso después de la muerte y la desecación de las
hojas.

Fuente: Fouré 1985 revisado Henderson et al. , 2009; Herrera-Fonseca y Naranjo-Villacís , 2007.

1.2.4.- REPRODUCCIÓN DE Mycosphaerel/a fijiensis

Mycosphaerella es uno de los géneros más grandes del grupo de los Ascomicetos;
M. fijiensis es un hongo hemibiotrófico, heterotálico y posee alta variabilidad genética, se
le conoce su estado de reproducción sexual y asexual (Crous et al., 2002). Durante la
reproducción asexual M. fijiensis desarrolla esporodoquios, estructuras altamente
organizadas de hifas que forman almohadillas apiñadas donde se desarrollarán los
conidióforos. Estos conidióforos se han observados de pocos a densos, son lisos ,
cil índricos, marrones y miden aproximadamente 14-2341-Jm x 1.4-141-Jm (Figura 4). De un

15
 Capítulo 1

solo con idióforo pueden formarse cuatro conidios maduros. Los conidios son alargados,
poseen de 1-1 O septos , por lo general 7 septos , son hialinos, obclavados , acirculares,
subcilíndricos, lisos, rectos o ligeramente curvos , delgados en el ápice y más anchos en
la base ; se encuentran en el ápice del con idióforo y al desprenderse de éste , se puede
observar su cicatriz (un poro con engrosamiento circular) . La germinación de los
conidios ocurre en forma apical , lateral o basal , miden entre 17.4-130¡Jm x 1.4-8.5 ¡Jm ;
sin embargo estas medidas varían en las descripciones de diferentes autores
(Rodríguez et al. , 2007 ; Aguirre et al., 2003; Pérez, 2002 ; Crous y Mourichón 2002 y
Mülder y Stover, 1976 citados en Pineda, 1997; Stover 1976). Los con idios son
estructuras infectivas que llegan de una hoja de banano a otra a través del salpique de la
lluvia, por lo que se considera que infectan a corta distancia (Castries , 2006; Mourichón et
al., 1997).

o¡,

Figura 4.- Estructura reproductiva de Mycosphaerella fijiensis en su estado anamorfo. A) y B)

con idióforos, C) y D) Conidios (Pérez, 2002).

La reproducción sexual se caracteriza por la presencia de peritecios,

espermagonios y ascosporas . Los espermagonios son más abundantes en la parte
abaxial de la hoja, por lo general se desarrollan en la cámara subestomática. En la etapa
madura producen los gametos masculinos conocidos como espermatia, estructura en
forma de bastoncillos o varillas hialinas (Meredith y Lawrence, 1969 citado en Manzo-
Sánchez et al., 2005, Fouré 1994). Los peritecios, miden aproximadamente 4 7-85 mm de
diámetro, son estructuras globosas con un ostiolo esférico de color pardo oscuro,

16
 Capítulo 1

aparecen como puntos negros y contienen una especie de sacos llamados aseas, donde
se generan las ascosporas , cuyo tamaño es de 111 .5-15.6 X 2.5-5 j.Jm .
Las aseas son bitunicadas, contienen 8 ascosporas hialinas, fusiformes, septadas
y aparecen en las últimas etapas de la enfermedad (etapas 5 y 6). El número de aseas es
variable , puesto que un peritecio puede llegar a producir hasta 160 ascosporas (Manzo et
al. , 2005; Manzo, 2001 ; Meredith y Lawrence 1969 ; Müller y Stover, 1976, Stover y
Simmonds, 1987 citados por: Merchán-Vargas et al. , 2000 y Fullerton y Olsen , 1995). Las
ascosporas son dispersadas por el viento , medio por el cual se propaga la enfermedad
SN a larga distancia (Mourichón et al. , 1997; Castries , 2006).

1.2.5.- CICLO DE INFECCIÓN DE Mycosphaerella fijiensis

Como se mencionó previamente M. fijíensís es un hongo hemibiotrófico, es decir,

su ciclo de infección tiene una fase biotrófica y una necrotrófica. El periodo asintomático
de la enfermedad corresponde a la fase biotrófica de M. fijíensís y más tarde cuando los
síntomas aparecen , el hongo ha cambiado a la fase necrotrófica (Hoss et al. , 2000). Los
conidióforos son producidos casi de manera continua en las primeras etapas visibles, en
particular en la etapa 2. El hongo completa su ciclo de vida formando las estructuras
sexuales en las últimas etapas de la enfermedad ; en la etapa 4 ya comienzan a formarse
los peritecios y durante la fase 5 y 6 se producen las ascosporas. En general, el ciclo de la
enfermedad es lento, tiene una prolongada fase asintomática variable en tiempo, pero los
primeros síntomas pueden aparecer en campo a los 15- 30 días después de la
penetración si las condiciones son favorables para el hongo (Meredith y Lawrence 1969,
Stover y Simmonds, 1987 citados por: Churchill , 201 O y Canto-Canché, 2009).

Cuando M. fijíensís llega a la hoja tarda en germinar de 2 a 3 h, com ienza a

alargarse el tubo germinativo del conidio sobre la superficie abaxial de la hoja durante
alrededor 2 a 3 días, hasta que penetra en la cavidad subestomática del tejido foliar a
través del poro estomatal ; los estomas se presentan en mayor cantidad en la parte abaxial
de la hoja (Meredith y Lawrence 1969, Stover y Simmonds, 1987, citado por Manzo-
Sánchez 2005; Marín et al. , 2003 y Fouré 1994 ). Antes de la penetración por el estoma el
hongo forma estomatopodios (Figura 5a), nombre que se le da a una protuberancia
producida por la hinchazón de las hifas sobre los estomas de la planta (Figura 5b).
Después de formar un estomatopodio sobre el estoma , la hifa comienza a crecer a lo

17
 Capítulo 1

largo de la superficie interior de la cámara de aire subestomatal (Figura Se) y coloniza el

espacio intercelular de los tejidos del hospedante.
El patógeno establece una relación biotrófica durante 3 a 4 semanas despúes de
la penetración y antes de la aparición de síntomas (Hoss et al. , 2000). Conforme avanza
la infección las hitas crecen y penetran otras estomas.

st
se
f
Figura 5.- Estructuras de M. fijiensis. a) Se observa la formación del estomatopodio (indicado con
St) sobre los estomas antes de penetrar, b) Estoma (st) de la planta por donde penetra el micelio
de Mycosphaerel/a fijiensis (f), e) Cavidad subestomática (se) y Células del mesófilo (me) (Churchill
201 O; Cavalcante et al., 2011 ).

Para que se dé la infección y se establezca la enfermedad , el hongo debe contar

con las condiciones adecuadas para reproducirse y colonizar al banano. Las condiciones
in vitro que favorecen la Sigatoka negra son alta humedad (80%) y temperatura de 26 a
28 oc; estos factores determinan la producción, liberación, diseminación y germinación de
las esporas (Abadie et al., 2008). La figura 6 representa el ciclo de vida de M. fijiensis.

18
 Capítulo 1

Figura 6.- Ciclo de infección de Mycosphaerella fijiensis (Courier, 2007). Se esquematiza la llegada
de las esporas de M. fijijensis sobre la lámina foliar, posteriormente el tubo germinativo comienza a
alargarse hasta encontrar las aperturas naturales de la hoja por donde penetra el hongo y empieza
a crecer en la cavidad subestomática, hasta el desarrollo de las estructuras reproductoras , que son
visibles en las últimas etapas de la infección.

1.2.6.- ENSAYOS DE INFECCIÓN CON Mycosphaerel/a fijiensis

En la evolución de la interacción patógeno-hospedante, los patógenos pueden

romper las barreras que presenta un hospedante para su defensa. Una manera para
estudiar el proceso de infección así como la interacción planta-patógeno es establecer
modelos de infección, para que bajo cond iciones controladas se pueda hacer un análisis
del mecanismo de patogénesis del microorganismo, conocimiento que ayudará a
encontrar una forma eficaz de combatirlo o reducir su impacto.

La inoculación artificial es un método de rápida detección, permite disminuir el

efecto del ambiente , obtener datos más confiables y evaluar gran cantidad de muestras
en poco tiempo (Churchill , 201 O; Abadie et al., 2008; Peraza-Echeverría et al. , 2008;
Arzanlou et al., 2007; Twizeyimana, 2007; Pérez et al., 2006). A continuación se
presentan algunos de los modelos que han sido empleados por distintos autores:

19
 Capítulo 1

a) Infección artificial de fragmentos foliares

b) Infección artificial de plantas in vitro
e) Infección artificial de plantas en invernadero

Estos modelos también se utilizan para evaluar el nivel de susceptibilidad o

resistencia de los diferentes cultivares o clonas de banano , y para evaluar el grado de
virulencia de las cepas de M. fijiensis (Bowler et al., 201 O; Donzelli y Church ill, 2007;
Guosheng et al. , 2007). Para el análisis de virulencia de las cepas de M. fijiensis por lo
general se evalúa la rapidez de infección de cultivares con diferente niveles de resistencia
a este patógeno. Lepoivre y colaboradores (2003) reportaron la infección de tres
cultivares, uno altamente susceptible , otro susceptible y otro parcialmente resistente , para
comparar la velocidad de aparición de síntomas. Las cepas muy virulentas pueden
infectar muy rápido un cultivar susceptible , pero la rapidez de infección puede ser
diferente sobre un cultivar tolerante. Básicamente estos ensayos han sido utilizados para
evaluar la susceptibilidad/resistencia de los cultivares de banano y el nivel de virulencia de
cepas del patógeno. Actualmente, se continúan usando los diferentes modelos de
infección , aunque hay una tendencia en aceptar que los resultados más confiables
provienen de la infección de la planta completa (Forum ProMusa discussion, 2011 ). Sin
embargo, es importante enfatizar que dependiendo del objetivo y las circunstancias puede
ser aceptable el uso de los modelos in vitro .

1.2.7.- MANEJO INTEGRAL PARA COMBATIR A LA SIGATOKA NEGRA

Cabe mencionar, que no existe un control cien porciento efectivo para el control de
la Sigatoka negra, pero si estrategias que nos permiten disminuir la incidencia de dicha
enfermedad. Un ejemplo de ello, es el manejo integral, el cual engloba al manejo
convencional y al control químico, para mantener las plantaciones de banano controladas .

1.2.7.1.- MANEJO CONVENCIONAL

El objetivo principal de los productores de banano es obtener racimos con frutos

de buena calidad para comercializar; para esto los agricultores necesitan que sus plantas
cuenten con al menos 10 hojas sanas al momento de la etapa de floración. Las prácticas
culturales ayudan en el manejo de las enfermedades agrícolas, pero deben ser

20
 Capítulo 1

complementadas con otros métodos. Para el manejo integrado y combate de la Sigatoka

negra es necesario tomar en cuenta varios aspectos, como son los siguientes.

Las prácticas culturales y el control de malezas: En primera instancia está el

saneamiento de las hojas, la cual consiste en el deshoje de hojas que presenten el 50%
del área infectada. Para los retoños que no son viables , la poda debe realizarse cada dos
años o anualmente (Nelson , 2008; Orozco y Orozco, 2004). Después que las hojas
infectadas se han cortado, aún son riesgo de contaminación, porque las esporas
permanecen activas durante varios días (Marín et al., 2003). Por lo tanto, las hojas
podadas deben ser removidas de la plantación y quemarse para destruir al hongo por
completo (CRBP citado por Etebu y Harry, 2011 ).

Otro aspecto es un nivel adecuado de nutrición de las plantas, puesto que las
plantas más débiles suelen ser más susceptibles a las enfermedades. En el cuadro 4, se
presenta el rango recomendado de elementos fertilizantes para las hojas de la planta de
banano (Nelson , 2008).

Cuadro 4.- Fertilizantes empleados para las hojas de banano.

Elemento Rango recomendado

Nitrógeno 2.8-3.1%
Fósforo 0.18-0.20%
Potasio 3.2-3.5%
Calcio 0.6-1 .0%
Magnesio 0.3-0.6%
Sulfuro 0.22-0.25%
Hierro 50-100ppm
Manganeso 30-100ppm
Cobre 10-15ppm
Fuente: (Nelson , 2008).

1.2.8.- CONTROL QUÍMICO

Cuando la Sigatoka negra se presenta en una plantación , la producción de

bananos puede tener pérdidas del 50 al 80% , o hasta el 100% (Mourichón et al. , 1997);
actualmente se utilizan entre 35 y 45 aplicaciones anuales de fungicidas para su control.
La aplicación de dichos compuestos representa alrededor del 40% del costo de
producción y debe ajustarse a las recomendaciones establecidas por el Comité de Acción

21
 Capítulo 1

Contra la Resistencia a Fungicidas (FRAC) (Martínez et al. , 2011 ), para evitar la pérdida
de efectividad de los compuestos químicos sobre su blanco (Figura 7).

jAntrácor j
¡IMPJ'LsE· 1

Figura 7.- Clases de fung icidas que inhiben diferentes componentes celulares (Courier 2007).

En el cuadro 5 podemos ver que los fungicidas se distinguen en 2 tipos ; los de

contacto (o protectantes) y sistémicos ; los fungicidas de contacto, actúan en el lugar
donde hacen contacto con la planta , y no son capaces de penetrar en el interior del
vegetal. Mientras que los sistémicos, atraviesan la cutícula y se translocan vía floema
hacia otros puntos distantes de la planta.

Cuadro 5.- Fungicidas , Dosis , ciclos y épocas de aplicación para el control de la Sigatoka Negra.

Producto Tipo Ingrediente Dosis Ciclo Epoca

activo (hectárea) (días)
Tilt Curativo Propiconazol 400 ce 22-30 Lluviosa
Alto 100 Sistémico Ciproconazol 400 ce 22-30 Lluviosa
curativo
Calixin Sistémico Tridemof 400 ce 18-25 Lluviosa
protectante-
curativo
Bravo Contacto Clorotalonil 1.5 lt 18-22 Lluviosa
Ditana Contacto- Mancozeb 2 Kg 25-32 Seca
protectante
Fuente: ld1ap 2009 .

22
 Capítulo 1

1.2.8.1.- MECANISMOS DE ACCIÓN DE LOS FUNGICIDAS

De acuerdo a Dutzmann y Suty-Heinze, (2004 ); Courrier, (2007) ; FRAC, (2011 );

PROFICOL, (2012) y CASAFE, (2012) los fungicidas empleados en el cultivo de banano
para el control de la Sigatoka negra son los que se describen a continuación :

1.- Fungicidas que actúan como tóxicos generales:

a. Dialquil ditiocarbamatos son moléculas que pueden inhibir el sistema de la

respiración. Se degradan con facilidad y tienen toxicidad muy baja .
b. Etilen-bis-ditiocarbamatos , son derivados del ácido etilen-bis
ditiocarbámico. Se formulan como: sal sódica (Nabam), complejo con
Manganeso (Maneb), complejo con Zinc (Zineb), o mezclas de complejos
Zinc y Manganeso (Mancozeb ). Actúan desnaturalizando proteínas del
hongo.

2.- Fungicidas que actúan sobre la respiración .

a) Dinitrofenoles, desacoplan la fosforilación oxidativa ; pueden también ser

usados como herbicidas.
b) SDHI , está ligada a la cadena de transporte de electrones mitocondrial.
Entre este grupo se encuentran el boscalid , fluopiram Carboxamidas y
Estrobilurinas del grupo Qol (lnhibidores de quinona). En el cultivo de
banano se usan azoxistrobina, piraclostrobina , trifloxistrobina .

3- Fungicidas que actúan sobre división celular, la síntesis de ácidos nucleicos y la

biosíntesis de proteínas.

a) lmidazoles alteran la biosíntesis de tubulina impidiendo la división celular.

b) Anilinopirimidinas (APs) bloquean la síntesis de metionina. El pyrimethanil
es el único ingrediente activo del grupo de las anilinopirimidinas que se usa
actualmente en el cultivo del banano .

4- Fungicidas que actúan sobre integridad de la membrana celular

23
 Capítulo 1

Estos productos alteran la biosíntesis de esteroles, impidiendo que los hongos

crezcan , a través de la alteración de la permeabilidad de la membrana.

Los más importantes son los triazoles. A este grupo pertenecen también los
lmidazoles, las Pirim idinas complejas , las Piperazinas , las Morfolinas, y las
Guanidinas, las cuales tienen carácter surfactante.

1.3.- VARIABILIDAD GENÉTICA DE Mycosphaerella fijiensis

Ante la problemática actual ocasionada por la Sigatoka negra sobre la producción

de banano, la comprensión de la genética y la organización del genoma de
Mycosphaerella fijiensis podrían conducir al desarrollo de nuevas estrategias para su
control.

M. fijiensis es un hongo altamente variable . A nivel fenotípico; se han encontrado

cepas que varían de color, desde grises claros y verde oscuro hasta negro (observaciones
en el laboratorio). La diversidad genética de M. fijiensis también se puede distinguir a nivel
de las secuencias de su ADN , como a revelado el análisis de poblaciones de diferentes
regiones geográficas, utilizando marcadores de tipo microsatélites, RFLPs y otros (Yang y
Shong , 2008; Perea et al. , 2005; Neu et al. , 1999). Estos marcadores muestran elevado
nivel de polimorfismo; algunos loci han mostrado hasta 20 aleles diferentes. Los
polimorfismos más comunes son los SNPs (polimorfismos de un solo nucleótido), es decir
aquellos que solo cambian una única base.

Stergiopoulos y colaboradores (2007) han reportado polimorfismos en el gen que

codifica a la proteína efectora Avr4 en Cladosporium fulvum , cambios que se asocian con
transiciones de avirulencia a virulencia. Se han identificado nueve polimorfismos en la
secuencia de ADN del Avr4 de C. fulvum (Stergiopoulos et al., 2007), seis de los cuales
ya habían sido descritos por Joosten y De Wit (1999). La mayoría de los polimorfismos
observados en el Avr4 fueron de tipo SNP y causan sustituciones de aminoácidos,
principalmente en los residuos de Cys de la proteína. En contraste , los polimorfismos
encontrados en los genes ECP (siglas para "proteínas extracelulares" que son los
productos que codifican) son menos frecuentes , o bien las modificaciones son sinónimas
(Stergiopoulos et al., 2007).

24
 Capítulo 1

1.4.- VIRULENCIA DE PATÓGENOS Y FUNGICIDAS

Hasta el momento no hay reportes relacionados entre la aplicación int~nsiva de

fungicidas y el incremento de la virulencia de los patógenos. Pero si comienzan a haber
trabajos de investigación con ese enfoque.

Alternaría dauci es el agente causal de la enfermedad del tizón foliar ALB (por sus
siglas en inglés "Aiternaria leaf blight"). En el año 2004 en Norteamérica se aislaron 22
cepas de A. dauci a partir de la zanahoria comercial (Daucus carota var. Sativus). Se
analizó la virulencia sobre tres variedades de zanahoria: Heritage (Susceptible),
Enterprise (Parcial) y Bolero (resistente). También se evaluó la respuesta in vitro de A.
dauci ante los fungicidas azoxistrobina , clorotalonil , y boscalid , comúnmente utilizados
para el control de ALB. La severidad de enfermedad , medida como intensidad de
clorosis, fue de 10.9 al 45.1 % del área foliar afectada, después de 16 días de inoculación.
Dicha clorosis posiblemente se debió a los metabolitos secundarios producidos por
Alternaría. También se encontró una relación positiva entre los síntomas del peciolo , hoja
y clorosis; pero no entre la virulencia y los diferentes fungicidas a los que fueron
sometidos. La mayoría de los aislados incrementaron su virulencia sobre el genotipo
hospedante, del cual fue originalmente aislado, pero no se comportaron igual sobre el
genotipo susceptible (Heritage). En promedio, los aislados fueron más sensibles al
clorotalonil que al azoxistrobina y boscalid. La concentración inhibidora de germinación
conidial varió entre 0,009 y 0,08 mg/ml (Rogers y Stevenson , 201 0).

También se menciona el caso de Botrytis cinerea , mejor conocido como el hongo

gris que afecta los viñedos . Kretschmer y colaboradores (2009) clasificaron cepas de la
región de Champagne, Francia de acuerdo a su sensibilidad hacia fungicidas . El análisis
durante el periodo 2006 - 2008 reveló que hubo una disminución de sensibilidad hacia
algunos fungicidas. Se analizó el papel en estas cepas de los transportadores tipos MOR
("multi drug resistance") y de acuerdo a las expresiones génicas de estos transportadores
se clasificaron en MDR1 , MDR2 y MDR3; por ejemplo, en las cepas MDR1 se incrementó
la expresión de este transportador, respecto a cepas aisladas al principio de las colectas .
Las cepas MDR1 mostraron mayor resistencia hacia fludioxonil (anti-fúngico de origen
natural) y ciprodinil (anilinopirimidina) ; las MDR2 tuvieron aumento de la resistencia a
fenhexamida (Hidroxianilidas), cicloheximida y ciprodinil , mientras que las MDR3

25
 Capítulo 1

mostraron los niveles más altos y de más amplio espectro de resistencia contra la mayoría
de los fungicidas evaluados. Esta resistencia parece estar asociada a mutaciones en el
factor de transcripción Mrr1, el cual controla la expresión de trasportadores. Este trabajo
muestra que la presión de los fungicidas pueden conducir a la evolución de genes
particulares , como fue la aparición de mutaciones en el gen Mrr1 (Kretschmer et al.,
2009).

En el caso del cultivo de banano , se sabe que ha estado sujeto a un manejo

intensivo de fungicidas y varios investigadores suponen (Beltrán- Aguilar, comunicación
personal) que pudieran estarse seleccionando las cepas más virulentas. En este trabajo,
las cepas seleccionadas provienen de plantaciones de manejo rural e intensivo de
fungicidas , considerando manejo intensivo aquellas plantaciones que han sido sometidas
a fungicidas como el Mancozeb, Calixin , Bravo 720 , Estrobilurina y Triazoles y como
manejo rural a aquellas plantaciones donde la aplicación a fungicidas es ocasional y son
de contacto como el mancozeb.

1.5.-INTERACCIÓN PLANTA-PATÓGENO

Los hongos patógenos de plantas, son microorganismos altamente versátiles, esta

versatil idad les permite sobrevivir en cond iciones desfavorables y estar listos para infectar
cuando las condiciones son óptimas. Para todo esto , existe una gran cantidad de genes
que codifican proteínas, metabolitos, toxinas y enzimas , estos genes están involucrados
en el ciclo de infección y son llamados fatores de patog.enicidad y/o factores de virulencia
(Fernández Acero et al., 2011 ). Sin embargo , hoy en día dependiendo del enfoque y la
disciplina estudiada , encontramos múltiples definiciones de los términos patogenicidad y
virulencia, ya sea patología de invertebrados, biología, microbiología, medicina, y
fitopatología , por mencionar algunas. Shapiro-llan y colaboradores (2005) , examinaron
desde 1970 hasta el 2004, ambos términos y es claro observar que no hay una definición
absoluta y única para todas las disciplinas, por lo que en este trabajo para evitar mal
entendidos o confusiones consideramos optar que un factor de patogenicidad, se define
como un gen, proteína o toxina que es necesario para el desarrollo de la enfermedad ,
pero no esencial para completar el ciclo de vida in vitro del patógeno, esto se refiere a la
capacidad de un patógeno para causar una enfermedad . Mientras que un factor de

26
 Capítulo 1

virulencia es aquel capaz de regular la intensidad de la infección y la virulencia puede ser

considerada como el grado de patogenicidad (gravedad o severidad de la enfermedad
causada por el patógeno) del gen, proteína o toxina correspondiente (Collinge y
Slusarenko, 1987; Van der' Plank 1968 citado por Nachaat Sakr, 2011; Fernández-Acero
2007 citado por Fernández-Acero et al., 2011 ).

1.5.1.- ESTRATEGIAS DE COLONIZACIÓN DE LOS PATÓGENOS

Algunos de los organismos presentes en los cultivos son patógenos, es decir son
organismos que tienen la capacidad de producir una enfermedad. Los factores que
regulan la intensidad de la infección son llamados factores de virulencia. Estos patógenos
llegan a causar grandes pérdidas , ya que desarrollan mecanismos para infectar y
colonizar, a su hospedante sobrevivir y reproducirse exitosamente, a costa de éste
(Reape y McCabe, 2008; Collinge y Slusarenko, 1987). Entre las estrategias que utilizan
los patógenos están la síntesis de metabolitos secundarios , enzimas degradadoras de la
pared celular de la planta , compuestos fenólicos y toxinas que dañan las células de su
hospedante (Kankanala et al., 2007; Kosack y Jones, 1996). También desarrollan
estructuras como los apresorios y haustorios; los apresorios les sirven para ejercer
presión durante su fijación sobre la superficie y los haustorios para alimentarse
(Ordeñana, 2002; Dean, 1997). Como parte de su respuesta de defensa basal , las plantas
poseen barreras físicas como la cutícula y responden al ataque del patógeno secretando
moléculas de diferente naturaleza, las cuales inhiben a las enzimas del invasor. También
aumentan el grosor de la pared celular, de la cutícula , deposición de callosa, secretan
fitoalexinas y agliconas, entre otros mecanismos (Spoel y Dong, 2012; Kosack y Jones,
1996). Como respuesta general las plantas poseen "receptores de reconocimiento de
patrones" (PRRs, por "pattern recognition receptor"), los cuales disparan la "inmunidad" en
respuesta al reconocimiento de los patrones moleculares asociado a los patógenos
(PAMPs, por sus siglas en inglés: "pathogen-associated molecular patterns"). A esta vía
de respuesta se le denomina PTI , abreviación de PAMP Triggered lmmunity (Jones y
Dangl , 2006; Vivanco et al. , 2005).

Un ejemplo de un PAMP es la quitina. Una fase muy interesante durante el ciclo de

infección del patógeno es la invasión del apoplasto de la planta, donde se desarrolla una
batalla química una vez que se han superado las barreras físicas. Es decir, los patógenos

27
 Capítulo 1

evolucionan para suprimir el PTI (Figura 8), interfiriendo con su reconocimiento en la

membrana plasmática por las proteínas receptoras o por las proteínas secretadas en el
citosol de la célula vegetal , bloqueando la señalización y la manifestación de las
respuestas de resistencia (Thomma et al, 2011 ; Zipfel y Robatzek, 201 O) . Además de la
respuesta inducida por los PAMPs, las plantas han desarrollado un mecanismo más
especializado para detectar los patógenos , la inmunidad "disparada" por efectores,
llamada ETI (por "Effector Triggered lmmunity").

High PTI ETS ETI ETS ETI

Threshold for HR

8e Pathogen
effectors

o'*a;
-o

-o
·"ª
a.
f
<(
Threshold for
effective reststance
Low

Figura 8.- Modelo zigzag, ilustra el sistema inmune de la planta . En la fase 1 las plantas detectan a
los patrones moleculares asociados a patógenos (PAMP), para encender la inmunidad disparada
por PAMP, En la fase 2, los patógenos exitosos liberan efectores que suprimen al PTI , activan la
alimentación y dispersión , dando lugar a la susceptibilidad disparada por efectores (ETS), Fase 3,
un efector es reconocido por la proteína de resistencia, activando la inmunidad disparada por
efectores (ETI). Fase 4, las cepas patógenas han perdido a efectores y han ganado nuevos, que
pueden ayudar a suprimir la ETI , sin embargo la selección en algunas plantas puede ayudar a
reconocer los nuevos efectores produciendo nuevamente el ETI (Jones y Dangl , 2006).

Este proceso implica el reconocimiento directo o indirecto de proteínas del

patógeno asociadas a su patogenicidad , llamadas efectores. Dentro de este grupo se
clasifican las proteínas Avr, las cuales promueven la virulencia en los hospedantes que
son incapaces de reconocerlas y por tanto son incapaces de disparar el mecanismo de
resistencia . En aquellos que se da este reconocimiento , la interacción está med iada por
las proteínas de resistencia (R), es decir la respectiva proteína cognado (Fernández et al. ,
2011 ; Stergiopoulus y De Wit, 2009; Chisholm et al., 2006). De tal forma que se conoce
como interacción compatible (hospedante susceptible-patógeno virulento) cuando no se
lleva acabo el reconocimiento y la respuesta de defensa no es activada , por lo tanto se .

28
 Capítulo 1

establece la enfermedad. Mientras que en la interacción incompatible (hospedante

resistente-patógeno avirulento) se caracteriza por estar mediada por sistemas de
reconocimiento que activan la expresión de mecanismos de defensa, generalmente
asociados con la respuesta hipersensible (HR) y no se establece la enfermedad (Heath
2000). La HR ocurre como resultado de una necrosis controlada en el sitio de infección,
conocida como muerte celular programada y esta mediado por las especies reactivas de
oxígeno y el SAR (resistencia sistémica adquirida) es una respuesta de defensa activa ,
sistémica de amplio espectro que está asociada a una alta expresión de genes PR y de
ácido salicílico que se distribuye de manera sistém ica a través de los tej idos
(Hammerschmidt 1999).

Aquellos patógenos capaces de evitar este reconocimiento o bloquear a estas

proteínas receptoras logran infectar exitosamente. Se sabe que algunos de los efectores
bloquean la señalización mediada por las proteínas cinasas activadas por mitógenos
(MAPK). Entre estos se pueden mencionar el AvrPto y AvrPtoB de Pseudomonas
syringae; el AvrPto actúa como un inhibidor de la cinasa Pto e inhibe la actividad cinasa
del receptor de la flagelina , el PRR FLS2 (por "Fiagelline Sensitive2) que reconoce a la
molécula PAMP flagelina. AvrPto inhibe también a EFR (el receptor de EF-TU ; EF-TU es
una GTPasa que actúa como factor de elongación en la síntesis de proteínas , y es un
factor PAMP). AvrPto es un supresor que se dirige a muchos dominios de cinasa, de la
clase RLK (por "receptor-like kinases") (Shan et al., 2007; Ping et al. , 2007).

El AvrPtoB es una proteína que contiene en el extremo carboxilo (C-terminal) un

dominio E3 ligasa, que promueve la degradación de una cinasa del tomate (Pto , una
proteína R). Por otro lado el AvrPtoB también es capaz de ubiquitinar varios dominios de
cinasa de PRRs, incluyendo FLS2 y EFR; también se une a CERK1 para su ubiquitacion ;
por otra parte CERK1 juega un papel importante en la detección de bacterias patogénicas
(Boller y Félix, 2009).

29
 Capítulo 1

1.5.2.- EFECTORES

Los efectores se definen como aquellas proteínas patógenas y moléculas

pequeñas (entre 3 a 15 kDa), que alteran la estructura y función de la célula del
hospedante. Estas alteraciones facilitan la infección , desencadenan respuestas de
defensa o ambos (Hogenhout et al. , 2009). Los genes Avr de patógenos codifican
proteínas pequeñas , secretadas en el apoplasto, que realizan funciones de patogenicidad
y son reconocidas por proteínas R citoplásmicas dentro de la célula hospedante (Dodds,
et al., 2009), contienen gran cantidad de residuos de cisteína que establecen puentes
disulfuro que ayudan a su estabilidad en el apoplasto de las plantas hospedantes
(Stergiopoulos et al. , 201 0). Por ejemplo, el Avr2 secretado por Cladosporium fulvum
inhibe las cisteína-proteasas extracelulares del tomate, las cuales son necesarios para la
defensa basal de la planta (Shabab et al. , 2008; Rooney et al. , 2005). También se pueden
mencionar otras proteínas, por ejemplo la ECP6 de C. fulvum , la cual es una proteína
efectora que se ha encontrado en muchos hongos, incluyendo Mycosphaerella
graminicola y M. fijiensis (Stergiopoulos , 2008); la ECP6 de M. fijiensis es casi del doble
del tamaño que la proteína ortóloga de C. fulvum. Ecp6 tiene alta afinidad por diversos
oligosacáridos de quitina de cadena corta , por lo que es capaz de suprimir la inmunidad
disparada por quitina (Jonge et al. , 2010).

Durante la infección, en el caso de varios patógenos éstos penetran la pared

celular y la membrana plasmática , invaginando a la célula hospedante y formando una
estructura especializada para la alimentación , denominada haustorio (Voegele y
Mendgen, 2003 ; Dean , 1997). Existe el caso de hongos que no producen haustorios, por
ejemplo Magnaporthe oryzae. En este hongo, se han descrito las proteínas Avr-Pita y
AvrPiz-t, las cuales son reconocidas en el interior de las células vegetales mediante la
interacción directa con su respectivas proteínas de resistencia (R) (Li et al., 2009; Jia et
al., 2000). Las hifas de M. oryzae se propagan de manera abundante dentro de las células
de la planta y están rodeadas por la membrana hifal, lo que probablemente permite
translocar proteínas efectoras a través de la membrana de las células vegetales
(Kankanala et al. , 2007).

Como se ha mencionado, los Avrs están sujetos a evolución acelerada y son parte
de "una carrera armamentista contra los hospedantes", debido a su diversificación y

30
 Capítulo 1

selección. Un ejemplo de esto son las variaciones de aminoácidos encontradas en 3

proteínas Avrl567 (A, B, y C) codificada por la cepa CH5 de Melampsora lini, debido al
alto nivel polimórfico en ellocus AvrL567. Estos cambios pudieran afectar la especificidad
del reconocimiento entre las proteínas R-Avr y perm itir a las variantes del AvrL567 evadir
"la vigilancia" del hospedante. Las isoformas de AvrL567 parecen tener una estructura
proteica conservada y estable , por lo que pueden conservar gran cantidad de propiedades
(Dodds et al. , 2006).

En un estudio realizado en arroz (Oryza sativa L.), se ha demostrado que la

proteína efectora LysM 1 (SLP1) secretada por Magnaporthe oryza, realiza un papel
análogo al ECP6 de Cladosporium fulvum, el cual captura los oligosacáridos de quitina
liberados de la pared celular fúngica. Para evitar su reconocimiento oryzae supera la
primera línea de defensa de las plantas mediante la secreción de una proteína efectora ,
SLP1 (por sus siglas en inglés "Secreted LysM Protein1 "), la cual se acumula en la
interfase entre la pared celular del hongo y la membrana plasmática del arroz. SLP1
compite directamente con el receptor de quitina en la célula hospedante (CEBiP) para
suprimir la respuesta inmune de la planta; CEBiP reconoce a los oligosacáridos de quitina
liberados de las paredes celu lares de los hongos patógenos y dispara el mecanismo de
defensa. SLP1 puede secuestrar a la quitina de tal forma que es capaz de suprimir la
respuesta inmune de la planta inducida por este PAMP, incluyendo la supresión de la
generación de especies reactivas de oxígeno y la expresión de genes de defensa de las
plantas. SLP1 es requerido por M. oryzae para la virulencia y ejerce un efecto significativo
en la invasión de tejidos y expansión de las lesiones de la enfermedad. SLP1 en el
patógeno y CEBiP en la planta juegan un papel de competencia por la unión a la quitina
durante la interacción. (Mentlak et al., 2012; Rafiqui , 2012).

Por otra parte, existen casos como el de Botrytis cinerea , cuya penetración
provoca ruptura de la cutícula y por consiguiente la generación de H20 2 , lo que puede
ayudar en la penetración , como sustrato para las peroxidasas que modifican la cutícula
(Van-Kan , 2006).

Los patógenos también necesitan una fuente de carbono durante el proceso de

infección. Por ejemplo en Stagonospora nodorum se observó que la inactivación del gen

31
 Capítulo 1

malato sintasa (MLS1) ocasionó que éste fuera incapaz de germinar en ausencia de una
fuente de carbono (Solomon et al. , 2004). En oryzae se ha sugerido que el glucógeno es
el proveedor de la fuente de carbono para su germinación (Thines et al., 2000).

1.6.-IMPORTANCIA DE LOS GENES Avr4 y Atr4

En la actualidad , se han identificado una gran cantidad de genes fúngicos que

codifican productos extracelulares e intracelulares relacionados con la patogenicidad y/o
virulencia y, que probablemente controlen también funciones para el desarrollo celular,
como puede ser de defensa, reconocimiento, degradación de las paredes del
hospedante, entre otros (Stergiopoulus y De W it, 2009).

Uno de los modelos de interacción planta-patógeno más estudiado es So/anum

lycopersicum-Ciadosporium fulvum , en el cual se han detectado varios efectores. El
hongo provoca en la planta acumulación de las proteínas relacionadas a la patogénesis ~-

1,3 glucanasa y quitinasa, mejor conocidas como PRs ("pathogenesis related "); estas
proteínas se acumulan en el apoplasto vegetal. El hongo por su parte secreta proteínas
efectoras como el Avr4, el cual experimentalmente se ha demostrado que se une a
quitina. Esta proteína protege in vitro las paredes celulares de Trichoderma viride y
Fusarium sotaní, evitando la degradación de la pared celular por los efectos deletéreos de
las quitinasas, y se cree que es el mecan ismo por el que protege al hongo de las
quitinasas de las plantas (Stergiopoulos et al., 201 O; Shabab et al. , 2008).

En el caso de Mycosphaerella fijiensis se ha identificado al gen MfAvr4 que es

ortólogo funcional del gen descrito en C. fulvum; se ha demostrado que este tiene unión a
quitina y comportamiento de lectina, e in vitro protege la pared del hongo de la
degradación por quitinasas, además se ha observado que cuando es inyectado en las
hojas de la planta de tomate se dispara la respuesta hipersensible (Vant- Klooster, 2010;
Stergiopoulos et al., 2010).

Con base en estos antecedentes se eligió al gen MfAvr4 para analizar su

expresión en diferentes cepas de M. fijiensis procedentes de plantaciones con diferentes
intensidades de aplicación de fungicidas , se evaluó su expresión durante su interacción
de 2 genotipos de banano.

32
 Capítulo 1

El otro gen seleccionado en este trabajo es un transportador de tipo ABC llamado

MfAtr4. Los transportadores ABC son proteínas membranales altamente conservadas, su
nombre ABC es por sus siglas en inglés "ATP Binding Cassette", poseen 2 dominios
transmembranales (TMD) conformados por hélices que forman un canal que trasloca el
sustrato a través de la membrana; el canal es la zona más divergente y define la
especificidad del sustrato. Cada TMD tiene un domin io de unión al ATP (Andrade et al.,
2000). La familia ABC comprende una gran cantidad de proteínas responsables del
control del flujo de salida y entrada de sustancias a través de la membrana celular como
son iones, aminoácidos , péptidos , azúcares , vitaminas y fosfolípidos. Estos
transportadores juegan un papel importante en la resistencia a fármacos y pueden
también actuar como factores de virulencia y proporcionar una protección ante las
defensas de la planta durante su infección y desarrollo de la enfermedad (Gupta y
Chattoo, 2007; Dawson et al. , 2007).

Algunos reportes relacionan a los transportadores ABC con la virulencia de

algunos hongos fitopatógenos, como es el caso de Magnaporthe grisea , el hongo más
destructivo en el cultivo del arroz (Dean et al. , 2005). Este patógeno requiere al
transportador ABC1 para invadir al hospedante y superar los componentes fitotóxicos de
la planta. También está el gen Gpabc1 que codifica para un transportador ABC, necesario
para la virulencia de Giberella pulicaris y su tolerancia a fitoalexinas en el cultivo de papa.
En Mycosphaerella graminicola se han aislado 5 transportadores, MgAtr1, MgAtr2,
MgAtr3, MgAtr4 y MgAtrS, todos estos dan protección al patógeno contra compuestos
tóxicos como fungicidas (Stergiopoulos et al., 2003). Sin embargo, entre estos
transportadores el MgAtr4 fue el único que se encontró relacionado con la virulencia , con
base en que la pérdida de su función en mutantes provocó que la cepa virulenta M.
graminicola perdiera su capacidad de colonizar a plantas de trigo. En el grupo de banano,
se identificó en M. fijiensis mediante análisis bioinformático , un probable ortólogo de este
gen MgAtr4. El presunto gen MfAtr4 se expresa durante la interacción, en particular en la
fase necrotrófica (Couoh-Uicab et al. , 2012), similarmente al comportamiento de MgAtr4
en M. graminico/a. Este gen se seleccionó como marcador con el objetivo de analizar su
expresión en diferentes cepas de M. fijiensis durante su interacción con 2 genotipos de
banano.

33
 Capítulo 1

1.6.1.-SELECCIÓN DE GENES MARCADORES PARA ESTUDIAR EL

PROCESO INFECTIVO DE M. fijiesis

Hasta el momento se han identificado pocos genes de patogenicidad y efectores

en M. fijiensis. Entre estos se pueden mencionar los genes mencionados en el párrafo
anterior, el MfAtr4 (Couoh-Uicab et al. , 2012) y a los efectores MfAvr4 y MfEcp2
(Stergioupoulus et al., 2010). Se están estudiando también otros genes, pero
actualmente están menos caracterizados, por lo que se decidió que los genes
marcadores en este estudio serían los conocidos, como MfAtr4 y MfAvr4,
respectivamente.

1.7.-JUSTIFICACIÓN

Con base en los antecedentes, existe gran interés por identificar genes que
modulan la patogenicidad y/o virulencia, pues representan posibles blancos moleculares
para el control de los patógenos, ya que los mismos le permiten al patógeno encender y/o
suprimir las respuestas de defensas del hospedante y con ello completar exitosamente su
ciclo de vida. Se ha reportado que la expresión de algunos genes Avrs es exclusiva del
proceso de infección; otros aumentan su expresión durante el progreso de la infección,
mientras que otros más se expresan mayoritariamente en alguna etapa particular
(Stergiopoulos y De Wit, 2009; Shabab et al. , 2008; Dean et al., 2005). Con base en esto ,
el seguimiento de la expresión durante la infección puede ser una herramienta para
identificar genes de patogenicidad y/o virulencia.

Por lo tanto , se considera que una primera aproximación para evaluar esta
propuesta es comparar la expresión de genes de patogenicidad conocidos, que pudieran
utilizarse como genes marcadores durante la infección del hospedante con cepas del
patógeno con diferentes grados de virulencia. La expresión de estos genes efectores fue
cuantificada mediante PCR en tiempo real y de manera complementaria se analizaron las
secuencias nucleotídicas del gen Avr4 de las cepas del patógeno empleadas en el
estudio, para evaluar si existen polimorfismos en el gen de cepas de Mycosphaerella
fijiensis aisladas de plantaciones con diferente manejo de fungicidas.

34
 Capítulo 1

1.8.- HIPÓTESIS

Las cepas de Mycosphaerella fijiensis aisladas de fincas con manejo intensivo y

semi intensivo de fungicidas expresan en etapas más tempranas o con mayor intensidad
los genes MfAvr4 y MfAtr4 durante el proceso de infección del banano, en comparación
con las cepas M. fijiensis aisladas de fincas sin manejo de fungicidas.

1.9.- OBJETIVO GENERAL

Comparar la expresión de los genes MfAtr4 y MfAvr4 durante la infección de

banano con cepas de Mycosphaerella fijiensis, aisladas de plantaciones de bananos con y
sin manejo de fungicidas.

1.9.1.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS.

1. Determinar la virulencia de las cepas C1233 y Jaguar mediante evaluación visual

de la rapidez del desarrollo de síntomas en el cultivar de banano Enano gigante.
2. Analizar durante la infección de banano la expresión de los genes MfAtr4 y MfAvr4
en cepas de M. fijiensis aisladas de fincas bananeras con y sin manejo de
fungicidas.
3. Analizar la presencia de posibles polimorfismos del gen Avr4 en las cepas de
Mycosphaerella fijiensis aisladas de plantaciones de bananos con diferente
intensidad de mane~o de {ungicidas .

35
 Capítulo 1

1.9.2.- DISEÑO EXPERIMENTAL

Estrategia experimental

Cultivo in vitro de M. fijiensis

Obtención del ADN de las cepas Determinación visual de la

M. fijiensis (C1233, CR4b, OZ1 b ,------1 virulencia
y Jaguar C3) utilizadas en este
estudio
Producción de esporas asexuales
de cepas de M. fijiensis (CR4b,
Secuenciación del gen Avr4 de
OZ1 b, C1233 y Jaguar C3) * para
cepas M. fijiensis (C1233,
inocular fragmentos foliares de
CR4b , OZ1 b y Jaguar)
Enano gigante.

Análisis de polimorfismo Extracción del ARN de fragmentos

del gen Avr4 en las cepas de infectados independientemente con
M. fijiensis utilizadas en este esporas asexuales de las 4 cepas
estudio de M. fijiensis (C1233, Jaguar C3 ,
CR4b y Oz1 b)

Análisis de las secuencias Análisis de la expresión de

Obtenidas los genes MfAvr4 y
MfAtr4 por qRT-PCR

Análisis de los
resultados
·-------~---------~ r-~

* Las muestras de infección de banano con las cepas C1233, CR4b, Jaguar C3 y Oz1 by
empleadas en este trabajo fueron proporcionadas por la M. C. Leticia Peraza-Echeverría y
la Dra. Cecilia Rodríguez García.

37
 Capítulo 1

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48
 Capítulo JI

CAPÍTULO 11

VIRULENCIA DE CEPAS M. FIJIENS/S

2.- DETERMINACIÓN DE LA VIRULENCIA

2.1.-INTRODUCCIÓN
Se sabe que cepas de Mycosphaerella fijiensis pueden presentar diferentes grados
de virulencia sobre diferentes hospederos. En el capítulo anterior definimos a la virulencia
como el grado de patogenicidad (gravedad o severidad de la enfermedad causada por el
patógeno) del gen, proteína o toxina correspondiente (Collinge y Slusarenko, 1987; Van
der Plank 1968 citado por Nachaat Sakr, 2011; Fernández-Acero 2007 citado por
Fernández-Acero et al. , 2011 ). Sin embargo el papel de la virulencia de los patógenos de
plantas ha sido insuficientemente investigado.
En el caso de M. fijiensis la virulencia generalmente se evalúa considerando la
rapidez de infección de cultivares con diferente niveles de resistencia a este patógeno
(Lepoivre et al., 2003). En condiciones de campo , la severidad causada por M. fijiensis se
ha evaluado de acuerdo con la escala reportada por Morales-Romero y colaboradores
(2009) , en la cual se le asigna a cada hoja un valor que corresponde con el porcentaje del
área necrótica (Cuadro 6).

Cuadro 6.- Escala de Stover (1971) modificada por Gauhl (1989). Tomada de Morales-Romero et
al. , 2009.

Claves o Grados
o Sin síntomas
1 Menos de un 1% de la lámina con
síntomas (únicamente líneas y/o hasta 1O
manchas)
2 1 a 5 % de la lámina con síntomas
3 6 a 15% de la lámina con síntomas
4 16 a 33% de la lámina con síntomas
5 34 a 50% de la lámina con síntomas

49
 Capítulo 11

Las primeras evaluaciones de virulencia se realizaron en condiciones naturales, pero este

método es lento y variable , dependiendo de las condiciones naturales a las que esté
sometida la planta en ese momento; además demanda la disponibilidad de mucho
espacio. Debido a ello se fueron implementando los métodos de evaluación bajo
condiciones controladas, empleando inoculaciones artificiales con esporas asexuales del
hongo o fragmentos de micelio (Bowler et al., 201 O; Donzelli y Churchill , 2007; Guosheng
et al., 2007).
La inoculación artificial es un método de rápida detección , permite disminuir el
efecto del ambiente, obtener datos más reproducibles y evaluar gran cantidad de
muestras. Sin embargo , todos y cada uno de los ensayos tienen ventajas y desventajas
(Churchill, 2010; Abadie et al., 2008; Peraza-Echeverría et al. , 2008; Arzanlou et al. , 2007;
Twizeyimana, 2007 ; Pérez et al., 2006).

Castellón (2005) estudió la severidad de la Sigatoka negra en campo y reportó que

la severidad de M. fijiensis en un periodo seco fue de 1O a 12%, influenciada por la
humedad relativa presente de enero a marzo. La severidad aumentó de 12 a 20%, cuando
se presentaron las precipitaciones (Castellón, 2005). Otro dato es el reportado por Orozco
en 2001 , donde la mayor severidad fue encontrada de julio a diciembre , con 15- 25 %,
mientras que en marzo fue del 1O %.

Abadie y colaboradores (2008), propusieron un protocolo en base a lo reportado

previamente por Mourichón y colaboradores (1987) para el análisis de interacciones M.
fijiensis - Musa spp., con el fin de evaluar la virulencia del patógeno. Estos autores
infectaron plantas y fragmentos foliares de diferentes cultivares mediante la aplicación de
suspensión de esporas asexuales y observaron que los síntomas en los fragmentos
aparecen entre 18-20 días después de la incubación, mientras que en las plantas
aparecen a los 35 días; el tiempo para alcanzar la fase final fue diferente dependiendo del
cultivar. Es decir, el tiempo de aparición de síntomas fue dependiente del cultivar
(susceptible, resistente o tolerante). Observaron también que el progreso de la
enfermedad no fue homogéneo y hubo una alta mortalidad de los fragmentos foliares , por
lo que discuten la importancia de tener cuidado de elegir las hojas más jóvenes y en
óptimas condiciones fisiológicas.

50
 Capítulo 11

Otro método para evaluar la virulencia de las cepas es el reportado por Donzelli y
Churchill (2007). Estos autores inocularon la superficie abaxial de la hoja de banano con
micelio fragmentado, en áreas de 5 x 5 (evaluándose gran cantidad de cepas), bajo
condiciones estrictamente controladas y óptimas. Los resultados fueron analizados con
ayuda de un Software de analisis de imágenes para medir el porcentaje de cada área en
la hoja inoculada que presentaba los síntomas correspondientes a Sigatoka negra. Los
daños observados correlacionaron con el peso de micelio empleado, y la fragmentación
del mismo. Este es el primer informe que demuestra que la cantidad de inóculo micelial ,
combinado
con software de análisis de imágenes para medir la gravedad de la enfermedad, se puede
utilizar para evaluar cuantitativamente la virulencia de M. fijiensis

En los últimos 1O años el número de aplicaciones de fungicidas en las

plantaciones de banano se ha duplicado de 30 a 60 aplicaciones anuales (Pérez et al,
2006). Lo que hace pensar que las poblaciones del patógeno pueden haber estado
incrementando su virulencia debido a la intensa aplicación de fungicidas a las que son
sometidas las plantaciones comerciales para el control de Sigatoka negra.

En el grupo de trabajo de banano, existe el interés por identificar genes que sean
importantes para la patogenicidad de M. fijiensis. En este trabajo se evalúa durante el
proceso infectivo y en cepas con diferente nivel de virulencia la expresión de genes con
importancia en la patogenicidad con el fin de explorar como son·los patrones de expresión
de estos .genes. En este capítulo se evaluó la virulencia de las cepas C1233 (Manejo
rural) y Jaguar C3 (manejo Intensivo) sobre el cv Enano gigante. Empleando el ensayo de
inoculación artificial de fragmentos foliares, establecido por Rodríguez-García y
colaboradores en 2008 (CICY), dicha virulencia se determina mediante la evaluación
visual de la rapidez de desarrollo de síntomas. Este ensayo permite evaluar si existe
correlación del daño causado en los fragmentos foliares (virulencia) con el programa de
manejo de fungicida al que fue sometida la cepa en la finca, así como con el nivel de
expresión de los genes de patogenicidad seleccionados.

Cabe mencionar que todas las cepas fueron aisladas de bananos del cultivar
Enano gigante, pero con diferente manejo de fungicidas (cuadro 7). Esto es que aquellas

51
 Capítulo 1/

cepas aisladas de plantaciones sin ninguna aplicación de fungicidas , se les clasifico como
manejo rural , mientras que las cepas aisladas de plantaciones clasificadas como manejo
semi intensivo reciben 48 aplicaciones al año de fungicidas , principalmente de contacto,
por último de manejo intensivo aquellas cepas aisladas de plantaciones que emplean más
de 48 aplicaciones de fungicidas sistémicos, (Dr. Islas-Flores y Dr. James comunicación
personal). Para el presente trabajo el grupo de la Dra. Cecilia Rodríguez García
proporcionó los fragmentos de los cultivares de banano, Enano gigante y Calcuta IV
infectados con las cepas C1233 , CR4b , Jaguar C3 y Oz1 b; dichos fragmentos infectados
fueron empleados para el análisis de transcritos por PCR tiempo real.

Cuadro 7.- Cepas utilizadas en el presente trabajo. Las cepas fueron aisladas de plantaciones con
diferente manejo de fungicidas y fueron utilizadas para inocular diferentes cultivares de banano.

Cepa aislada del Manejo de Fungicida Origen de Fuente

cultivar Enano Empleado la cepa original de la
gigante fungicida cepa
C1233 Ausente Ninguno Yucatán Dr. Jean Carlier
Oz1b Ausente Ninguno Chiapas Dr. Ignacio Islas
Flores
CR4b Semi Mancozeb
intensivo Calixin
Bravo 720
Jaguar C3 Intensivo Mancozeb Tabasco Dr. Lucia no
Estrobilurina Martínez Bolaños
Triazoles

2.2.- MATERIALES Y MÉTODOS

Se inició con cultivos de las cepas de M. fijiensis C1233, CR4b, Jaguar C3 y OZ1b
reaislados después de la infección in vitro de fragmentos foliares y la aparición de
síntomas , de acuerdo al postulado de Koch , el cual consiste en lo siguiente (Fredricks y
Relman , 1996):

1. El agente patógeno debe estar presente en cada caso de la enfermedad.

2. El agente no debe aparecer en otra enfermedad de manera fortuita.
3. El agente debe ser aislado en un cultivo puro a partir de las lesiones de la
enfermedad , repetidamente.

52
 Capítulo 11

4. El agente debe provocar la enfermedad en un huésped susceptible al ser

inoculado y el agente debe ser aislado de nuevo de las lesiones producidas en el
tejido vegetal de experimentación.

2.2.1.-REAISLAMIENTO DE CEPAS DE M. fijiensis A PARTIR DE

FRAGMENTOS FOLIARES DE BANANO INFECTADOS IN VITRO
(RECUPERACIÓN DE CEPAS SIGUIENDO EL POSTULADO DE KOCH)

Se utilizaron fragmentos foliares del cv Enano gigante, los cuales se inocularon

artificialmente con esporas asexuales, como se describe en los ensayos de infección
(Peraza-Echeverría et al., 2008). La infección se dejó progresar hasta la aparición de
lesiones visibles, correspondientes a la etapa 3 (raya) y las muestras se colectaron bajo
condiciones asépticas en campana de flujo laminar. Se cortó una lesión utilizando bisturí y
se depositó sobre medio Papa Dextrosa Agar (PDA). Se incubó a fotoperiodo hasta que el
micelio emergió de la lesión y prosperó sobre el medio de cultivo.

2.3.- METODOLOGÍA PARA EL PROCESO DE INFECCIÓN IN VITRO DE

FRAGMENTOS FOLIARES DE BANANO

Partiendo de las cepas reaisladas C1233 y Jaguar C3, se realizó la infección

artificial de fragmentos foliares de banano (Enano gigante) infectando con esporas
asexuales de Mycosphaerella fijiensis siguiendo los protocolos a continuación descritos:

2.3.1.- PROPAGACIÓN DE LAS CEPAS DE M. fijiensis

Primero se cortó 1 cm 2 de una colonia crecida en medio sólido y se sembró en

medio sólido V8 (CV8), inoculando 1O colonias en cada caja. El resto de la colonia se
maceró para inocular en medio líquido de caldo de papa dextrosa (PDB) y se creció en un
matraz Erlenmeyer. Después de 3 semanas de crecimiento se tomó una alícuota de 100
1-JI de la biomasa para sembrarla en medio de cultivo V8 sólido (CV8). Parte del material
se crioconservó, como se describe más adelante.

Los cultivos sólidos se incubaron a 2rc y en fotoperiodo de 12h durante 3

semanas, y los cultivos líquidos se mantuvieron 2-3 semanas en agitación a 100 rpm y a
temperatura ambiente.

53
 Capítulo 11

2.3.2.-CONSERVACIÓN DEL MICELIO DE M. fijiensis EN GLICEROL

Después de 3 semanas de crecimiento en medio líquido las cepas se conservaron

en glicerol al 50% , mezclando 500 ¡.JI de muestra y 500 ¡.JI glicerol al 100% y, se colocó en
un tubo Eppendorf de 1.5 mi y se almacenaron a -80°C .

2.3.3.-SIEMBRA DE Mycosphaerella fijiensis EN MEDIO V8 PARA

ESPORULACIÓN

Durante tres semanas, los cultivos sólidos de M. fijiensis se observaron para

verificar el crecimiento y detectar si hubo contaminación. Después de las tres semanas se
procedió a cortar 1O colonias de cada cepa , tratando de eliminar todo el agar. Las
colonias se depositaron en mortero estéril , se molieron en presencia de agua estéril hasta
observar que la consistencia del macerado fuera una suspensión homogénea. Se sembró
sobre medio de esporulación V8 (EV8) e incubó a 20°C +/- 2°C, con luz blanca y luz negra
constante durante seís días. Se tomó una alícuota del tejido molido, para confirmar la
ausencia de contaminación bacteriana en los siguientes pasos.

2.3.4.- COSECHA DE ESPORAS ASEXUALES

Después de seís días de incubación , se colectaron las esporas asexuales de M.

fijiensis con ayuda de una solución de grenetina al 1% y barriendo la superficie con un
pincel. Después de cosechar todas las cajas, la suspensión de esporas asexuales
obtenida se filtró y colectó en un tubo Falcón . Cuando las cajas se terminaron de
cosechar se volvieron a sellar e incubar nuevamente, para realizar una segunda cosecha
después de otros seís días.

2.3.5.- CONTEO DE ESPORAS ASEXUALES

Para conocer la cantidad de esporas asexuales se procedió a realizar su conteo

con ayuda de un microscopio; las cuantificaciones se realizaron por duplicado en una
cámara de conteo de células Sedwick-Rafter, se promedió las dos lecturas y se aplicó la
siguiente formula :

A= Área del campo (mm 2 )

D= Profundidad del campo (mm)

54
 Capítulo 11

F=Número de campos contados

Células/mi = 2:N X 1000mm 3 X factor de dilución

AXDXF

Nota: Las esporas asexuales obtenidas deben ajustarse para el volumen y concentración
requerida en su uso.

2.3.6.- DETERMINACIÓN DE CONTAMINACIÓN BACTERIANA

Para confirmar la sanidad microbiológ ica de la preparación de esporas asexuales ,

se colocó una alícuota de la suspensión de esporas asexuales en un tubo Falcón que
contenía 5 mi de medio de cultivo Luria- Bertani (LB). El cultivo fue incubado durante 72 h
a temperatura ambiente y agitación constante a 100 rpm. La presencia de turbidez en el
medio de cultivo fue considerada como prueba positiva de contaminación bacteriana y la
nitidez del medio como cultivo limpio.

2.4.- VERIFICACIÓN DE IDENTIDAD DE LAS CEPAS

Debido a que las cepas se reaislaron en el laboratorio a partir de infecciones

artificiales in vitro , se realizó una PCR convencional para confirmar que las cepas fueran
realmente M. fijiensis y no otro hongo que hubiera contaminado el material aislado. La
reacción de PCR fue para un volumen final de 15 1-11 siguiendo la metodología reportada
por Vázquez- Eúan et a/. (2012).

2.5.· PREPARACIÓN DE LOS MEDIOS DE SOPORTE PARA LOS

FRAGMENTOS FOLIARES DE BANANO

Para la infección in vitro de fragmentos foliares de banano, se siguió el protocolo

de EI-Hadrami (2000) modificado por Rodríguez García et a/., (2007) (CICY) .

Primero se procedió a realizar los soportes que consistieron en Agar más

Bencimidazol (A+B). Una parte de estos soportes (A+B) se emplearon para evaluar las
muestras inoculados con la suspensión de esporas asexuales (A+B+H) con la cepa en
estudio (hongo). La otra parte de los soportes (A+B) , sirvieron como testigo positivo
(fragmentos foliares inoculados con grenetina). Los testigos negativos, fueron soportes de
Agar-Agar sin bencimidazol (A+A) con fragmentos foliares inoculados con grenetina.

55
 Capítulo 11

2.5.1.- FRAGMENTOS FOLIARES

Antes de colocar los fragmentos foliares de banano en el soporte de agar el

material vegetal fue sanitizado. Se seleccionaron las hojas más verdes y jóvenes (hojas 2
y 3, considerando a la hoja cigarro como hoja 1), las cuales se cortaron y limpiaron.
Posteriormente se eliminó la nervadura central , quedando las láminas foliares . Las
láminas se desinfectaron, enjuagaron y secaron en campana sobre papel estéril , para
colocarlas en el medio A+B y A+A.

2.5.2.- INFECCIÓN ARTIFICIAL DE LOS FRAGMENTOS CON ESPORAS

ASEXUALES DE M. fijiensis

Para realizar la infección primero se verificó que las esporas asexuales fueran
suficientes. Se ajustó la concentración a 200 esporas asexuales/IJI. Cada fragmento de 25
cm 2 se inoculó con 125 1-11 de la suspensión de esporas asexuales. Con ayuda de un pincel
se procedió a distribuir las esporas asexuales por todo el fragmento .

2.5.3.- TIEMPO DE MUESTREO

Una vez inoculados, los fragmentos se incubaron por 30 días, en condiciones de

fotoperiodo 12 horas luz blanca y 12 horas oscuridad , a 27 oc. Los fragmentos fueron
cosechados a tiempo cero (T 0 ) , inmediatamente luego de la inoculación y se guardó en
Nitrógeno líquido. También se muestreó a los 5, 15 y 30 días post-inoculación.

2.6.- RESULTADOS

La inoculación in vitro de fragmentos foliares; se vió afectada por baja producción

de esporulación de las cepas M. fijiensis, condiciones ambientales , presencia de
contaminación bacteriana en los cultivos de M. fijiensis y la pérdida de capacidad infectiva
de las cepas. Sin embargo, se logró superar estos inconvenientes con las siguientes
estrategias.

Las cepas se recuperaron de las lesiones desarrolladas en los fragmentos foliares

(a través del aislamiento del hongo a partir de material infectado in vitro) , procedimiento al
que se le llamó "recuperación por postulado de Koch". Con respecto a la contaminación

56
 Capítulo 11

bacteriana que presentaron las cepas , se empleó antibióticos (Kanamicina, Cefatoxina,

Ampicilina y Tetraciclina). Es importante mencionar que no fue posible eliminar al 100% la
bacteria, pero si al aislamiento de una hifa limpia. Esta técnica permitió la recuperación de
todas las cepas (Figura 9) C1233 , CR4b, Jaguar C3 y OZ1 b, las cuales se molieron e
inocularon en medio de caldo de papa dextrosa (PDB) para confirmar su asepsia . Se
observó un crecimiento de biomasa a las dos semanas. Posteriormente la biomasa se
transfirió en un medio sólido V8 (CV8), donde se mantuvieron durante 3 semanas, hasta
obtener colonias libres de contaminación que fueron crioconservadas. Se observó que la
cepa C1233 (Figura 9 a) presentó micelio de color rosa , aéreo, algodonoso , con exudado
y de forma oblonga ; la cepa CR4b (Figura 9 b) presentó micelio color rosa pálido ,
aterciopelado, plano , forma circular y alrededor un halo color negro, la cepa Jaguar C3
(Figura 9 e), fue notablemente diferente, debido a su color entre gris y café, textura
aterciopelada abundante, plana y de forma circular; por último la cepa Oz1 b (Figura 9 d)
también presentó micelio color rosa , con menor cantidad de exudado que la cepa C1233 ,
micelio ligeramente aéreo y de forma circular. En la parte inferior todas las cepas
presentaron color negro.

Para cada una de las cepas fueron reactivadas siguiendo el postulado de Koch , se
prepararon 15 tubitos para conservar en glicerol y emplearlas para posteriores
crecimientos.

d)

Figura 9.- Morfología fenotípica de las cepas de Mycosphaere/la fijiensis crecidas en medio CV8 y
recuperadas mediante el postulado de Koch. a) C1233, b) CR4b, e) Jaguar C3 y d) OZ1 b.

57
 Capítulo 11

Durante la reactivación de las cepas de M. fijiensis en medio líquido de caldo papa

dextrosa (PDB) , se observó el crecimiento de biomasa durante seis días de incubación ,
observándose cambio de color de verde oscuro a negro. Las cepas Oz1 b (Figura 1O d) y
CR4b (Figura 1O b), produjeron mayor cantidad de biomasa ; sin embargo, la cepa Jaguar
C3 (Figura 10 e), presentó una biomasa de estructura cilíndrica bien definida y de mayor
tamaño, la cepa C1233 (Figura 1O a) creció lentamente y generó menor cantidad de
biomasa.

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e)
Figura 10.- Cepas de Mycosphaerella fijiensis , inoculadas en medio PDB. Las cuales resultaron
libres de contam inación bacteriana , a) C1233, b) CR4b, e) Jaguar C3 y d) OZ1 b.

Además de la prueba LB para verificar que las cepas estuvieran libres de

contaminación , también se confirmó que fueran Mycosphaerella fijiensis amplificando
mediante PCR convencional el gen de actina de M. fijiensis, empleando cebadores
específicos (Arzanlou et al., 2007). En la figura 11 , se puede observar que el ADNg
amplificó el fragmento de tamaño esperado con cada una de las cepas reaisladas.

La cepa , Jaguar C3 mostró un fenotipo muy diferente (Figura 9, inciso e) en

comparación con las otras cepas (C 1233, OZ1 b y CR4b ), pero el análisis por PCR
confirmó que es M. fijiensis . En la figura 11 , se observa que las bandas fueron únicas y de
tamaño esperado (300 pb ). La cepa C1233 presentó una banda muy intensa con respecto
a las demás, posiblemente por una mejor calidad de la muestra de ADN , ya que el

58
 Capítulo 11

templado se observó más claro, en comparación con los demás. En cada caso se
depositó 5 !JI de la reacción de PCR en el gel de agarosa.

1 2 3 4 5 6 7

Figura 11.-Confirmación por PCR de la identidad de las cepas reaisladas de hojas de banano
infectadas in vitro. Todas dieron positivo a M. fijiensis . El carril 1: Marcador de peso molecular, 1kb
plus; 2: cepa C1233; 3: cepa CR4b; 4: cepa Jaguar C3 ; 5: OZ1 b, 6: Testigo negativo (H 2 0) y 7:
Testigo positivo (ADNg de la cepa Veracruz) .

Una vez confirmado que las cepas eran M. fijiensis , se continuó con los objetivos
de la tesis. Se procedió a infectar de manera independiente fragmentos foliares del cv
Enano gigante, con la cepa M. fijiensis Jaguar C3 proveniente de manejo intensivo y con
la cepa M. fijiensis C1233 , proveniente de manejo rural.

La infección de fragmentos in vitro del cv Enano gigante con la cepa M. fijiensis

Jaguar C3 , (Figura 12) mostró que el primer punto de muestreo (T 0 ), los fragmentos se
ven húmedos o muy mojados debido a la solución de esporas asexuales (A+B+H) , o por
la solución de grenetina (A+B-H y A+A-H). A los 5 días después de la inoculación el tejido
foliar mostraba todavía una condición fisiológica adecuada (color verde fuerte, hojas
frescas , grandes y ligeros residuos de grenetina), pero asintomática , es decir no presentó
ningún síntoma de la enfermedad Sigatoka negra.

Los primeros síntomas visibles se observaron a los 15 días. Se observó la

presencia de unos puntitos entre color café y rojo marrón, que corresponde a la etapa 1
de SN de acuerdo a Fouré (1985) citado por Henderson et al. , (2009) , sobre todo en los
extremos del fragmento ; los puntos fueron visibles tanto en la parte abaxial como adaxial.

59
 Capítulo 11

A los 30 días se observó la presencia de manchas oscuras , bien definidas y de pequeñas

rayas en el centro, así como el crecim iento de micelio sobre la parte abaxial del fragmento
foliar. Con respecto a la parte adaxial , se observaron manchas, ya que las rayas no se
apreciaban visualmente, debido al color de la senescencia del fragmento.

JaguarC3

A+B+H A+B-H A+ A-H

TO

T5

T15

T30

Figura 12.- Fragmentos del cv E. gigante infectados, con la cepa M. fijiensis Jaguar C3. Muestras
cosechadas a los O, 5, 15 y 30 días. El T 0 se observa el fragmento húmedo debido a la grenetina ,
pero sin ningún síntoma ; T 5 no presentó ningún síntoma ni de humedad ; T 15 , presentó pizcas color
café-marrón y el T 30 , manchas oscuras y pequeñas rayas , y también crecimiento superficial del
hongo y la presencia de un color café oscuro en partes de la hoja , debido a la senescencia.
Muestra : Agar más bencimidazol más hongo, Jaguar C3 (A+B+H ). Testigo positivo: Agar más
bencim idazol menos hongo (A+B-H). Testigo negativo: Agar-agar menos hongo (A+A-H ).

60
 Capítulo 11

En los testigos negativos (A+A-H) el estado fisiológico de los fragmentos

disminuyó drásticamente. Pasó de un color verde fuerte correspondiente al tiempo cero a
un verde pálido en los primeros 5 días, luego un color amarillo hasta adquirir un color café
a los 30 días. Mientras que los testigos positivos (A+B-H), también disminuyeron su color,
pero en menor grado, es decir, pasaron de un color verde fuerte a un verde ligeramente
pálido y los fragmentos mantuvieron su viabilidad hasta los 30 días de muestreo. Con
base en los testigos y las muestras de infección por triplicado, se puede sugerir que los
daños ocasionados en los fragmentos foliares pueden atribuirse a la virulencia de la cepa
M. fijiensis Jaguar C3, debido a que no se encontró ninguna lesión igual, en los controles.

Una vez terminado el experimento de infección con la cepa Jaguar C3, se procedió
a infectar fragmentos con la cepa C1233 , cv Enano gigante. En la figura 13, los
fragmentos foliares correspondientes al T 0 , se ven mojados ya que fueron muestreados
inmediatamente después de la inoculación, ya sea con la suspensión de esporas
asexuales o con la grenetina ; se observó a los 5 días que no hubó síntomas de Sigatoka
negra y los fragmentos ya estaban secos. A los 15 días, se presentaron los primeros
1

síntomas de la enfermedad , en forma de puntos muy pequeños, color café oscuro ,

correspondiente a pizcas. En los extremos de los fragmentos se presentó mayor cantidad
de estas lesiones, las cuales eran ligeramente visibles, solamente en la parte abaxial.
Finalmente al realizar el ultimo muestreo a los 30 días, los puntos muy pequeños, color
café oscuro presentes en el T 15 , se convirtieron en pequeñas estrías y unos cuantos en
lesiones tipo raya; dichos síntomas fueron visibles tanto en la parte abaxial y adaxial del
fragmento infectado con la cepa C1233.

Con respecto al testigo positivo, se observó que efectivamente el bencimidazol

retardó la senescencia. Al igual que en primer experimento, las lesiones solo fueron
visibles en los fragmentos infectados, apoyando que las lesiones fueron provocadas por la
cepa C1233. El control negativo (A+A-H) continuó cambiando de color, de tal forma que
los fragmentos senecen antes de llegar el mes porque el medio no contenía bencim idazol.

61
 Capítulo 11

C1233
A+B+H A+B-H A+A-H

TO

T5

T15

T30

Figura 13.- Fragmentos del cv E. gigante infectados , con la cepa M. fijiensis C1233. Muestras
cosechadas a los 5, 15 y 30 días . El T0 se ve húmedo por la presencia de grenetina; el Ts no
presentó ningún síntoma ni humedad; T 15 , presentó puntitos color café y al T 30, estos puntos se
convirtieron en pequeñas estrías y unos cuantos en lesiones tipo raya . Testigo positivo: Agar más
bencimidazol menos hongo (A+B+H) y Testigo negativo: Agar-agar menos hongo (A+A-H).

Con base en los resultados de las infecciones del cv Enano gigante, se pudo
observar que la cepa Jaguar C3 resultó más virulenta que la cepa C1233, debido al mayor
daño ocasionado, al tamaño de lesiones presentes y al resultado fenotípico (pequeñas
manchas, rayas en el centro del fragmento y crecimiento epifilo) que se observó a los 30

62
 Capítulo 11

días, para el caso de la cepa Jaguar C3. Sin embargo el estudio comparativo puntual de
dos cepas no permite llegar a alguna conclusión.

2. 7.- DISCUSIÓN

Durante el desarrollo de este trabajo, el experimento de infección de plantas de

banano en invernadero tuvó que abortarse , debido a la baja producción de esporulación y
a la pérdida de capacidad infectiva de las cepas M. fijiensis. Esto se debió a la presencia
de bacteria en los cultivos y al alto número de resiembras que tenían las cepas. Se
observó que a medida que se incrementó el número de subcultivos, disminuyó la
producción de esporas asexuales, independientemente del lugar de donde fueron ailsadas
las cepas, lo anterioro se vió fortalecido por Cruz-Martín y colaboradores (2004 ), quienes
encontraron exactamente lo mismo que en este trabajo, al evaluar el efecto del número de
subcultivos sobre la esporulacion de Mycosphaerella fijiensis , observaron diferencias
significativas en el número de esporas asexuales producidas entre aislados con diferentes
números de subcultivos in vitro , está influyó negativamente en la cantidad de esporas
asexuales producidas por M. fijiensis y fue independiente de los aislados evaluados. En
un trabajo realizado por Acosta y colaboradores (2004 ), también observaron que la
producción de esporas asexuales de M. fijiensis se limitó por el carácter variante de la
esporulación in vitre y por los subcultivos sucesivos.

Trabajos realizados previamente por Cruz et al. , (2011 ), Singgih-Wibowo (2006) y

Cruz et al. , (2004) , no recomiendan usar cultivos con más de cuatro resiembras. Algunas
desventajas de los subcultivos son la posible variación genética, debido a la transferencia
repetitiva en los medios de cultivo, la pérdida de patogenicidad , cambios en la morfología
o fisiología, y se corre mayor riesgo de contaminación debido a la constante manipulación
(Singgih-Wibowo , 2006). Por lo tanto es de suma importancia no usar cepas con más de
cuatro subcultivos , y emplear la prueba de ausencia bacteriana en el cultivo fúngico para
evitar que baje la producción de esporas asexuales.

Debido a todo lo anterior, se recomienda crioconservar las cepas y dosificarlas en

alícuotas, con el fin de partir de muestras frescas y viables . También realizar la
recuperación periódica de las cepas a partir de material infectado in vitre ("postulado de

63
 Capítulo 11

Koch"), para asegurarse que se inicia con material fúngico limpio, viable y sin deterioro de
su capacidad virulenta .

Los resultados de este trabajo demostraron que las cepas pueden infectar
nuevamente, después de ser reaisladas , debido a que son nuevamente viables y frescas.
Las características morfológicas de las cepas M. fijiensis observadas en medio sólido
corresponde a lo reportado por Stover (1976) y Manzo-Sánchez (2001 ), ambos
observaron que el crecimiento de M. fijiensis fue muy lento hasta de 14 días, las colonias
tuvieron micelio aéreo variable desde color blanco , rosado y gris, apariencia algodonosa ,
redondas y al reverso de la caja Petri las colonias presentaban color negro, tal como
mencionamos anteriormente en nuestras cepas. Mientras que en medio líquido, los
resultados fueron similares a las observadas por Manzo-Sánchez (2005) quien observó
pequeñas colonias cilíndrica, de color negro, crecimiento lento y en menor cantidad que
en el medio líquido V8, donde efectivamente se forma mayor cantidad de biomasa y
muchas veces de forma irregular.

Con respecto al material vegetal de banano a infectar, se recomienda usar plantas

de 3 a 4 meses de edad, la hoja número dos y tres, considerando como número uno la
hoja cigarro. Las plantas deben contar con una fisiología adecuada , contar con más de
seis hojas, que presenten un color verde fuerte , hojas largas, vigorosas y sin ningún daño
mecánico; es importante recalcar que para el caso de banano, cada cultivar tiene una
manipulación especial.

Es por ello que se precisa estandarizar las condiciones para su obtención in vitro.
En ese trabajo los autores observaron que las esporas asexuales de M. fijiensis, pueden
ser obtenidos in vitro a 20 oc a partir de 1O días de incubación en los medios de cultivo
Agar Papa Zanahoria , Agar V-8 modificado y Agar Papa Dextrosa. No obstante , la mayor
concentración de las esporas asexuales se alcanzó en Agar Papa Dextrosa a los 20 días
de incubación a 20 oc, y mediante la inoculación artificial con suspensiones de esporas
asexuales y fue posible obtener los síntomas sobre los cultivares Enano gigante y FHIA-
18. En este caso se usó el medio de esporulación V8 reportado por Peraza-Echeverría y
colaboradores (2008). Con base en la experiencia en el presente trabajo, para inducir a la
esporulación debe considerarse no usar más de 20 colonias de la cepa, por mortero en la

64
 Capítulo 11

maceración, así como eliminar cajas de esporas asexuales que presenten una textura
brillosa o de color café y apariencia húmeda, ya que son características de presencia de
contaminación.

En cuanto a las condiciones ambientales para el crecimiento y esporulación de M.

fijiensis es importante regular la intensidad de luz, según lo reportado por Peraza-
Echeverría y colaboradores (2008). Las cepas deben mantenerse en fotoperiodo de 12 h
luz y 12 h oscuridad, no obstante otros autores han variado las condiciones y también han
obtenidos buenos resultados. Por ejemplo Sepúlveda (2009) usó un fotoperiodo de 15
días de oscuridad y 15 días de luz, para el crecimiento de Mycosphaerella fijiensis . En
este trabajo, es de suma importancia considerar la estación del año en que se realiza el
experimento, ya que las condiciones externas influyen en el cuarto de incubación , por lo
que es recomendable contar con un higrómetro para controlar la humedad alrededor del
92% y la temperatura debe oscilar en 20°C +/- 2°C. Estos termómetros deben colocarse
en el lugar de las muestras, para asegurarse que las condiciones sean homogéneas y no
varíen de un lugar a otro. Estar prevenidos de fallas eléctricas y registrar la intensidad de
las lámparas que deben oscilar entre 25,7 ¡Jmol/m 2 .s mínimo y 50 ¡Jmol/m 2 .s, de luz
blanca continua y luz negra, correspondiente a la energía radiante emitida cercana a la
ultravioleta. Las lámparas empleadas en este trabajo fueron de la marca LG 15W con una
intensidad de 45 ¡Jmol/m 2 .s. y con la cual se obtuvó eficientemente la esporulación de M.
fijiensis , ésta intensidad es menor a la reportada por Cruz-Martín (2004) quien empleó una
luz fluorescente de 60 ¡Jmoles.m 2 .s- 1 , sin embargo en ambas intensidades se logró la
esporulación .

La determinación de la virulencia, basándose en características fenotípicas del

hospedero, después de una infección , es un método rápido para determinar qué tan
virulento es un patógeno. Por ejemplo Laveau y colaboradores (2009) utilizaron este
método de registro de síntomas, para evaluar el grado de virulencia de diferentes hongos
patógenos del cultivo de vid, aislados de diferentes regiones de Francia. Estos autores
determinaron la virulencia, midiendo el tamaño de las lesiones ocasionadas y
considerando si fueron lesiones internas o externas en el fruto. En el presente trabajo , se
evaluó visualmente la velocidad de aparición de síntomas, el tamaño de las lesiones y el
área dañada (Castellón , 2005) y se concluyó que la cepa de M fijiensis Jaguar C3 fue más

65
 Capítulo 11

virulenta que la cepa C1233, puesto que al T 15 desarrolló estrías visibles tanto en la parte
adaxial como abaxial y al T 30 se observaron pequeñas manchas oscuras , bien definidas,
pequeñas rayas en el centro y crecimiento epifilo , mientras que la cepa C1233 al T 15

presentó puntitos color café y visibles solamente en la parte abaxial y para el T 30 , se

observaron unas cuantas lesiones correspondiente a raya, las cuales se pudieron
observar tanto en la parte abaxial y adaxial del fragmento infectado, nuestros datos fueron
diferentes a lo reportado por Canché-Gómez (2013) quién trabajó con está cepa,
realizando infecciones in vitro en fragmentos foliares, observó que a los 5 días, pizcas y al
día 30 manchas. Posiblemente estas diferencias se deban a la edad de las plantas, o a la
viabilidad de la cepa. Lo que si podemos ver es que el ensayo in vitro de fragmentos
permite reproducir los síntomas correspondientes a la SN, tal como lo reportarán Pérez et
a/. , (2006), Abadie et a/., (2008) y Peraza-Echeverría et a/., (2008) en su momento. Pérez
y colaboradores (2006), describieron el desarrollo de un ensayo de inoculación artificial
sobre fragmentos de hojas de bananos, la cantidad de lesiones y su evolución por
estados durante un ciclo infeccioso, se evaluó en días consecutivos y existió una fuerte
correspondencia entre las curvas de aparición de lesiones en relación con el tiempo en los
fragmentos de hoja in vitro. Abadie y colaboradores (2008) observaron los síntomas
característicos de SN, en fragmentos foliares y en plántulas ; por último Peraza-Echeverría
y colaboradores (2008) observaron la germinación de esporas asexuales de la cepa
C1233 y la penetración de estás, en un máximo de 30 días en el cultivar de Enano
gigante.

Estos análisis pueden hacerse más objetivos incluyendo el uso de algún método
de cuantificación y del análisis estadístico, con lo cual se obtendría una medición más
precisa de los daños en los fragmentos. Sin embargo, con fines prácticos, la evaluación
de la virulencia por seguimiento de los síntomas continúa en uso. En el presente trabajo
estos resultados se tomarán en cuenta en los análisis de los resultados de expresión de
genes, para evaluar si hay correlación entre la virulencia y el tipo de manejo de la finca
donde fueron aisladas las cepas.

66
 Capítulo 11

2.8.- BIBLIOGRAFÍA

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69
 Capítulo 111

CAPÍTULO 111

EXPRESIÓN DE GENES AVR4 Y ATR4 EN CEPAS DE MYCOSPHAERELLA

fijiensis

3.- EXPRESIÓN DE GENES DE M. fijiensis POR PCR EN TIEMPO REAL

3.1.- INTRODUCCIÓN

En todos los organismos vivos, las células regulan sus actividades mediante la
activación o inactivación de la expresión de genes (fuerte, moderada o débil). Cuando se
trata de identificar la presencia de productos celulares específicos , es importante analizar
cuantitativamente el transcrito, ya que este es traducido para formar proteínas. Por lo
tanto, aunque no siempre correlaciona , es posible obtener datos relativos a la producción
de proteínas con base en la expresión de los genes que las codifican (McPherson et al.,
2008). Para el análisis de la expresión génica se ha empleado el Northern blotting , pero
su principal desventaja es que requiere grandes cantidades de ARN (McGuire et al.,
2004 ). Sin embargo, durante los últimos años a surgido una nueva técnica denominada
reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT -PCR), también conocida como
RT-PCR cuantitativa (qRT-PCR); es una variante de la PCR convencional. La RT-PCR
cuantitativa se ha utilizado para la detección y cuantificación de bacterias y hongos
patogénicos , identificación de mutaciones o polimorfismos, detección de carga viral o de
transgénicos, entre otros estudios (Valasek y Repa , 2005).

La qRT-PCR tiene la ventaja de registrar el progreso de la reacción, gracias a la

fluorescencia emitida por un fluoróforo durante la ampl ificación en cada ciclo, es capaz de
cuantificar moléculas del ADN o ADN complementario (ADNc), aún cuando están en
pequeñas cantidades. Permite una cuantificación precisa , rápida , sensible , confiable ,
altamente eficiente y reproducible (Derveaux et al. , 2010; Teste et al., 2009; Gibson et al.,
1996).

La qRT-PCR detecta el producto utilizando fluoróforos (Walker, 2002) , por ejemplo

el Bromuro de Etidio, SYBR Gold o el SYBR Green 1 (Figura 14 a) siendo este último el
más utilizado (Ririe et al., 1997; Heid et al., 1996). Este proceso consiste en añadir un
fluoróforo que es afín al ADN de doble cadena (ADNdc), de tal forma que al ser excitado
con una fuente luminosa, genera y emite fluorescencia , la cual es detectada por el

71
 Capítulo 111

sistema óptico del equipo. La fluorescencia aumenta en función de que el producto de

PCR en tiempo real se acumula en cada ciclo de reacción , permitiendo la cuantificación
de la concentración del ADNdc con respecto al templado inicial. Sin embargo, el principal
inconveniente de los agentes intercalantes es su baja especificidad (Lee et al. , 2004). Otro
tipo de marcadores que se utilizan son las sondas ; oligonucleótidos cuya secuencia es
complementaria a la región central del amplicón , y en el extremo 5' posee un fluoróforo
llamado reportero y en el extremo 3' un apagador también conocido como "quencher"
(Figura 14 b). La fluorescencia del reportero es reducida por el quencher mediante FRET
(Transferencia de energía por resonancia de fluorescencia) cuando la sonda se encuentra
intacta. Pero cuando la sonda hibrida a su cadena complementaria , la actividad 5'-
exonucleasa de la ADN Polimerasa corta en el extremo 5' la unión del reportero con la
cadena , separándolo del quencher, lo cual permite que se emita la fluorescencia.

b) Sondas die hid~róli sls

•-.
Figura 14.- Marcadores de PCR en tiempo real a) Fluoróforos de unión al DNA; b) Sondas de
hidrólisis . Modificado por Rivas-Romero (201 0), de Wong y Medra no (2005).

La PCR en tiempo real permite analizar los datos de manera cuantitativa,

analizando una curva de amplificación en la que se representa la fluorescencia en relación
al número de ciclos de la PCR. La curva consta de 3 partes:

a) Fase geométrica , donde la fluorescencia cambia a medida que se forman los

productos, la eficiencia de amplificación es muy cercana a 100% y la cinética de
amplificación tiene un comportamiento que sigue la fórmula 2n. Es decir, que el segmento
de ADN se amplifica de manera exponencial , ya que en cada ciclo se duplica la cantidad
existente. El ciclo en el cual la fluorescencia ha alcanzado el umbral de detección se
conoce como Ct (Cyc/e Threshold o Ciclo umbral) y es inversamente proporcional al

72
 Capítulo 111

número de copias del blanco (Applied Biosystems, 2009; Stock et al., 2006). Este valor
representa la cantidad de templado inicial que hay en la reacción y es usado en los
cálculos posteriores. Así mismo, es importante considerar que un valor Ct superior a 40
ciclos indica que no hay amplificación y por consiguiente no deben incluirse en los
cálculos (Dorak, 2008).

b) Fase lineal, los componentes de la reacción comienzan a ser factores limitantes

y hay un decaimiento de la actividad enzimática (Ambion 2008; Fraga et al., 2008).

e) Fase estacionaría , donde no se distinguen cambios en la fluorescencia a pesar

de que se siguen acumulando productos (Ambion 2008; Fraga et al., 2008).

Considerando la cantidad de templado inicial y la eficiencia de amplificación , la

ecuación que describe la cinética de amplificación en la PCR en tiempo real es:

P= T*(1 +E)"
P= Cantidad de producto generado al ciclo n
T= Cantidad de templado inicial
E= Eficiencia de amplificación

Debido a que la eficiencia de amplificación en la fase geométrica es 100%, la

ecuación se reduce a: P= T*2".

3.2.- TIPOS DE CUANTIFICACIÓN EN LA QRT -PCR

Para llevar a cabo la cuantificación de la expresión genética mediante PCR en

tiempo real comúnmente se emplean dos tipos de cuantificaciones; la cuantificación
absoluta y la cuantificación relativa, dependiendo del objetivo de estudio.

En la cuantificación absoluta, se determina la concentración o cantidad inicial del

templado , usando un estándar (muestra cuya concentración inicial es conocida) , la cual es
utilizada para obtener una curva estándar (curva realizada con diluciones seriales a partir
de una concentración del estándar). La curva estándar se representa gráficamente como
la regresión sem i logarítmica del valor Ct promedio de cada dilución , contra el logaritmo
de la cantidad de muestra empleada en ese punto. Este método asume que la curva
estándar y las muestras tienen eficiencias de amplificaciones aproximadas , además de

73
 Capítulo 111

que las concentraciones deben estar dentro del rango dinámico (intervalo de las
concentraciones mínimas y máximas de la muestra en las que se cumple la amplificación
geométrica 2n) (Wong y Medrana, 2005, Pfaffl. , 2001 y Bustin , 2000).

La cuantificación relativa proporciona un porcentaje del incremento o disminución

en la expresión génica; los cálculos se miden en función de un calibrador (muestra
control , bajo las mismas condiciones experimentales, que se considera expresión basal y
contra las que se compara la expresión en la condición de estudio. La expresión del gen
de interés se normaliza (estandariza) en función de un gen de referencia o endógeno
(también conocido como house-keeping gene y cuya expresión es constitutiva) por
ejemplo actina o tubulina , para su normalización (Pfaffl. , 2001 ; Bustin , 2000) . Existen dos
formas para realizar la cuantificación relativa, la primera es la cuantificación relativa con
curva estándar y la segunda es el método de t:.t:.Ct.

Para el caso de la cuantificación relativa con curva estándar, se requiere que en

cada reacción del experimento se tenga una curva estándar, la ventaja es que este
método no requiere validación , es decir no es necesario que el gen de interés y el gen de
referencia (endógeno) , tengan las mismas eficiencias de amplificación . Esto genera mayor
consumo de reactivos y espacio , por lo que solo es recomendable cuando el número de
muestras es pequeño. Para el método de t:.t:.Ct, primero se debe hacer la validación , es
decir, la eficiencia de amplificación del gen de interés y la del gen de referencia
(endógeno) deben ser muy similares entre sí, la pend iente de la recta debe ser entre -0.1
a 0.1 para aprobar la validación (Pfaffl , 2008 ; Pfaffl , 2001 ; Livak y Schmittgen , 2001 ). Este
método no requiere curvas estándar en cada reacción , lo cual es benefico en ahorro de
reactivos y se tiene disponible mayor espacio en la placa; es ideal para la cuantificación y
anál isis de muchas muestras. Las eficiencias deben ser cercanas al 100%; cuando la
eficiencia es de 100% se obtiene un incremento de 1O veces la cantidad del amplicón
cada 3.32 ciclos. La eficiencia de amplificación se estima a partir de la pendiente obtenida
en la gráfica, por lo que si la pendiente es de -3.32 equivale a una eficiencia del 100%
(Applied biosystems , 2009). La fórmula para calcular la eficiencia es:

E= ( 1o -1/pendiente _1) x1OO

74
 Capítulo 111

La activación de la transcripción de los genes puede ser a través de diversos mecanismos

de respuesta. Para entender todos estos aspectos es necesario realizar estudios
funcionales y analizar qué genes se expresan en la interacción patógeno-hospedante .

En el presente trabajo se empleó la PCR en tiempo real para evaluar el

comportamiento de la expresión de los genes MfAtr4 y MfAvr4 en cepas de M. fijiensis
aisladas del cultivar Enano gigante de fincas bananeras con manejo intensivo y rural de
fungicidas.

Cuadro 8.- Cepas evaluadas mediante PCR tiempo real

Cepa aislada del Manejo de

cultivar Enano
gigante fungicida
C1233 Ausente
Oz1B Ausente
CR4B Semi intensivo
Mancozeb
Calixin
Bravo 720
Jaguar Intensivo
Mancozeb
Estrobilurina
Triazoles

3.3.-MATERIALES Y MÉTODOS

3.3.1- EXTRACCIÓN DE ARN

Para la extracción de ARN se utilizaron fragmentos foliares del cultivar Enano

gigante, infectados con cepas M. fijiensis C1233 , CR4b, Jaguar C3 y OZ1 b. Para el cv
Calcuta IV los fragmentos fueron infectados con las cepas M. fijiensis CR4b, Jaguar C3 y
OZ1 b. Estos materiales fueron proporcionados por el grupo de la Dra. Rodríguez-García ;
no se pudo completar la comparación porque el material Calcutta IV inoculado con C1233
se utilizó en otros estudios.

El ARN se extrajo según Kantún-Moreno et al. , (2013). La pastilla resultante se

lavó con etanol 75% , se resuspendió con 10-301-JI de H2 0 DEPC y se guardó a -80°C .

75
 Capítulo 111

3.2.2.- EXTRACCIÓN DE ARN DE MICELIO

También se llevó a cabo la extracción del ARN de micelio, empleando Trizol

(lnvitrogen) de acuerdo a Islas-Flores et al. (2006). Este ARN se empleó para realizar la
curva estándar de los genes A VR4 y A TR4.

3.2.4.- DIGESTIÓN DEL ARN

Previo a la qRT-PCR, el ARN se cuantificó con nanodrop e inmediatamente se

trataron las muestras con la enzima DNAsa ; este procedimiento consiste en eliminar
restos de ADN contaminante de la extracción del ARN , empleando la enzima DNasa 1
(Sigma). Este paso es esencial para evitar la amplificación de moléculas de ADN
contaminante que pudiera encontrarse en la solución de ARN . Para verificar la eliminación
del ADN se hizo una PCR convencional amplificando con los cebadores PTR1 y PTR2 de
Actina diseñados por Kantún-Moreno. Posteriormente se volvió a cuantificar el ARN
tratado y se ajustó a la concentración necesaria para el análisis de expresión génica.

3.2.5.- PCR TIEMPO REAL

Para la cuantificación de la expresión se empleó la cuantificación relativa con

curva estándar. Primero se realizó una curva estándar, partiendo del ARN de micelio,
haciendo diluciones seriales para estandarizar la curva. Las reacciones de amplificación
se realizaron empleando el equipo PCR tiempo real Step One Plus , de 96 pozos y usando
el kit TaqMan® RNA-to-Cr rM 1 Step Kit, siguiendo las instrucciones del proveedor Applied
Biosystems. Las condiciones de corrida de la qRT -PCR fueron 15 min a 48 oc, seguido
por 1O min a 95 oc, 15 min a 95 oc y 1 h a 60 oc, 40 ciclos . Y como gen de referencia se
uso el gen de ¡3-Tubulina.

El análisis estadístico se realizó con ayuda del paquete estadístico SAS versión
9.1 , Minitab 16 y Statgraphics; se realizó un análisis de varianza (ANOVA) , empleando la
prueba Tukey.

76
 Capítulo 111

3.4.- RESULTADOS

En la figura 15, se ilustra el ARN , obtenido a partir de fragmentos foliares de

banano infectados con las cepas M. fijiensis aisladas de fincas con manejo rural (Figura
15a- C1233) e intensivo de fungicidas (Figura 15b- CR4b ). En la parte superior del gel , se
observan trazas de ADN genómico, más abajo se ven 2 bandas correspondientes a la
subunidades 28S y 18S respectivamente, lo cual confirma la presencia del ARN extraído.
Las trazas de ADN observadas en la parte superior del gel fueron eliminadas
posteriormente al tratar las muestras con DNasa l. Su verificación se observa en la figura
16.

a)

28S .......
18S .......

b)

28 S --.ot
18 S --.ot

Figura 15.- ARN obten ido de fragmentos cv Calcuta IV y E. gigante infectados con cepas de M.
fijiensis . En el panel A se observa ARN provenientes de fragmentos del cv. Calcuta IV infectados
con la cepa CR4b, carriles 1-2:T 0 ; carriles 3-4:T5 ; carriles 5-6:T 15 ; carriles 7-8: T30 . En el panel B
fragmentos del cv. E. gigante infectados con C1233 los carriles: 1-2: T 0 ; carriles 3-4:T5 ; carriles 5-6:
T 15 ; carriles 7-8 :T3o·

77
 Capítulo 111

En la figura 16 se observa la prueba del resultado de digestión del ADN en las

muestras de ARN. Se realizó una prueba de reacción de PCR convencional. El resultado
esperado para las muestras en las que se digirió todo el ADN es amplificación negativa,
es decir ausencia de banda. En algunos carriles se puede observar la banda de
amplificación (carriles 3-4, T5 ; carriles 7-8, T 15 ), lo cual indica que las muestras no fueron
digeridas completamente debido a subestimación en la cuantificación , lo que evitó que la
enzima pud iera actuar debidamente, por exceso de ARN . La banda inferior presente en
todos los carriles corresponde a restos de cebadores de la reacción de PCR.

Figura 16.- Prueba de digestión del ADNg en las muestras de ARN . La evaluación se realizó
mediante reacción de PCR (sin enzima RT). El resultado esperado es ausencia de amplificación.
La presencia de la banda (señalada con una flecha ) indica todavía presencia de ADN
contam inante . La banda al final de todos los carriles corresponde a los cebadores.

A continuación se visualizan las muestras de ARN , correspondientes al tiempo 5

de fragmentos infectados con la cepa C1233, CR4b, Jaguar C3 y OZ1 b (Figura 17). Se
observó que todas las muestras se digirieron completamente, ya que ninguna muestra
amplificó en la reacción de PCR. La única banda presente corresponde al control positivo,
ADNg obtenido de la cepa C1233 (carril 12). Este resultado confirmó que las muestras de
ARN estaban limpias de ADNg (Figura 17).

78
 Capítulo 111

1 2 3 4 S 6 7 8 9 10

-
11
. ....
.

E
• • •••
'
-
• •

Figura 17.- Evauación de la digestión de las muestras de ARN, extraído a partir de fragmentos
infectados con cepas de M. fijiensis, T5 . Carril 1 marcador de peso molecular 1kb plus; Fragmento
infectado con la cepa C1233, carril: 2-3; CR4b, carriles 4-5; Jaguar C3, carriles 6-7, Oz1b; carriles
8-9 , carril 1O testigo positivo ADNg C1233

Las muestras de ARN digeridas se ajustaron a la concentración requerida (50

ng/ml), y sirvieron como molde para los análisis de PCR en tiempo real. El método
empleado en la qRT-PCR fue cuantificación relativa con curva estándar. El gen endógeno
empleado fue Tubulina, con una eficiencia de 103.559 % y un coeficiente de correlación
(R2 ) de 0.997, los genes de interés M.f Avr4 y M.f Atr4 tuvieron una eficiencia de 97.644%
y 101.5% y una R2 de 0.997 y 0.996, respectivamente.

En la figura 18, se observa (parte inferior de la gráficas) fotografías

correspondientes a los fragmentos foliares del cultivar Calcuta IV (genotipo resistente),
infectados con la cepa M. fijiensis CR4b (Figura 18 a y e) y M. fijiensis Jaguar C3 (Figura
18 b y d); ambas cepas fueron aisladas de fincas bananeras con manejo intensivo de
fungicidas. El nivel de expresión de los genes Avr4 y Atr4 durante diferentes tiempos de
muestreo, se presenta con gráfica de barras. En el eje X son los tiempos de muestreo
despúes de la inoculación y en el eje Y, el número de veces que se expresa el gen de
interés con respecto al día cero.

79
 Capítulo 111

AVR4

CR4b JAGUARC3

00

a) Tiempo de muettreo
b)
TiHD po de muutreo

ATR4

CR4b JAGUARC3

..
i
~
.
~ '
l5
1
~
o
..
~
l u ]
'i
;¡;

e) Tiempo de muestreo Ti~po de mu@Stl'eO

d)

Figura 18.- Nivel de expresión de los genes Avr4 y Atr4, en fragmentos foliares de banano cv
Calcuta IV, infectados con la cepa M. fijiensis CR4b (azul) y Jaguar C3 (rojo). Inciso a) y b)
expresión relativa con curva estándar del gen AVR4 . Inciso e) y d) expresión relativa con curva
estándar del gen ATR4. Valores en las barras con diferentes letras son significativamente
diferentes, La probabilidad de error fue P= 0.05, determinado con la prueba de Tukey.

Los fragmentos infectados con la cepa CR4b al día cero (inmediatamente después
de inocular) no mostraron ningún síntoma de la enfermedad SN . Cinco días después de la
infección (dpi) se observaron pequeñas y escasas manchas negras (4-6), rodeadas de un
halo incoloro, como agua y puntos color rojizo; 15 días después de la infección, las
manchas ligeramente crecieron , el halo incoloro permaneció y los puntos rojizos
aumentaron alrededor. Al muestrear el día 30 , las manchas mantuvieron su tamaño del
día 15, pero los puntos rojizos aumentaron considerablemente en diferentes partes del
fragmento infectado; posiblemente como una respuesta hipersensible (HR) que no

80
 Capítulo 111

permitió el desarrollo y progreso de las manchas, ocasionadas por el hongo (M. fijiensis
CR4b) .

En cuanto al nivel de expresión los genes Avr4 y Atr4 en las cepas CR4b y Jaguar
C3, se obtuvo lo siguiente:

La expresión en el día cero, de los genes Avr4 y Atr4 fue 1 respectivamente, con
respecto a la expresión de ambos genes (Figura 18-00 ) . Con respecto al gen Avr4 en los
fragmentos infectados con la cepa CR4b (Figura 18a), se observó que los niveles de
expresión aumentaron ligeramente, conforme pasaron los tiempos de muestreo, durante
la interacción planta-patógeno, sin embargo no se encontraron diferencias significativas
entre el día 5, 15 y 30 , después de la infección ; la máxima expresión ocurrió 30 días
después de la inoculación y fue 3 veces más con respecto al día cero. El gen Atr4 (Figura
18 e) incrementó la expresión 2 veces más con respecto al día cero, en cada tiempo de
muestreo que trascurría. Sin embargo, tampoco se encontraron diferencias significativas a
los 5, 15 y 30 días, pero sí con respecto al día cero.

Los fragmentos infectados con la cepa Jaguar C3 (Figura 18 b ), no presentaron

ninguna lesión al día cero, pero se alcanzó a visualizar la suspensión conidial depositada
sobre el fragmento. Al día 5 aparecieron los primeros síntomas, manchas pequeñas; que
no continuaron creciendo debido a una probable HR generada a su alrededor. Con el
paso del tiempo (0 30 ) , el fragmento presentó amarillamiento y un ligero crecimiento del
hongo; cabe recalcar, que solo fue donde se acumuló la suspensión conidial. En cuanto a
la expresión de los genes en esta cepa , durante la interacción banano-M. fijiensis el Avr4
se incrementó y su expresión se mantuvo alta en el día 30 , expresándose 8 veces más
con respecto al día cero. En cuanto a la expresión del gen Atr4 la expresión a los 5 días
post-infección, fue casi 6 veces más alta que el día cero. A los 30 días alcanzó un nivel de
expresión de 9 veces mayor que el día cero; y 3 veces más alta la expresión que en el día
5. Por lo tanto la expresión de este gen en esta cepa, se elevó gradualmente en los 3
puntos de muestreo, encontrándose diferencias estadísticamente significativas entre ellos.
Los fragmentos infectados con Jaguar C3 correspondientes al día 15 no fueron
proporcionados por lo que se perdió el dato del punto intermedio, pero afortunadamente el
patrón de expresión encontrado permite ver el comportamiento del gen.

81
 Capítulo 111

Cabe mencionar que las muestras de ARN de la cepa OZ1 b aisladas de fincas sin
manejo de fungicidas no amplificaron correctamente , por lo que se descartaron y no se
presentan.

Con base a los resultados, en el cultivar Calcuta IV, podemos considerar que
ambas cepas se comportaron como parcialmente virulenta, causaron primeras lesiones a
los 5 días, pero no continuaron avanzando. Con excepción de la cepa Jaguar C3 , donde
se observó un ligero crecimiento micelial epifilo, a los 30 días. Posiblemente porque la
hoja donde se cortó el fragmento, ya estaba senescente, de tal forma que fue una
oportunidad para que el patógeno creciera. Si comparamos la virulencia entre las dos
cepas, la cepa M. fijiensis Jaguar C3 fue más virulenta por presentar mayor cantidad de
lesiones. Asimismo, esta cepa mostró mayor expresión de los genes Avr4 y Atr4. Por el
contrario , cuando se infectó con la cepa CR4b, la expresión de dichos genes no fue tan
fuerte y se observó baja intensidad de infección (lesiones visuales). Posiblemente el
armamento de defensa de este cultivar es más fuerte o se enciende más tempranamente,
lo que no permitió al hongo continuar invadiendo eficientemente, de tal manera que su
crecimiento se vio arrestado con la presunta HR, en los sitios donde produjo la lesión, al
menos con estas 2 cepas.

En la figura 19, se presentan las fotografías de infección correspondientes a los

fragmentos foliares cultivar Enano gigante (genotipo Susceptible), infectados con cepas
provenientes de fincas bananeras sin manejo de fungicidas (M.fijiensis C1233 y OZ1b) y
manejo semi intensivo e intensivo de fungicidas (M. fijiensis CR4b y Jaguar C3), así como
los datos obtenidos del nivel de expresión de los genes Avr4 (Figura 19) y Atr4 (Figura 20)
durante 4 tiempos diferentes de muestreo (O, 5, 15 y 30 días) durante la interacción
banano-fijiensis.

82
 Capítulo JI/

AVR4
Jaguar C3
16
CR4b
"
.
16

"
1l 1 10
10
~
.
.,
1

1
z

00 os 015 030 00 05 015 030

a) Tl~ttt~po de muel'treO b) Tiempo de muestreo

OZlb C1233

00 os 015 030
OS DtS O:JO
Tiempo de muestreo
d)
CJ TINnpO d• mu•nr.o

Figura 19.- Nivel de expresión relativa del gen Avr4, en fragmentos foliares de banano cv Enano
gigante, infectados con diferentes cepas de M. fijiensis. Inciso a: CR4b (azul), b: Jaguar C3 (rojo),
e: Oz1b (verde) y d: C1233 (morado). Valores en las barras con diferentes letras son significativamente
diferentes. La probabilidad de error fue P= 0.05, determinado con la prueba de Tukey.

83
 Capítulo 111

ATR4

CR4b Jaguar
10
2

e ...u
1 1A

.~
..,
12

......
1

1
z OA

·~

Tl~mpo de mue:ltreo
b)
a)

Cl233
OZlb
11

"

..
e 14 e 5

1 1
...
u
~ 10
•• ~
..,• 1

1 • 1
i '
z "

00 D5 015 ... 00 .. 015

Tiempo de muestreo
...
e) Tiempo de muemeo

Figura 20.- Nivel de expresión relativa del gen Atr4 , en fragmentos foliares de banano cv Enano
gigante , infectados con diferentes cepas de M. fijiensis. Inciso a: CR4b (azul), b: Jaguar C3 (rojo),
e: Oz1b (verde) y d: C1233 (morado). Valores en las barras con diferentes letras son
significativamente diferentes, La probabilidad de error fue P= 0.05, determinado con la prueba de
Tukey.

Los fragmentos foliares cv Enano gigante, inoculados con la cepa CR4b (parte
inferior de las gráfica) no reflejaron síntomas de Sigatoka negra (SN) al día cero ; 5 días
después de la infección se observaron los primeros síntomas de la enfermedad SN ,
correspondientes a pizcas (pequeños puntos color café oscuro) en las esquinas del
fragmento; al segundo muestreo (0 15 ) las pizcas aumentaron considerablemente
dispersándose por todo el fragmento foliar, además cambiaron a color negro que más
tarde (0 30 ) se convirtieron en rayas y manchas; además presentó crecimiento de micelio
epifilo. En cuanto a la expresión génica del gen Avr4, para la cepa CR4b (Figura 19 a) a
los 5 días la expresión se elevó 13 veces más que el día cero y descendió a la mitad (6

84
 Capítulo 111

veces) al día 15, donde al parecer se mantuvo hasta el día 30 ; no se encontró diferencias
estadísticamente significativas a los 15 y 30 días de muestreo. En la figura 20a, se
encuentra la expresión del gen Atr4, la expresión aumentó (1 .5 veces) 5 días después de
la inoculación con respecto al día cero ; sin embargo a los 15 y 30 días la expresión fue
baja.

En los fragmentos foliares cv Enano gigante, inoculados con la cepa Jaguar C3

(Figura 19 b y 20 b), no se encontraron lesiones en el día cero ni al día 5 del muestreo; al
día 15 se observaron estrías color rojizas en el centro del fragmento , el cual comenzaba a
presentar senescencia , la cual fue notablemente visible al día 30. Las estrías observadas
en el día 15, se volvieron rayas negras y se observó una mancha clorótica al día 30 y
micelio color blanco en la parte central del fragmento. En cuanto a la expresión del gen
Avr4, en esta cepa M. fijiensis Jaguar C3 (Figura 19 b). Su mayor expresion fue a los 5
días, incrementándose 14 veces respecto a 0 0 , y entre 7 y 9 veces en los días 15 y 30
respectivamente. Se encontró diferencias significativas entre los 4 puntos de muestreo y
el patron de expresión fue de mayor a menor, presentándose el máximo nivel de
expresión a los 5 días. Con respecto al gen Atr4 (Figura 20 b), se encontraron diferencias
estadísticamente significativas entre 0 0 y 0 5 , pero no entre D15 y 0 30 . En el día 5, el gen
Atr4 se expresó 3 veces más con respecto al día cero , al día 15 la expresion fue 7 veces
más elevada que el día cero y en el último punto de muestreo (0 30 ) se mantuvo
aumentando, aunque estadísticamente no se encontró diferencia con D1 5 .

Los fragmentos foliares cv Enano gigante, inoculados con la cepa Oz1 b, no

reflejaron ningún síntoma de SN al día cero , tal como se mencionó en las otras cepas.
Pero si se alcanzó a observar, la suspensión conidial depositada sobre el fragmento. A los
5 días después de la inoculación, todavía se alcanzó a ver, la suspensión de esporas
asexuales entre las venas del fragmento y también lesiones correspondientes a pizcas.
Las cuales se convirtieron rápidamente en estrías y rayas por todo el fragmento , al día 15.
A los 30 días, el fragmento presentó senescencia , manchas color negro y abundante
micelio, color blanco, sobre el fragmento . La expresión del gen Avr4 (Figura 19 e) al día 5
fue 3 veces más alta que el calibrador; al día 15 continuó elevándose 2 unidades más que
al día 5 y finalmente descendió a 1.5 veces el día cero en el día 30 , donde no se encontró
diferencia estadística con el día cero. Si observamos el comportamiento del gen Atr4

85
 Capítulo 111

(Figura 20 e) , se observó un patrón de expresión ascendente, 5 días posteriores a la

infección la expresión de este gen se elevó 5 veces más que el día cero , se incrementó 2
unidades más en el día 15 día después de la inoculación y en el muestreo a los 30 días la
expresión aumentó 13 veces arriba del día cero.

Por último los fragmentos infectados con la cepa C1233 , mostraron que al realizar
el primer muestreo, no se encontró ninguna lesión; al muestrear por segunda ocasión
(D 5 ) , el fragmento tuvo pequeñas pizcas, las cuales a los 15 días crecieron en tamaño y
aumentaron en todo el fragmento. Por último, al día 30, las lesiones cambiaron a estrías.
Con respecto al nivel de expresión del gen Avr4 (Figura 19 d) al día 5, la expresión fue 4
veces más con respecto al día cero, se observó un patrón descendiente y no se encontró
diferencia significativa entre D5 y D15 , aunque la expresión del D15 disminuyó 2 veces al
compararlo con el día 5 y continuó disminuyendo hasta tener un nivel de expresión de 1.5
veces más que D0 . Asimismo el gen Atr4 (Figura 20 d) mostró un patrón similar al Avr4, el
Atr4 D5 tuvo su mayor punto de expresión (4 veces vs día cero). En el día 15 y 30 se
expresó casi 3 y 2 veces, más arriba que el D0 .

Con base en los resultados , las cepas Jaguar C3 y CR4b aisladas de fincas
bananeras con manejo semi intensivo e intensivo, presentaron mayor nivel de expresión
del gen Avr4 en el cv Enano gigante. Mientras que para el gen Atr4 las cepas Jaguar C3 y
Oz1 b fueron las que presentaron mayor nivel de expresión , es decir una proveniente de
manejo intensivo y una sin manejo de fungicidas . Por otro lado también se observó que
los niveles de expresión no siempre correlacionan con el daño causado en los fragmentos
por las cepas al menos en el cultivar Enano gigante.

86
 Capítulo 111

3.5.- DISCUSIÓN

Los fragmentos fol iares provenientes del cv Enano gigante infectados , por
separado, con la cepa M. fijiensis Jaguar C3 (manejo intensivo) y M. fijiensis CR4b
(manejo sem i intensivo), man ifestaron los niveles más altos de expresión del gen AVR4,
13 y 14 veces más que el 0 0 . Mientras los fragmentos inoculados con la cepa OZ1 b y
C1233 , provenientes de fincas sin manejo de fungicidas , presentaron los niveles más
bajos de expresión del Avr4. Al parecer estos datos podrían sugerir que efectivamente, los
fungicidas ejercen presión sobre las cepas e indicar una mayor capacidad de estas cepas
a generar transcritos del AVR4 , así como una mayor velocidad de infección que con las
cepas aisladas de fincas sin manejo de fung icidas , sin embargo falta evaluar un mayor
número de cepas y realizar otros estudios que permitan confirmar dicha aseveración. Por
otro lado, se observó que aunque hubó mayor nivel de expresión del gen Avr4 en los
fragmentos inoculados con las cepas M. fijiensis Jaguar C3 y M. fijiensis CR4b , éste no
coincidió con el daño en el fragmento , el cual fue menor. Probablemente la expresión de
este gen no está directamente relacionada con el daño visible causado por el hongo, sino
posiblemente con su velocidad de colonización y la cantidad de biomasa en la fase
biotrófica. Esta teoría se refuerza con los reportes de Qi y Yang , (2002) en Magnaporthe
grisea en arroz, quienes argumentaron que la cantidad de biomasa no siempre es
proporcional a los daños necróticos desarrollados y con Motteram et al., (2009) quienes
reportaron una expresión mayor del gen MgNLP de M. graminicola durante la fase
asintomática de la colonización en un cultivar susceptible , seguido de una disminución de
la expresión durante la formación de lesiones; esta disminución lo asociaron a la pérdida
de la integridad de la membrana y de nutrientes en el espacio apoplástico donde se
encontraba el hongo.

Con respecto al nivel de expresión de la cepa M. fijiensis C1233 en los fragmentos

foliares de Enano gigante, nuestros resultados indican que en el 0 5 la expresión del gen
Mf A VR4 fue 4 veces más con respecto al día cero, sin embargo la expresión descendió
hasta el 0 30 . No obstante datos recientes de Canché-Gómez (2013) difieren con nuestros
datos, al reportar que el gen Mf Avr4 tuvo su mayor nivel de expresión a los 15 después
de la infección, el cual fue mucho menor a lo observado en campo. Esta diferencia entre

87
 Capítulo 111

los días de expresión, puede estar relacionado con el estado fisiológico de las plantas de
donde proviene el fragmento y la capacidad de virulencia de cada cepa de M. fijiensis .

La expresión del gen Avr4, fue temprana (0 5 dpi) probablemente porque su función
es proteger la pared celular del hongo M. fijiensis, de la degradación de las quitinasas
secretadas por las plantas, como lo reportó Stergiopoulos et al., (201 0). Por otro lado, la
disminución en la expresión del gen Avr4 en la cepa C1233, al día 30 después de la
inoculación, coincide con lo reportado por Canché-Gómez (2013) Posiblemente en un
cultivar susceptible el mecanismo de defensa se enciende tardíamente (Torres et al. ,
2009) por lo que en el 0 30 , podríamos pensar que se activan las proteínas R que reconoce
al Avr ocasionando que se disminuya la expresión del gen Avr4, otra alternativa , es que
posiblemente las quitinasas disminuyen debido a la senescencia y por consiguiente la
expresión del gen Avr4.

Con respecto al gen Atr4, cv Enano gigante, a los 5 días post inoculación , la cepa
OZ1 b y C1233 expresaron el gen Atr4, casi 4 veces más que el día cero , seguidas de
Jaguar C3 y CR4b que se expresaron 1 y 3 unidades menos que OZ1 b y C1233
respectivamente. A los 15 y 30 días luego de la inoculación , Oz1 b y Jaguar C3 ,
manifestaron mayor nivel de expresión del Atr4 , destacando notablemente la cepa OZ1 b a
los 30 días. Las cepas C1233 y CR4b tuvieron una expresión baja.

El gen Atr4, en Enano gigante tuvo su mayor nivel de expresión con una cepa aislada de
una finca sin manejo de fungicidas, OZ1 b a los 30 días, seguido de la cepa Jaguar C3
(intensivo) a los 15 post- inoculación. Este resultado fue inesperado debido a que en la
literatura se reporta que la expresión del gen Atr4 es mayor en cepas sometidas a
fungicidas , y la cepa OZ1 b fue aislada de una finca sin manejo de fungicidas; en el caso
de Mycosphaerella graminícola se sabe que el MgAtr4 tiene un mayor nivel de expresión
en presencia del epoxiconazol y otros fungicidas inhibidores de la desmetilación (DMis) , lo
que sugiere que este transportador le confiere protección al patógeno contra dichos
compuestos . Además en un estudio realizado por Couoh-Uicab y colaboradores (2012),
se reportó que el nivel de expresión del MfAtr4 , con la cepa C 1233 y en el cv Enano
gigante ante clorotalonil es fuerte, mientras que frente al fungicida benomilo y mancozeb
se abate. Al igual, Stergiopoulos y colaboradores (2003) trabajando con Mycosphaerella

88
 Capítulo 111

graminicola, observaron que los transportadores se expresan fuerte o débilmente bajo la

influencia in vitro de fungicidas. Pudiera ser que algo similar ocurrió , con las cepas
aisladas de fincas con manejo intensivo, por ejemplo CR4b y Jaguar C3 estuvieron bajo la
influencia de fungicidas multisitio como mancozeb y otras moléculas como estrobilurinas y
triazoles. Finalmente, la expresión del gen Atr4 observada en las cepas OZ1 b y Jaguar
independientemente de su procedencia concuerda con lo reportado por Couoh-Uicab et
al., (2012) quienes observaron que el gen Atr4 se expresa particularmente en la fase
necrotrofica.

En las fotografías de fragmentos foliares provenientes del cv Enano gigante se

observó que hubo formación de lesiones correspondientes a Sigatoka negra, donde la
cepa OZ1 b fue la que causó más daño, interpretándose como la más virulenta entre todas
las cepas evaluadas. Las cepas Jaguar C3 y CR4b presentaron crecimiento micelial y
C1233 no presentó crecimiento epifilo , pero si indujo lesiones correspondientes a la
Sigatoka Negra como estrías, mientras que en el experimento (Cap 11) para la cepa
C1233 , se observó pizcas y fue hasta los 30 dpi que se observaron las estrías y rayas, la
presencia de estrías concuerda con lo observado en las fotografías proporcionadas, pero
difiere a lo observado por Canché-Gómez (2013) quien observó a los 15 dpi, etapas
correspondientes a rayas en los fragmentos. Posiblemente esta diferencia sea por el
estado fisiológico de la planta , de donde se obtuvieron los fragmentos.

Torres y colaboradores (2009), observaron en el cv Williams (genoma AAA y

susceptible a SN) que la expresión de Fenilalanina amonio-liasa (PAL), una enzima que
regula la síntesis y acumulación de fenilpropanoides durante un proceso de infección, se
da después de las 144 horas post-infección . Posiblemente , esto ocurrió en los fragmentos
foliares de Enano gigante, de tal manera que el hongo tuvo el tiempo suficiente para
colonizar el área foliar, por lo que todas las cepas inoculadas en este cultivar, causaron
lesiones como consecuencia de una interacción compatible .

Por otra parte, de acuerdo con los registros fotog ráficos, las cepas Oz1 b, Jaguar
C3 y CR4b fueron virulentas por causar más daño en los fragmentos cv Enano gigante
que en los de Calcuta IV, esto se fortalece con lo reportado por Lepoivre y colaboradores
(2003), donde cepas muy virulentas pueden infectar muy rápido un cultivar susceptible,

89
 Capítulo 111

pero la rapidez de infección puede ser diferente sobre un cultivar tolerante o resistente . En
fragmentos foliares del cultivar Calcuta IV, las cepas Jaguar C3 y CR4b no generaron la
misma magnitud de daño que en los de Enano gigante

En el cultivar Calcuta IV, se evaluarán 2 cepas (Jaguar C3, manejo intensivo y

CR4b, manejo semi intensivo), sin embargo la cepa M. fijiensis Jaguar C3 se expresó en
mayor número de veces , con respecto al día cero en ambos genes (Avr4 y Atr4) y su
mayor nivel de expresión fue en el día 30 de la interacción planta-patógeno. Otro dato que
apoya que las aplicaciones intensivas de fungicidas sobre las plantaciones , afectan la
virulencia de las cepas ; es que la cepa M fijiensis Jaguar C3 presentó niveles altos de
expresión del gen Avr4, en los fragmentos foliares del cultivar E. gigante. Sin embargo , en
los fragmentos del cv Calcuta IV, no se observaron lesiones severas , lo cual era de
esperarse , porque el cultivar Calcuta IV, es considerado resistente a Sigatoka negra
(Fullerton y Olsen 1995).

90
 Capítulo 111

3.6.- BIBLIOGRAFÍA

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93
 Capítulo IV

CAPÍTULO IV

EXISTENCIA DE ALELOS DEL EFECTOR AVR4

4.- PRESENCIA DE VARIANTES ALÉLICAS EN M. fijiensis

4.1.- INTRODUCCIÓN

Hayden y colaboradores (2003) analizaron la diversidad genética de cepas de M.

fijíensís de diferentes regiones geográficas. Analizando microsatélites encontraron
diversidad genética entre las cepas de diferentes lugares. La variabilidad se pudo
observar entre cepas aisladas de diferentes lesiones e incluso entre cepas aisladas de la
misma lesión. El mayor número de alelas, se ha encontrado en las poblaciones de los
centros de diversificación de Musa, lo cual se considera lógico con el hecho de que estas
poblaciones han estado desde hace muchos años en ese lugar y han tenido más tiempo
para evolucionar (Hayden et al. , 2003).

En los patógenos existen genes que parecen estar frecuentemente en evolución,

posiblemente como respuesta a la presión de selección, por ejemplo en el caso de los
efectores. Se sabe que los Avrs , presentan mutaciones y recombinación, que cambios en
sus secuencias peptídicas podrían tener consecuencia en la interacción directa o indirecta
con las proteínas de resistencia (R) (Stergiopoulos, 2008). Varios autores sugieren que la
mayoría de las variaciones alélicas observadas en los loci de Avr, son una consecuencia
de la presión de selección impuesta sobre el patógeno (Kruijt, 2004 ). Por otra parte, se
han observado grandes diferencias en los tipos de mutaciones de los genes Avr en la
población del patógeno, lo que puede favorecer su adaptación a nuevas condiciones
ambientales y geográficas.

En el caso del efector Avr4 de Cladosporíum fulvum la mayoría de los

polimorfismos observados son de tipo SNP, que causan sustituciones de aminoácidos,
principalmente de residuos de Cys en la proteína Avr4 (Stergiopoulos et al., 2007). En el
grupo de banano se analizó la secuencia nucleotídica del gen MfAvr4 en 5 cepas de M.
fijíensís aisladas de diferentes genotipos de banano, con diferentes grados de tolerancia a
la Sigatoka negra. Las secuencias fueron comparadas con la reportada en el genoma de

95
 Capítulo IV

M. fijiensis y se encontró que todas presentaron variaciones entre sí (Burgos-Canul,

2010).

En el presente trabajo se analizó el patrón de expresión del gen MfAvr4 durante la

infección con cepas de M. fijiensis de diferente virulencia , en diferentes cultivares de
banano. En este capítulo se analiza la posible existencia de alelas del efector Avr4 en
estas cepas.

4.2.- DETECCIÓN DE POLIMORFISMO EN Avr4

4.2.1.- MATERIAL BIOLÓGICO Y EXTRACCIÓN DE ADN GENÓMICO

El ADNg de las cepas OZ1 b, CR4b, C1233 y JaguarC3 se extrajeron como lo

describe Vázquez-Euán et al., (2012). Se realizó la amplificación del gen MfAvr4
empleando cebadores diseñados sobre los extremos 5'y 3' del gen (Torres-Martínez
comunicación personal). La PCR se realizó de acuerdo a Vázquez-Euán et al. (2012).
Como testigo positivo se usó ADNg de M. fijiensis extraído por el método de Johansson
(1995).

La mezcla de PCR fue para un volumen final de 15 ¡.JI. El producto esperado es un

fragmento de 406 pb. Los productos de amplificación se analizaron en gel de agarosa-
bromuro de etidio. Las bandas fueron cortadas del gel y se purificaron empleando el kit
Zimocleanrm gel DNA Recovery kit (Zymo Research), siguiendo las instrucciones del
fabricante.

Al final el ADN, se cuantificó . en el nanodrop Thermo scientific 2000 C y para

secuenciar en Macrogen, Korea . Se envió 20 ng de cada producto de PCR, por triplicado
cada uno.

4.3.- ANÁLISIS DE LAS SECUENCIAS

Para el análisis de las secuencias , se procedió a usar el programa Clustal W ,

de acceso libre en la página de internet http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/.
Primero se realizó el alineamiento de los triplicados de las secuencias de cada
cepa, para verificar o corregir manualmente errores de nucleótidos, en caso de
haberlos. Entre los triplicados, se eligió la secuencia más larga, considerando

96
 Capítulo IV

también la elección de aquella que no tuvo correcciones o tuvo menos. Esto mismo
se realizó independientemente para la secuencia MfA vr4 de cada una de las cepas
C 1233, CR4b, OZ1 b y Jaguar C3. Se alinearon las cuatro secuencias con la
secuencia del gen Avr4 disponible en el portal genómico de M. fijiensis.

4.4.· RESULTADOS

En el primer intento de amplificación las bandas se observaron abundantes, con

excepción del producto de la cepa CR4b que amplificó pobremente. La cantidad de ADN
obtenido después de la purificación, no fue suficiente para enviar a secuenciar por
triplicado cada secuencia. Por lo tanto se realizó otra PCR bajo las mismas condiciones,
pero poniendo ahora duplicado para cada reacción, con el fin de lograr obtener suficiente
amplicón para secuenciar. Se logró obtener la cantidad necesaria para enviar a
secuenciar todas las muestras a Macrogen, Korea. En la figura 21 se observan los
productos de PCR de cada cepa. En cada caso se observó un producto único
correspondiente al tamaño de banda esperada de 406 pb.

1 2 3 4 5 6 7

Figura 21 .-Amplificación del gen MfAvr4 en diferentes cepas de M. fijiensis. Carril 1: Marcador de
peso molecular (1Kb plus); 2: testigo negativo (H 2 0), 3: testigo positivo (ADNg de la cepa
Veracruz); 4: cepa C1233; 5: cepa CR4b; 6: cepa Jaguar C3 y 7: cepa OZ1 b. Las bandas fueron
cortadas, purificadas y enviadas a secuenciar.

97
 Capítulo IV

En el cuadro 7, se muestra la concentración de cada uno de los amplicones

obtenidos en cada cepa de Mycosphaerella fijiensis. Cada tubo enviado para la
secuenciación tuvo un volumen final de 1O ¡Ji a una concentración de 20ng/¡JI.

Los amplicones obtenidos de cada una de las cepas de Mycosphaerella fijiensis en este
estudio se analizaron con el programa bioinformatico , Clustal W
(http ://www.ebi.ac.uk!Tools/clustalw2/index.html). Los amplicones de cada cepa se
secuenciaron por triplicado en diferentes reacciones, lo cual asegura que los cambios
observados son verdaderos y no por errores de amplificación con la Taq polimerasa o de
la secuenciación. Por otra parte, hay que señalar que la secuencia de la cepa M. fijiensis
C1233 en este análisis fue secuenciada una sola vez, debido a que dos de las muestras
no fueron apropiadas y presentaron "ruido" en la secuenciación . Los productos de
amplificación fueron obtenidos mediante una modificación del método PCR en colonia , lo
que permitió obtener los amplicones de una manera fácil y relativamente rápida. En la
mayoría de los casos, se lograron obtener las cantidades necesarias para secuenciar por
triplicado cada producto. Esto con el fin de confirmar que los cambios que se observasen
no fueran errores de la amplificación o de la secuenciación. La mezcla de diferentes
reacciones de amplificación de cada cepa, asegura que la secuencia obtenida es real. En
el caso de la cepa C1233, el gen MfAvr4 solo se secuenció una sola vez, pero su
identidad con las secuencias de las cepas CR4b y Jaguar C3 apoyan que la secuencia es
correcta y no hay necesidad de volver a secuenciarla .

En la figura 22 la primera secuencia corresponde a la obtenida del portal de

Mycosphaerella fijiensis (genoma secuenciado) para el gen A vr4, representada de color
amarillo. Esta secuencia se alineó, junto con las secuencias obtenidas del Avr4 de las
cepas de M. fijiensis (C1233, CR4b, OZ1b y Jaguar C3), las cuales fueron aisladas de
plantaciones de banano con diferente manejo de fungicidas. Los rectángulos de color
naranja y azul representan transiciones, es decir cambios de una purina por otra purina (A
<--> G) o una pirimidina por otra pirimidina (C <--> T) . Mientras el color morado indica que
hubo cambios de transversion (cambio de una pirimidina por una purina o viceversa (T o
C <--> G o A). Estos cambios en las secuencias fueron observados al compararse con la
secuencia del gen Avr4 del portal y entre sí, es decir entre las secuencias del Avr4
obtenidas en las cepas en estudio.

98
 Capítulo IV

AVR4

C1233

OZ1B

CR4B
- )·~
' '
...
• • '. •. 1 .. • •

.· .. •....,
JAGUAR "\"'"'

C3
Figura 22.- Poliformismos en cepas de M. fijiensís. Se puede observar que las cepas M. fijíensís
C1233, CR4b y Jaguar C3, poseen una transversión , representado de color morado; una
transición , color naranja y la cepa M. fijíensís OZ1 b presentó una transición , ilustrada con el color
azul.

Las cepas aisladas de Ch iapas (CR4b, manejo semi intensivo de fungicidas) y

Tabasco (Jaguar C3, con manejo de intensivo de fung icidas) y C1233 (Uxmal , Yuc, sin
manejo de fungicidas), presentaron secuencias idénticas de MfAvr4 , con dos
polimorfismos tipo SNP, de tipo transversión y transición respectivamente, con respecto a
la secuencia del portal de M. fijiensis . La secuencia del gen MfA vr4 de la cepa OZ 1b
(Chiapas, sin manejo de fungicidas) , fue muy similar a la del portal, excepto por un cambio
de nucleótido (transición) en el último tercio de la secuencia. Cabe mencionar que esto
provocó un cambio a nivel de aminoácidos, a Cisteína, en lugar de Tirosina. Todos los
demás cambios encontrados fueron silenciosos , es decir no provocaron cambios en los
aminoácidos de la proteína MfAVR4.

99
=

1
 Capítulo IV

4.5.- Discusión

Una de las características de los efectores Avr es que presentan polimorfismo, por
lo que en este trabajo se analizó la presencia de posibles polimorfismos del gen Avr4 en
las cepas de Mycosphaerella fijiesis aisladas de plantaciones de bananos con diferente
intensidad de manejo de fungicidas.

En el genoma de M. graminicola , tanto Mg1LysM y Mg3LysM muestran

polimorfismo a nivel de SNP dando lugar cambios no silenciosos (Marshall et al., 2011 ),
los cual difieren con los resultados encontrados en M. fijiensis ; previamente en el
laboratorio de banano (CICY) Burgos-Canul (201 0), analizó el polimorfismo del Avr4 en
cepas de M. fijiensis procedentes de diferentes cultivares de banano y encontró mayor
diversidad del gen MfAvr4, lo que deja abierta la posibilidad de la existencia de formas
especiales de M. fijiensis. Se sabe que M. fijiensis ha roto la resistencia de cultivares
como Yangambi km5 (Fullerton, 2002) y FHIAs (Daniells et al., 1995; Alvarez, 1997;
Vigyeri , 1997 citados por Nakyanzi 2002), pero se desconocen las bases moleculares de
esas interacciones.

Varios autores sugieren que la mayoría de las variaciones alélicas observadas en

los loci de Avr, son una consecuencia de la presión de selección impuesta sobre el
patógeno (Kruijt, 2004). En el presente trabajo, resultados indican que aparentemente no
existe relación directa entre la intensidad en la aplicación de fungicidas a la que fueron
sometidas las cepas en el campo y la variación polimórfica de MfAvr4. Tampoco se
observaron grandes diferencias polimórficas entre las cepas aisladas en diferentes
regiones geográficas (Chiapas, Tabasco y Yucatán) y todos los cambios encontrados,
fueron silenciosos a excepción de Oz1 b.

Con base en los resultados obtenidos es factible proponer que de haber relación
entre la aplicación de fungicidas y virulencia, y entre ésta y MfAvr, la correlación no sería
necesariamente a nivel de la secuencia de este efector, sino probablemente a nivel de su
expresión. Cabe mencionar que se deberá analizar un mayor número de muestras para
concluir contundentemente que no existe relación entre los fungicidas y la variabilidad de
los efectores, en este caso particular MfAvr4.

101
'·

' '. ~.

''.)
 Capítulo IV

4.6.- BIBLIOGRAFÍA

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103
 Capítulo V

CAPÍTULO V

DISCUSIÓN, CONCLUSIONES GENERALES Y PERSPECTIVAS

5. DISCUSIÓN GENERAL

La Sigatoka negra (S.N), también conocida como raya negra, es la principal

enfermedad foliar que ataca al cultivo de banano y es ocasionada por el hongo M.
fijiensis (Stansbury, 2000). En la actualidad las principales zonas bananeras del mundo
emplean intensivamente fungicidas para minimizar dicha enfermedad , trayendo como
consecuencia contaminación en el ambiente y en la salud de los trabajadores. Por otra
parte pudiera estarse favoreciendo una presión de selección sobre las cepas, y con ello
un incremento en la virulencia del hongo (Beltrán- Aguilar, comunicación personal). Hasta
el momento no existe un control eficaz de M. fijiensis; pero si se han realizado diversos
estudios (moleculares, bioquímicos, citológicos) de interacción Musa sp-M. fijiensis con la
finalidad de generar conocimiento que permita explorar e implementar en un futuro el
desarrollo de estrategias para un control eficaz. Asimismo se han establecido métodos
para evaluar la interacción planta-patógeno como por ejemplo , la infección in vitre en
fragmentos foliares, reportados por Pérez et al., (2006), Abadie et al., (2008) y Canché-
Gómez (2013), quienes observaron que existe correlación con las etapas de infección en
plantas de campo y por lo tanto puede ser empleado para evaluar la virulencia de
diferentes cepas.

En nuestro estudio, la infección in vitre de fragmentos foliares permitió determinar

que la cepa de M. fijiensis Jaguar C3 fue más virulenta que C1233. Aunque ambas
presentaron las primeras lesiones a los 15 días posteriores a la inoculación, a los 30 días
se observó que Jaguar C3 causó mayor daño, esto es pequeñas manchas, rayas en el
centro del fragmento y crecimiento epífilo. Recientemente Canché-Gómez (2013) reportó
que las primeras lesiones en fragmentos foliares del cv Enano gigante, infectados con la
cepa C1233 se observaron a los 5 días posterior a la infección (etapa 1, correspondiente
a pizca) ; a los 15 días observó la etapa 3 (raya) y a los 30 días la etapa 4 (mancha). En

lOS
 Capítulo V

cambio, en el presente trabajo solo observamos hasta raya; estas diferencias pudieron
deberse a la diferencia en el estado fisiológico de las plantas muestreadas, a la diferencia
en el número de hoja de donde proviene el fragmento, a la estación del año en que se
realizó el experimento y/o al número de subcultivos de la cepa de M. fijiensis.
Independientemente de lo anterior, los síntomas de SN, ocasionados por Jaguar C3
efectivamente fueron reproducibles en fragmentos foliares in vitro , por lo tanto con base
en los resultados se puede inferir que el empleo de fragmentos foliares in vitro puede ser
usado para estudios de virulencia y de interacción planta-patógeno.

Por otra parte se observó que la virulencia de las cepas de M. fijiensis (todas
aisladas del cv Enano gigante), no estuvo correlacionada con la condición de la que
provenían (con o sin manejo de fungicidas). Esto coincide con lo reportado por Cruz-
Martín y colaboradores (2004 ), quienes encontraron que la virulencia diferencial
observada en los cultivares susceptibles no estuvo correlacionada con el origen del
aislamiento. Con respecto a las diferencias encontradas al día 15 en los fragmentos
inoculados con las cepas Jaguar C3 o Oz1 b, tanto en los niveles de la expresión de los
genes Avr4 (14 y 6 veces más que DO, respectivamente) y Atr4 (7 y 13 veces más que
DO , respectivamente) así como en los síntomas de la SN desarrollados (presencia de
rayas y manchas respectivamente), no se puede llegar a una conclusión determinante
porque el análisis se limitó a un bajo número de cepas.

Paralelamente, al evaluar la virulencia de las cepas, se observaron las

características morfológicas que presentaron las cepas Mf C 1233, Mf CR4b, Mf Jaguar C3
y Mf OZ1 b; las colonias crecieron de forma circular, oblonga, con bordes regulares,
crecimiento de aproximadamente 15 días y de diferentes colores. Dichos resultados
concuerdan con lo reportado por Meredith y Lawrence, 1969 citado por Manzo-Sánchez
2005, y con Manzo-Sánchez y colaboradores (2001 ); ambos observaron las
características de las colonias de M. fijiensis en medio PDA y coincidieron con las
referidas en la literatura para esta especie (crecimiento de colonias de 14 días, micelio
superficial, aterciopelado, elevado , compacto y variabilidad de colores entre cepas). Estas
características observadas correspondieron a cepas de M. fijiensis y se observó que
presenta una gran variedad fenotípica.

106
 Capítulo V

Por otra parte , se utilizó la técnica de PCR tiempo real , que permite una
cuantificación precisa, rápida, sensible, confiable, altamente eficiente y reproducible de
moléculas de ADN o ADN complementario (ADNc) , aun cuando están en pequeñas
cantidades. (Derveaux et al. , 2010; Teste et al. , 2009; Gibson et al., 1996) y que tiene la
ventaja de registrar el progreso de la reacción debido a que cuantifica en cada ciclo la
fluorescencia emitida por un fluoróforo durante la amplificación. Esta técnica fue empleada
para evaluar, durante el desarrollo de la enfermedad en los fragmentos foliares in vitro, la
expresión de 2 genes, MfAvr4 y MfAtr4, y utilizando como gen endógeno la f3-Tubulina .
Cabe mencionar que el gen MfAvr4, con base en lo reportado por Stergiopoulos et al. ,
(201 0), es un gen ortólogo al CfAvr4 de Cladosporium fulvum, que es capaz de proteger la
pared celular del hongo de las quitinasas de la planta. Por otro lado, en Mycosphaerella
graminicola se han aislado 5 transportadores, siendo el MgAtr4 el único relacionado con la
virulencia , con base en que la pérdida de su función en mutantes provocó que la cepa
virulenta M. graminicola perdiera su capacidad de colonizar plantas de trigo. En M.
fijiensis se encontró un probable ortólogo de este gen MgAtr4. El presunto gen MfAtr4 se
expresa durante la interacción, en particular en la fase necrotrófica (Couoh-Uicab et al.,
2012), similarmente al comportamiento de MgAtr4 en M. graminicola. Ambos genes son
presuntamente importantes en la patogénesis de M. fijiensis, por lo tanto se analizó la
expresión de ambos durante su interacción en los fragmentos foliares provenientes del
cultivar E. gigante y Calcuta IV.

En la literatura se ha encontrado que existen genes de hongos como el Mg3LysM,

MgNLP y SIX1 , los cuales se expresan en etapas tempranas de la infección (Does et al.,
2008; Motteram et al., 2009; Marshall et al. , 2011) como se observó en este trabajo con el
gen MfAvr4, el cual exhibió su mayor nivel de expresión al 0 5, siendo 4 veces más con
respecto al día cero , en los fragmentos provenientes del cv E. gigante infectados con la
cepa C1233 , a pesar de no observarse en ese momento síntomas de la enfermedad;
similarmente, en la literatura se reporta que el gen MgNLP tuvo su expresión máxima en
la fase presintomática (Motteram et al. , 2009) en la interacción de M. graminícola con el
trigo. Sin embargo las funciones de estos genes son diferentes. Datos recientes de
Canché-Gómez (2013) difieren con nuestros datos ya que reportó que el gen Mf Avr4, en
la cepa C1233 tuvo su mayor nivel de expresión a los 15 después de la infección. Esta
diferencia pueda ser debido a la fisiología del fragmento usado y/o virulencia de la cepa ;

107
 Capítulo V

sin embargo ambos trabajos coinciden en que la expresión descendió a los 30 días (0 30 ).
La expresión del gen Mg3LysM de Mycosphaerella graminicola fue mayor en las etapas
asintomáticas de la enfermedad del trigo y disminuyó en la fase necrotrófica, sugiriendo
que en ese momento la expresión del gen ya no es necesaria para defender al hongo de
la respuesta de defensa de la planta. Pudiera ser que el gen MfAvr4 , disminuye su
expresión a los días 15 y 30 dpi porque posiblemente baja la cantidad de quitinasas
durante la senescencia de la hoja. Probablemente la expresión de este gen Avr4, no está
directamente relacionada con el daño visible causado por el hongo, sino posiblemente con
su velocidad de colonización y la cantidad de biomasa en la fase biotrófica. Puede haber
un incremento de biomasa , gracias a la acción protectora del Avr4, que forma un escudo
alrededor de la hifa, haciéndola inaccesible para la actividad lítica de las quitinasas, lo que
explicaría que la expresión de este gen Avr4 se incrementa en etapas tempranas. De
modo que M. fijiensis puede seguir avanzando hasta desencadenar los primeros síntomas
de la enfermedad , donde la expresión de este gen disminuye. Sin embargo, a pesar de
que el nivel de expresión en los días 15 y 30 baja respecto al día 5, la expresión de Avr4
aún es alta (6-8 veces respecto al día cero), lo que indica que el Avr4 es importante en
todo momento para proteger el tejido miceliar al parecer su función es más importante
durante la fase biotrófica, en la que la biomasa del patógeno aun es incipiente dentro del
hospedante y pudiera ser más fácilmente atacado y eliminado si fuera detectado.

En el caso del transportador Atr4 su función puede ser detoxificar o

compartamentalizar las fitotoxinas o fungicidas dañinos para el hongo. En las cepas OZ1 B
y Jaguar C3 su expresión es más alta en los tejidos más dañados (Figura 20), donde
debe haber gran cantidad de compuestos fenólicos liberados por la senescencia . En las
cepas C1233 y CR4b la expresión de Atr4 es más o menos constante. Estas cepas
mostraron menos virulencia que OZ1 B y Jaguar C3. Es difícil elucidar si la expresión es
menor porque las cepas son menos virulentas, o las cepas son menos virulentas porque
la expresión de Atr4 es menor, y eso les impide colonizar exitosamente al hospedante. Es
interesante notar que los niveles de expresión de Atr4 en Jaguar C3 y CR4b fueron
similares respectivamente sobre Calcuta IV y sobre Enano gigante, pero el incremento de
Atr4 en la infección de Calcuta IV fue más temprano, lo cual sugiere que el papel de este
transportador más que secretar toxinas del hongo, es detoxificar compuestos de la planta ,
como fue sugerido por Couoh-Uicab et al., (2012). Es decir, la rápida respuesta de

108
 Capítulo V

Calcuta IV en términos de producción de metabolitos de defensa, en comparación con

Enano gigante (Cavalcante et al. , 2011) induciría más rápido la expresión de Atr4 en
Calcuta IV.

Se encontró que el gen Avr4 se expresa mayor número de veces en las muestras
colectadas a los 5 días después de la inoculación en el cv E. gigante. Posiblemente este
efector es de suma importancia en la fase biotrofica de M. fijiensis , mientras que el gen
Atr4 aumentó su expresión en Jaguar C3 y OZ1 b en la fase necrotrófica avanzada ,
mientras mantuvo su nivel de expresión en CR4b y C1233, que fueron cepas menos
virulentas. En el caso del cultivar Calcuta IV los niveles de expresión de los genes Avr4 y
Atr4 correspondieron con lo esperado para un gen de virulencia, ya que sus expresiones
aumentaron en la etapa media y tardía de la necrotrofía. Por lo tanto se puede proponer
que el gen Atr4 puede ser usado como un marcador de virulencia , ya que aunque la cepa
JaguarC3 no causó gran daño en el cv Calcuta IV (considerada como resistente), si
provocó mayor daño que otras cepas sobre el cv Enano gigante.

Una de las características de los efectores Avr es que presentan polimorfismo, por
lo que en este trabajo se analizó la presencia de posibles polimorfismos del gen Avr4 en
las cepas de Mycosphaerella fijiensis; este análisis no se realizó con el gen Atr4 debido a
que es un gen muy grande. Las cepas aisladas de Chiapas (CR4b, manejo semi intensivo
de fungicidas) y Tabasco (Jaguar C3 , con manejo de intensivo de fungicidas) y C1233
(Uxmal , Yuc, sin manejo de fungicidas), presentaron secuencias idénticas de MfAvr4, con
dos polimorfismos tipo SNP respecto a la secuencia reportada en el portal genómico de
M. fijiensis; la cepa OZ1 b (Chiapas , sin manejo de fungicidas), presentó un cambio de
nucleótido (transición) que provocó un cambio de un aminoácido , de Tirosina a Cisteína.
Posiblemente esto pudiera relacionarse con el aumento en su virulencia, pero requeriría
estudios para evaluar esta posible relación .

109
 Capítulo V

5.1.- CONCLUSIONES GENERALES

• La cepa Jaguar C3 proveniente de una finca con manejo intensivo de fungicidas

resultó más virulenta, pues generó daños a los 5 días después de inocularse en
los fragmentos foliares del cv Enano gigante, lo cual se correlacionó con la
expresión del gen Avr4.

• En fragmentos foliares de Calcuta IV y Enano gigante inoculados con las cepas

Jaguar C3 y Oz1 b respectivamente, la expresión del gen Atr4 fue mayor, indicando
que está correlacionado con las etapas media y tardía de la necrotrofía , y que el
nivel de expresión del gen Atr4 es independiente de la cepa y de los cultivares
inoculados.

• El nivel de expresión de los genes Avr4 y Atr4 en los cultivares de fragmentos

inoculados con la cepa CR4b, proveniente de una finca con manejo semi intensivo,
fue más cercano al nivel de expresión de dichos genes en los fragmentos
inoculados con Jaguar C3 , lo cual sugiere una correlación positiva entre manejo
intensivo de fungicidas y virulencia.

• La cepa Oz1 b, proveniente de una finca sin manejo de fungicidas, inoculada en

fragmentos foliares de E. gigante ocasionó un daño severo a los 30 días, el cual
no se correlacionó con la expresión del gen Avr4 favoreciendo con esto la
evidencia reportada de que dicho gen Avr4 se expresa mayormente en etapas
tempranas de la infección.

• No existe relación directa entre la intensidad en la aplicación de fungicidas a la que

fueron sometidas las cepas en el campo y la variación pol imórfica de MfAvr4.

111
 Capítulo V

5.2.- PERSPECTIVAS

• Evaluar la cantidad de biomasa de M. fijíensís en etapas tempranas y ver si se

correlaciona con el nivel de expresión del gen Avr4.

• Registrar la producción de metabolitos secundarios del patógeno y del

hospedante; su papel durante la infección. Posiblemente las cepas más virulentas
liberan metabolitos más tempranamente, o en cantidades mayores.

113
 Capítulo V

5.3.- BIBLIOGRAFIA GENERAL

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