ANLISIS GENTICOS

Integrantes Lapac, Bessie Lasala, Matas Napoleone, Anabela Ponce, Valeria

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Ctedra: Gentica Molecular

2008

1. Introduccion
El objetivo del presente trabajo es indagar acerca de las posibilidades que brinda la realizacin de anlisis bioqumicos en la deteccin de alteraciones en el genoma humano. Para ello se tratarn las diferentes situaciones en las que es posible o necesaria la realizacin de un anlisis gentico (junto con, en algunos casos, los posibles riesgos que esto conlleva), as como los diferentes tipos de mutaciones y los ensayos posibles para su deteccin, incluyendo ejemplos especficos. Hasta la fecha existen variados anlisis de posible realizacin. Los avances en la tecnologa aplicada han posibilitado diagnsticos tempranos, ms certeros y con cierto grado de automatizacin. Dos avances marcan una diferencia fundamental en cuanto a la performance de los tests realizados anteriormente. En primer lugar, la posibilidad de realizar una clonacin de los genes defectuosos, lo que ha reencaminado los ensayos a la bsqueda de las secuencias perjudiciales ms que a rastrear la herencia de algn cromosoma que contenga un alelo patolgico a travs de los pedigrs de una familia (procedimiento que, hoy en da, se realiza en mucha menor medida, y que a veces no es posible efectuar). Y, en segundo lugar, el descubrimiento de la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR, polymerase chain reaction), una tcnica que genera suficiente ADN como para poder analizarlo mediante una electroforesis convencional en geles de agarosa o poliacrilamida. Adems, las mejoras tecnolgicas introducidas han permitido aplicar los avances de la secuenciacin automtica del ADN al anlisis de los productos de este mtodo, mejorando la capacidad y precisin. Por ltimo, y ms recientemente, la aplicacin en tiempo real de la PCR, ha abierto un abanico de posibilidades de invalorable importancia, permitiendo la cuantificacin precisa que permite detectar deleciones en los organismos heterocigotos. Debido a las ventajas que presenta, su uso se ha generalizado en gran medida (a tal punto que ya se fabrica instrumentacin de origen nacional), por lo que ser mencionada en varias oportunidades a lo largo de este informe.
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2. Introduccion a los analisis geneticos

2.1. SITUACIONES EN LAS QUE SE PLANTEA LA REALIZACIN DE UN ANLISIS GENTICO Como ya se mencion anteriormente, los avances en los mtodos de aislamiento y caracterizacin de los genes han aumentado enormemente la capacidad para diagnosticar enfermedades genticas. Esta ventaja resulta evidente cuando se comparan dichos procedimientos con los tradicionales, que se basan nicamente en la experiencia del mdico que se apoya en los resultados de los anlisis clnicos. Hay diferentes situaciones en las que se puede plantear la posibilidad de realizar un anlisis gentico: Si existe un riesgo ya conocido de que se presente una determinada enfermedad, dentro de un procedimiento de reproduccin asistida in vitro pueden analizarse los embriones. Esto se hace con la finalidad de plantear, si hay una justificacin suficiente, su eliminacin. Antes del ensayo, los padres deberan conocer su condicin de portadores para luego tomar decisiones reproductivas. La situacin ptima para el anlisis se presenta si la mutacin es conocida y puede realizarse un test especfico que detecte la misma. En las enfermedades autosmicas recesivas, deben identificarse dos mutaciones (una en cada cromosoma del par homlogo). Si no se tiene esta informacin, el cromosoma portador de la mutacin puede rastrearse analizando marcadores polimrficos ligados al gen mutado. Al sospechar una posible mutacin en un embarazo en desarrollo, la cual podra provocar su prdida, o representar un riesgo para la madre. En un recin nacido, en el cual, al ser precoz, la validez del anlisis aumenta para luego realizar posibles tratamientos, y los tests son simples y ms seguros que los realizados durante el embarazo. El diagnstico de la fenilcetonuria es un ejemplo muy comn, pues en los neonatos es un test de rutina en el cual se toma una pequea muestra de sangre del recin nacido y se guarda seca en un papel de filtro especial. Posteriormente, se determinan los niveles de fenilalanina en la gota de sangre en un cultivo bacteriano de una cepa auxotrofa para el aminocido. Sin embargo, la misma gota de sangre nos puede permitir otros tests genticos como el anlisis de la mutacin F508del gen de CFTR (fibrosis qustica) en las poblaciones europeas. Cuando se necesita confirmar o descartar un diagnstico de enfermedad gentica propuesto previamente en base a la sintomatologa clnica. En el diagnstico del estatus gentico de un individuo, generalmente adulto, con respecto al riesgo de una enfermedad de comienzo tardo como la Corea de Huntington (HD, Huntington disease) o una predisposicin a un cncer hereditario. Para indagar sobre el riesgo a una enfermedad compleja. Este tipo de pruebas actualmente est tomando mucha importancia, como ocurre en el caso de enfermedades tales como la diabetes mellitus tipo 1. Para identificar un gen que es candidato para una enfermedad, se utiliza el anlisis gentico para correlacionar la presencia de una mutacin y la aparicin y desarrollo de los sntomas.
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2.2. DESAFOS A RESOLVER POR UN ANLISIS GENTICO En algunos casos se conoce la naturaleza de la mutacin que afecta a un gen en particular. As ocurre la situacin en la que slo una o pocas mutaciones diferentes son las responsables de una enfermedad, como ocurre cuando hay mutaciones derivadas de una primera mutacin inicial. En otros casos, la enfermedad se produce por un tipo particular de mutacin, como en la Distrofia Muscular de Duchenne (DMD, Duchenne muscular distrophy), en la cual las deleciones son la causa en el 60% de los casos. Sin embargo, en muchas situaciones no se dispone de esta informacin. Esto puede presentarse cuando el gen est recin clonado y se est en el proceso de buscar una correlacin entre la presencia de mutaciones y los sntomas clnicos de la enfermedad. Existen tambin numerosos genes para los que se ha catalogado un amplio nmero de mutaciones. A veces, estas son nicas en un individuo o en una familia en particular, denominndose como mutaciones privadas. El testeo de la presencia de dichas mutaciones es un reto tcnico importante, pues generalmente los genes son largos y es posible que la mutacin se deba solo al cambio de una base. Los problemas que debe resolver un test gentico pueden enumerarse de la siguiente manera: La enfermedad, est causada por una nica mutacin o por un nmero pequeo de mutaciones conocidas? Esta situacin se pude resolver utilizando ensayos diseados para detectar las mutaciones especficas, como puede ser una sonda radiactiva aplicada en un Southern o Western Blot. Si bien el gen est clonado, es decir, se ha aislado y caracterizado, existen muchas mutaciones posibles. Aqu es necesaria la aplicacin de tests que detecten diferencias entre los genes normales y mutados (no hay necesidad de definir la naturaleza de la mutacin). Si la mutacin no puede caracterizarse, el cromosoma portador de la mutacin puede rastrearse en la familia? Esta era la primera opcin (y casi la nica salida) en la mayor parte de los casos hace solamente 15 aos. Hoy en da ya no se utiliza este mtodo, pero hay veces en las que es inevitable.

2.3. MATERIAL BIOLGICO QUE PUEDE SER UTILIZADO EN LOS ENSAYOS El material biolgico que se utiliza puede provenir de mltiples fuentes. Una ventaja importante de los ensayos basados en PCR, es que estos pueden realizarse con muy poca cantidad de muestra. Si bien en los casos planteados esta ltima es de obtencin relativamente fcil, cabe destacar que esta tcnica da la posibilidad de emplear ADNs deteriorados en mayor o menor grado. Los distintos orgenes pueden ser: Una clula extrada de un embrin de solamente ocho clulas que ha sido producido mediante fertilizacin in vitro, puede ser utilizada para la realizacin de un diagnstico preimplantacional. Este caso se presenta cuando una pareja, a sabiendas de que tiene la posibilidad de transmitir una enfermedad gentica hereditaria, se somete a un programa de fertilizacin in vitro para producir embriones. En estos ltimos se testea la presencia de las mutaciones caractersticas de la enfermedad, implantando slo aquellos que no se encuentran afectados. Amniocentesis: Las clulas son obtenidas del lquido amnitico que envuelve el feto, la obtencin consta de la insercin de un largo tubo a travs del abdomen de la madre. Las clulas son cultivadas in vitro durante tres semanas, y adems el procedimiento no puede ser realizado antes de la semana 16 de gestacin. Una muestra de vello corinico, que consiste en una membrana con proyecciones o estructuras velliformes que rodean al embrin, pero no forman parte de l a pesar de derivar del mismo. La muestra se toma mediante un catter introducido va vaginal hasta el corion. La biopsia puede llevarse a cabo con seguridad a partir de dcima semana de gestacin. Esta tcnica resulta ms productiva que la amniocentesis, porque en combinacin con la PCR, permite una interrupcin ms precoz del embarazo si los resultados del test as lo aconsejan. Sangre extrada con un pequeo corte en el taln del recin nacido, la cual puede ser conservada perfectamente (incluso seca) en una tarjeta Guthrie, un papel absorbente especial. El ADN es estable en este medio, de manera que la tarjeta puede enviarse a diferentes lugares y analizarla luego de un tiempo mediante procedimientos convencionales (como electroforesis en gel) o adosando diferentes tcnicas (como cromatografa lquida de alta presin o precisin (HPLC, high preasure liquid cromatography), ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA, Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay), radioinmunoensayo (RIA, radioinmunoassay), inmunofluorescencia, entre otros). Clulas bucales fcilmente recuperadas mediante un lavado bucal. Muestras de sangre, utilizadas con mucha frecuencia en los ensayos de adultos. Los tests genticos se aplican en material previamente amplificado por la PCR y tanto el ARNm como el ADN pueden utilizarse como moldes. El ADN genmico puede obtenerse de cualquier fuente adecuada, como las descriptas antes. El ADN genmico contiene informacin relevante en sus secuencias que no aparece en los ARNm, como las de los promotores. Pero posee una gran desventaja: muchos genes son largos y con una organizacin compleja de intrones y exones. En el caso de conocer la estructura del gen, es posible ampliar los exones con la ayuda de primers especficos. Las muestras de ADN se utilizan normalmente para caracterizar la presencia de mutaciones especficas. Como los intrones se han eliminado en el procesamiento de los ARNm, el ADN copia originado a partir del molde de ARNm es un material mucho ms simple de analizar, lo que es de gran utilidad cuando no se conoce la estructura del gen, como en el caso de los
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recin aislados mediante clonacin posicional (la cual consiste en definir una regin del genoma que segrega con la enfermedad y es candidata a contener uno o varios genes que estaran relacionados con la causa de la enfermedad). Es necesario demostrar luego que el gen en cuestin es responsable de la condicin patolgica correlacionando la presencia de la mutacin con la aparicin de la patologa. Se requiere entonces un anlisis de las diferencias entre el gen de individuos normales y los de los afectados. La expresin de un ARNm particular generalmente est restringida a un determinado tejido y puede encontrarse en muy bajas cantidades. Por este motivo en muchos casos no es posible usarlo para tests genticos.
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3. Mutaciones
3.1. TIPOS DE MUTACIONES Antes de considerar las tcnicas de deteccin de mutaciones, es necesario hacer referencia a los diferentes tipos de mutaciones que se pueden dar. Ellas son: Grandes cambios a nivel cromosmico (como grandes deleciones, es decir, la prdida de un fragmento; e inversiones, translocaciones de un fragmento que se insertan en posicin invertida) pueden detectarse mediante examenes citogenticos. Pequeas deleciones. Expansin de repeticiones de trinucletidos (TREs, Trinucleotide-repeat expansions): mutacin de fcil deteccin y muy til en la identificacin de genes como el de la enfermedad de Huntington. Se basan en la repeticin, en mayor o menor nmero, de tres bases (iguales o distintas entre s) en la secuencia de ADN, siempre respetando el mismo orden. Mutaciones que afectan a la produccin de ARN y su procesamiento, en los promotores o en los sitios de recortes. Mutaciones que provocan la interrupcin de la protena, como las non-sense (sin sentido, en las cuales aparece un codn de stop errneo antes de que termine la secuencia de sntesis de la protena) o las que cambian el marco de lectura. Sustituciones de bases (SNP, single nucleotide polymorphism), las cuales pueden ser silenciosas o neutras (si el cambio en la base no origina un cambio de aminocido codificado), o no sinnimas (que originan cambios en la secuencia de aminocidos de la protena codificada). Son los polimorfismos ms abundantes (cerca del 90% de los polimorfismos caracterizados en el genoma humano son de este tipo). Algunas de estas mutaciones, como la de la interrupcin de la protena o las deleciones, afectan directamente a la funcin del gen, y , por lo tanto, a la protena para la cual codifica; otras pueden incluso ser ms problemticas como los polimorfismos neutros, donde puede resultar difcil reconocer si un simple cambio de base trae consecuencias funcionales. En ocasiones, la naturaleza del cambio puede ser significativa, como, por ejemplo, afectar a un sitio aceptor de recorte y empalme de intrones y exones.
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3.2. ANLISIS DE MUTACIONES CONOCIDAS 3.2.1. GENERALIDADES La mayora de los ensayos de mutaciones particulares estn basados en la tcnica de la reaccin en cadena de la polimerasa. Los tests se disean para el tipo particular de mutacin que se va a intentar encontrar. Una de las grandes ventajas de la PCR es la posibilidad de incluir en una misma reaccin varias parejas de primers, con el objetivo de analizar ms de una mutacin en una sola reaccin. Este procedimiento se denomina PCR multiplex, y las bandas obtenidas deben ser identificadas luego mediante una correspondencia con un marcador de peso molecular en una corrida electrofortica en gel. Un principio importante en la PCR es que los tests que dependen de la presencia o ausencia de un producto de amplificacin deben de tener varios controles que aseguren que la reaccin de PCR no se produzca o falle por razones tcnicas, como puede ser la inhibicin de la polimerasa por impurezas en la muestra del ADN, o el hecho de que un anlisis de positivo por el simple hecho de que existi una contaminacin (la cual es muy posible pues el ADN forma aerosoles que pueden esparcirse con relativa facilidad). Mutaciones especficas pueden analizarse con los oligonucletidos especficos de alelos (ASO, allele specific oligonucleotides), que hibridan bien con el alelo mutante o el normal de modo especfico, pero no con ambos. Para esto, adems de PCR, se emplean las tcnicas del Southern Blot (para el caso del ADN) y Northern Blot (para ARN).

3.2.2. ESTRATEGIAS DE RECONOCIMIENTO DE MUTACIONES ESPECFICAS Las grandes deleciones pueden ser reconocidas mediante PCR, en la que uno o los dos cebadores hibridan con la regin delecionada. El ADN delecionado utilizado falla como molde en la amplificacin de una banda de una electroforesis. En las enfermedades ligadas al sexo como la Distrofia Muscular de Duchenne, se puede detectar la ausencia de una banda en los varones afectados. En las mujeres portadoras con deleciones en el cromosoma X, o en heterocigotos con deleciones en genes autosmicos, se producir un cambio en la cantidad amplificada (para esta cuantificacin es necesaria la aplicacin de la PCR en tiempo real). Este detalle puede detectarse con los secuenciadores automticos. Las pequeas deleciones pueden detectarse mediante la amplificacin de una regin de tan solo 100 pares de bases que contenga el sitio de la mutacin. Esta se reconoce por el movimiento de la banda de producto. Diferencias en tan solo un nucletido pueden resolverse mediante una electroforesis resolutiva en gel de poliacrilamida. Las mutaciones puntuales, que incluyen a las sustituciones de bases y a las deleciones o inserciones de uno o dos nucletidos, pueden analizarse tambin por PCR. Se utiliza de modo general el test de la mutacin resistente a la amplificacin (ARMS, amplification refractory mutation system). Originalmente el ARMS comprenda dos reacciones de PCR en paralelo, corriendo los productos en dos calles vecinas en la electroforesis. El cebador que hibrida lejos del sitio de mutacin es comn a las dos reacciones. En una reaccin el otro cebador hbrida con la secuencia mutada del alelo. En la segunda reaccin el otro cebador hbrida con la Secuencia del alelo normal. Por lo tanto, se produce una banda u otra segn el molde corresponda al alelo normal o al mutado. Generalmente, el ARMS se disea en forma multiplex lo que permite analizar simultneamente diferentes mutaciones a la vez. Para ello, se precisa un cuidadoso diseo de los cebadores para que los productos de la amplificacin puedan separarse adecuadamente con la electroforesis. Actualmente, el ARMS se aplica de forma modificada. Slo se incluye el cebador que hibrida con el alelo mutante, de manera que la presencia de la banda es indicativa de la presencia de la mutacin. Se incluyen controles positivos en el test multiplex. Normalmente, se incluyen dos controles que originan sendas bandas, una mayor y otra menor que las que originan los alelos mutados. Estos controles aseguran que la reaccin de PCR haya funcionado correctamente, de manera que la ausencia de la banda mutante puede interpretarse con seguridad como indicativa de que la mutacin no est presente. En ocasiones una mutacin crea o destruye un sitio de restriccin. Esto puede detectarse sencillamente con la amplificacin de la regin que contiene a la secuencia diana y con el posterior intento de digerir el producto con la enzima de restriccin adecuada, finalizando con una electroforesis en gel. Las expansiones de repeticiones de trinucletidos (TREs) pueden revelarse utilizando los productos de PCRs construidas con cebadores que hibridan las secuencias extremas alrededor del sitio de expansin. Este mtodo es muy til para determinar el nmero de repeticiones con precisin. Las grandes amplificaciones pueden provocar en ocasiones una distancia entre los cebadores demasiado larga para que la reaccin de PCR se produzca eficientemente. En este caso las mutaciones se analizan mediante un Southern Blot. Los oligonucletidos especficos de alelos (ASOs) pueden utilizarse en la deteccin de mutaciones por hibridacin. Normalmente, los ASO se fijan a una membrana que se hbrida con el ADN amplificado de la regin de inters. De esta manera se pueden analizar diferentes mutaciones de forma simultnea en una serie de ASOs ordenados en un array, que consiste en mltiples fragmentos de ADNc (cada uno de los cuales representa un gen diferente) adheridos a un

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soporte fsico concreto (vidrio, plstico, silicona, etc.) y agrupados de manera ordenada en filas y columnas segn su funcin. Los ADN arrays hoy en uso incluyen entre 9.000 y 40.000 fragmentos de ADNc por cm2 por lo que disponen (virtualmente) de la expresin de todo el genoma humano. Los chips de ADN son una modificacin de este diseo simple, donde el array se miniaturiza y se incorpora un gran nmero de ASOs. En la situacin lmite se podra crear un ASO para cada posicin de nucletido, permitiendo detectar todas las mutaciones posibles.
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3.2.3. EJEMPLOS DE DETECCIN DE ANOMALAS GENTICAS CONOCIDAS

Sndrome de Down El sndrome de Down es un trastorno cromosmico que incluye una combinacin de defectos congnitos, entre ellos, cierto grado de retraso mental, facciones caractersticas y, con frecuencia, defectos cardacos y otros problemas de salud. La gravedad de estos problemas vara enormemente entre las distintas personas afectadas. Sus causas principales pueden ser dos: la existencia de un cromosoma 21 de ms en las clulas como efecto de un error en la fertilizacin, o una translocacin de parte del cromosoma 21 a otro cromosoma. La confirmacin de la enfermedad se realiza mediante un cariotipo, es decir, la disposicin de los cromosomas en metafase por orden de tamao y morfologa, que pueden ser teidos por diversas tcnicas o mediante el agregado de marcadores fluorescentes especficos para cada cromosoma. La muestra puede ser obtenida mediante extraccin de vellosidades corinicas, amniocentesis y el anlisis de la sangre del feto a travs del cordn umbilical.

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Anlisis de las mutaciones del gen CFTR (Fibrosis qustica) El gen CFTR codifica para una protena que forma parte de un canal de cloro dependiente de la protena quinasa A, la cual se expresa en tejidos con secreciones exocrinas (glndulas sudorparas, pncreas, intestino y rin). Si se encuentra mutado, las caractersticas del moco secretado se altera. Los principales problemas que sufren los pacientes con fibrosis qustica son las infecciones respiratorias y los problemas de absorcin intestinal, debidos a la alteracin de la funcin del pncreas exocrino provocada por la obstruccin que causa el moco alterado.

Mutacin F508 En la gente de raza blanca europea, la mutacin F508 constituye el alelo de la fibrosis qustica mas frecuente, llegando a un 85% en Dinamarca o en el Pas Vasco en Espaa. Existen otras 20 mutaciones relativamente frecuentes. F508 se puede detectar mediante una PCR que amplifica una regin de solo 100 pares de bases que abarca el sitio de la mutacin. La delecin de 3 pares de bases en el alelo mutado F508 hace que su migracin electrofortica tras la PCR sea ms rpida que la del alelo normal. Como resultado, se pueden distinguir entre si los tres genotipos posibles (+/+, +/F508, F508/F508).

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Deteccin de cambios en sitios de restriccin En ocasiones, los cambios de base crean o destruyen un sitio de restriccin fcilmente analizable mediante el uso de una enzima de corte especfica que est involucrada con la secuencia modificada. Las mutaciones G551D y R553X, que son la tercera y la sexta ms frecuentes de la fibrosis qustica, afectan ambas a la secuencia GTCAAC, la que es diana para Hinc II. La presencia de una mutacin u otra se pone de manifiesto por la prdida de dicho sitio de restriccin. Por otra parte, la mutacin G551D crea el sitio para Mbo I que puede utilizarse en posteriores tests para distinguir entre las dos mutaciones cuando se pierde el sitio para Hinc ll. Estas y otras pruebas similares permiten identificar de manera sencilla el a 90% de las mutaciones de CF. El resto constituye un problema ms difcil de resolver puesto que no es viable desarrollar tcnicas para cada uno de los cientos de mutaciones que pueden ocurrir. En vez de eso, se precisan ensayos que analicen el gen en s, con el objetivo de detectar diferencias con la forma normal sin especificar la naturaleza o detalles de estas.

Screening neonatal Tambin puede realizarse un screening neonatal mediante el anlisis de los niveles de tripsina inmunorreactiva en la muestra de sangre de Guthrie. Niveles anormalmente altos pueden indicar CF, pero tambin pueden deberse a otras causas. Estos recin nacidos, entonces, deberan someterse a otras pruebas para confirmar el diagnstico,

como la deteccin de F508, que aparece en la mayor parte de los casos, y puede llevarse a cabo con la misma muestra de sangre. La CF se confirmar posteriormente si aumentan continuamente los niveles de tripsina inmunoreactiva despus de los primeros 28 das, y con el anlisis de electrolitos provenientes del sudor.

Deteccin de distrofia muscular de Duchenne La distrofia muscular de Duchenne (DMD) es una forma de distrofia muscular que progresa rpidamente, caracterizada por la prdida progresiva de la funcin muscular, comenzando en las extremidades inferiores. Luego evoluciona hacia los brazos, cuello y otras reas, pero no tan severamente. Inicialmente, los msculos de la pantorrilla se agrandan, al igual que el tejido muscular, el cual finalmente es reemplazado por grasa y tejido conectivo, y tejido cicatrizal (fibrosis). Es causada por un gen defectuoso para la distrofina, una protena en los msculos que tiene como funcin la conexin del citoesqueleto celular con la matriz extracelular a travs de la membrana plasmtica. Generalmente se presenta en hombres (cuya familia puede no tener antecedentes conocidos de esta afeccin), pues se trasmite con herencia recesiva ligada al cromosoma sexual X, en el que se encuentra dicho gen. Dos tercios de los casos de DMD estn causados por grandes deleciones que eliminan uno o ms exones. Estas se agrupan en dos regiones principales: una en el extremo 5 del gen, afectando a los exones 3-8, y otra que afecta a los exones 44-60. La PCR multiplex se utiliza en la deteccin de las deleciones de diferentes exones. En este test se utiliza una mezcla de diferentes parejas de cebadores, cada una diseada para la amplificacin de un nico exn utilizando el ADN genmico como molde. Los productos muestran una banda para cada exn presente; la ausencia de la banda, por lo tanto, es seal de delecin.

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El resto de casos de DMD no causados por deleciones son principalmente mutaciones non-sense y cambios en el marco de lectura; todas estas se pueden detectar mediante el test de interrupcin de la protena descrito ms adelante.

Expansin de la repeticin de trinucletidos Cada TRE es diferente a las dems; sin embargo, cada mutacin afecta al mismo sitio y puede ser decetcada mediante PCR construda sobre cebadores que hibridan a cada lado de la expansin. El tamao del producto indica la manera en que se ha producido la TRE. El grado de la expansin es muy importante en la prognosis del comienzo y severidad de la enfermedad.

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Fenilcetonuria La fenilcetonuria, enfermedad gentica autosmica recesiva, es un ejemplo de intoxicacin: los pacientes no pueden metabolizar el aminocido fenilalanina, que termina convirtindose en un txico. El defecto primario en la fenilcetonuria es la ausencia o deficiencia de la enzima hidroxilasa de fenilalanina heptica, que provoca que la fenilalanina no pueda convertirse en tirosina, por lo que tampoco pueden realizarse las conversiones que le siguen en la va metablica. Los nios con este tipo de trastorno muestran signos escasos hasta que desarrollan retraso mental, que puede no ser apreciable hasta el segundo ao de vida, cuando es irreversible. La tcnica de tamiz neonatal tiene como objetivo prevenir el retardo fsico, el retraso mental, o la muerte de los nios afectados. Se colocan de tres a cuatro gotas de sangre del nio sobre un papel filtro especfico (tarjeta de Guthrie), que a su vez se pone en un medio de cultivo especial que contiene Bacillus subtilis (una bacteria aerobia utilizada como fungicida), y se deja secar al medio ambiente. Se obtiene un disco de 3 mm de dimetro de la manchade sangre, a la cual se le determinan los niveles de fenilalanina, por ejemplo, mediante espectrometra de masas en tndem, tcnica sensible y especfica.

Galactosemia La galactosemia es una enfermedad autosmica recesiva caracterizada por la reducida capacidad de convertir galactosa de la dieta en glucosa debido a la deficiencia de alguna de las tres enzimas necesarias para la canalizacin de esta conversin (galactocinasa, galactosa 1-fosfato uridiltransferasa, uridindifosfato galactosa epimerasa). Los sntomas generalmente aparecen en los primeros das o semanas de vida y puede ser mortal debido a que causa hepatotoxicidad aguda, ditesis hemorrgica y predisposicin a sepsis por Escherichia coli. Mediante un mecanismo desconocido, la acumulacin de galactosa-1-fosfato causa dao ce rebral, aminoaciduria y lesiones del hgado en la for ma de un proceso cirrtico y de crecimiento. El tratamiento consiste en remover la galactosa de la dieta tanto como sea posible. En la deteccin de esta enfermedad tambin se utiliza el tamiz molecular. Las herramientas de la gentica molecular recientemente han sido aplicadas al estudio del gen GALT (galactosa-1-fosfato uridiltransferasa, cuya deficiencia causa la mayora de los casos), el cual codifica para una protena de 379 aminocidos. Se han identificado ms de dos docenas de mutaciones en el gen GALT en nios con galactosemia. Una mutacin, la transicin del nucletido 591 que provoca la sustitucin de

arginina por glutamina, es altamente prevalente en nios de Norteamrica con galactosemia. Otra mutacin, la sustitucin de aspartato por aspargina en otra posicin, es responsable de la deficiencia parcial, en un alelo denominado Duarte.

Chips de ADN Los chips de ADN (microarrays) constituyen una nueva tecnologa, an en desarrollo, que permite identificar el estatus de cada nucletido de una secuencia de ADN en una sola operacin. Estos pueden ser diseados para el reconocimiento de mutaciones especficas ms que para reconocer las secuencias. Esto Simplifica la interpretacin de los resultados de manera que se identifican nicamente las mutaciones ya conocidas que son causa de la enfemedad, ms que encontrarse todos lo cambios de bases y polimorfismos posibles. Existen chips que analizan las mutaciones conocidas en el gen CFTR, el gen de la globina y el genoma mitocondrial. Sin embargo, a pesar del gran potencial de estos instrumentos, an no se ha desarrollado su uso generalizado en el anlisis gentico.
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3.3. ANLISIS DE MUTACIONES DESCONOCIDAS Hasta ahora, se han considerado casos donde la naturaleza de la mutacin buscada se conoce y, por lo tanto, es posible disear ensayos especficos para su identificacin. Sin embargo, muchos genes estn afectados por un gran nmero de de diferentes mutaciones; el 10-20% de los alelos de la fibrosis qustica son mutaciones raras, poco frecuentes. Los genes como BRCA1 y BRCA2 (involucrados en el cncer de mama) son objeto de numerosas mutaciones diferentes. Por lo tanto, son necesarios tests que puedan analizar una muestra y detectar diferencias con respecto al gen normal. Un eterno problema en este tipo de anlisis es decidir la manera en que un cambio detectado es reflejo de un polimorfismo o de una mutacin, sin saber si tiene consecuencias nocivas para la funcin del gen.
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Polimorfismos de la conformacin de la simple cadena Las cadenas individuales de cidos nucleicos forman en solucin diferentes estructuras secundarias debido al emparejamiento intracatenario de las bases. Esta disposicin tiene su efecto en la migracin electrofortica en condiciones no desnaturalizantes. Incluso un simple cambio de una base puede alterar la estructura secundaria y cambiar la movilidad del fragmento de cido nucleico. La tcnica del polimorfismo conformacional de la cadena sencilla o simple cadena (SSCP, single-stranded conformation polymorphism) se basa en estos principios, que permiten detectar los cambios de una base sin necesidad de conocer la secuencia afectada. Se utiliza la PCR con el fin de amplificar la regin analizada del gen en una corta seccin de unos 100 a 300 pares de bases y se separan los productos mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes (para conservar la conformacin buscada). Si se detecta una anomala, luego deber secuenciarse para especificarla. Esta tcnica es sencilla y econmica, y detecta un 70-95% de los cambios de base en el ADN.

Electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante Las molculas de ADN que se encuentran parcialmente desnaturalizadas se mueven ms lentamente en una electroforesis. Si un ADN es sometido a una electroforesis en gradiente de un agente desnaturalizante qumico o fsico (como la temperatura), la molcula migrar hasta el punto en que comience a desnaturalizarse y detenga su movilidad. Este es el principio de la tcnica de electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE, denaturing gradient gel electrophoresis). El punto donde comienza la desnaturalizacin es muy sensible a la secuencia, de manera que cualquier cambio en una base se reflejar en un cambio en la movilidad. Las mutaciones podrn detectarse por el cambio de movilidad en los productos de PCR entre la muestra problema y el ADN normal. Este mtodo detecta casi el 99% de las mutaciones, y resulta sencillo y operativo una vez que se han fijado las pautas de trabajo para cada fragmento de analizado. Sin embargo, el diseo de las condiciones ptimas de trabajo no es fcil, y se debe optimizar para cada fragmento de manera separada.

Test de interrupcin de la protena En muchos de los genes implicados en la aparicin de enfermedades, la mayor parte de las mutaciones que las provocan son del tipo non-sense o de cambio de marco de lectura, causando la interrupcin de la sntesis de la protena. La presencia de este tipo de anomalas se detecta utilizando el producto de una PCR como molde para una reaccin in vitro de transcripcin y traduccin. La protena truncada del gen mutado se puede detectar por electroforesis en gel. La ventaja de este test comparada con los descritos anteriormente es que slo detecta cambios que tienen significacin biolgica. El inconveniente es que no distingue los polimorfismos neutros de otros que causan problemas fenotpicos. Este ensayo suele utilizarse en el anlisis de cambios en genes supresores de tumores como BRCA1, BRCA2 y APC (poliposis adenomatosa) donde el 90-95% de las mutaciones son supresoras.

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Secuenciacin del ADN Los avances en la tecnologa de secuenciacin de ADN desarrollados en el Proyecto Genoma Humano han permitido abordar de manera sencilla y rutinaria la secuenciacin de genes de individuos sospechosos de tener una mutacin. En la secuenciacin de ADN se utilizan los secuenciadores automticos, que se basan en la diferente fluorescencia que emite cada base al ser exitada.

Rastreo cromosmico Cuando no puede identificarse una mutacin causante de una enfermedad gentica familiar, se precisa rastrear el cromosoma portador de la mutacin con el fin de diagnosticar el estatus de un embrin, por ejemplo. Generalmente se utilizan como marcadores microsatlites muy polimrficos, regiones de ADN que contienen mltiples copias de secuencias repetitivas cortas y que se emplean como marcadores genticos para rastrear la herencia familiar o mapear enfermedades en el genoma.

4. Laboratorios donde se realizan analisis geneticos

En nuestro pas existen varias instituciones que se dedican, algunas exclusivamente, a realizar los anlisis mencionados en este trabajo. A continuacin se mencionan varios ejemplos. 4.1. ORGANISMOS El Centro Nacional de Gentica Mdica (CeNaGeM), tiene como objetivo la realizacin de estudios e investigaciones que se relacionen con factores genticos y/o ambientales que intervengan en las causas de patologas de cualquier tipo, implementando nuevas tcnicas desarrolladas en relacin al diagnstico, pronstico y prevencin de enfermedades genticas. Adems de prestar servicios asistenciales, elaborar normas de diagnstico y tratamiento, y actuar como centro de referencia a nivel nacional, realiza programas de capacitacin para profesionales y tcnicos en gentica mdica, e implementa programas de docencia. En Capital Federal se encuentra el Primer Centro Argentino de Inmunogentica (PRICAI), perteneciente a la Fundacin Favaloro, que es pionero en esta rea. La inmunogentica cumple un rol fundamental en el estudio de la compatibilidad entre receptor y donante en los transplantes de rganos (estudios de histocompatibilidad) y en estudios de ADN con tcnicas de avanzada para anlisis forenses y de filiacin. Es el primer laboratorio de Latinoamrica y el nico de Sudamrica acreditado por la American Society for Histocompatibility and Immunogenetics (ASHI). En la actualidad es centro de referencia tanto para particulares como para organismos oficiales de la justicia de todo el pas. La Sociedad Argentina de Gentica Mdica, ubicada tambin en Capital Federal, merece una mencin a pesar de no comportarse como ente de investigacin, pues, adems de dictar cursos y conferencias, se encarga de establecer normas de trabajo e infraestructura para los laboratorios genticos.
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4.2. LABORATORIOS PRIVADOS En cuanto a instituciones particulares, podemos nombrar a BIOgenomic, ubicado en la ciudad de Vila Mara, Crdoba. Este laboratorio cuenta con varias prestaciones, entre las que se destacan la realizacin de cariotipos, biologa molecular, citogentica molecular, anlisis prenatal y anlisis de ADN e investigaciones forenses. GeneDX, un laboratorio ubicado en Capital Federal, provee, adems de los servicios de realizacin de anlisis, alojamiento para pacientes del interior del pas que tengan que viajar a Buenos Aires para realizarse las pruebas.

En la misma ciudad se encuentra FIBIO, un Centro de investigaciones biomoleculares que se dedica a la investigacin, docencia y prestacin de servicios en biologa molecular aplicada. Esta institucin ha presentado trabajos de investigacin en congresos nacionales e internacionales, recibiendo subsidios para la investigacin cientfica de la Fundacin Alberto Roemmers, y siendo premiada a la productividad cientfico- tecnolgica otorgados por la Universidad de Buenos Aires. Tambin ha desarrollado Jornadas y Talleres Prcticos de Biologa Molecular en Medicina en los que participaron profesionales de prcticamente todos los servicios asistenciales e institutos de investigacin del pas. Tambin en Buenos Aires estn: Primagen, que realiza diagnsticos prenatales, citogentica y diagnsticos moleculares; y Genda, que realiza diagnstico de enfermedades hereditarias, metablicas, mitocondriales, esterilidad y cncer, entre otros. Tambin est involucrado en inmunologa y transplantes, y citogentica. En la ciudad de La Plata se encuentra el Instituto Multidisciplinario de Biologa Celular, que posee unidades de investigacin en citogentica y mutagnesis, epidemiologa gentica, gentica molecular general y gentica molecular poblacional. Por ltimo, en nuestra ciudad, se encuentra la sede principal de los laboratorios IACA, los cuales cuentan con equipamiento moderno (entre el que se encuentran un secuenciador de Applied Biosystems, un equipo de PCR en tiempo real Roche, y cuatro termocicladores mas para PCR convencional) que le permite realizar varios tipos de anlisis. Entre ellos se encuentran la deteccion de SNP asociados a trombofilia y a hemocromatosis hereditaria. Para ello se aplica la PCR en tiempo real. Adems realizan PCR convencional para la deteccin de microdeleciones del cromosoma Y o genotipos con asociacin a riesgo cardiovascular y a la enfermedad de Alzheimer. Asimismo, poseen una seccin de Citogenetica en la cual se realizan cariotipos por medio de distintas tcnicas.

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5. Conclusion
La realizacin de este trabajo prctico supuso un gran desafo, ya que nos enfrentamos con una variedad de conceptos desconocidos, y con muchas tcnicas nuevas para nosotros. Al final, pudimos comprobar que la ejecucin de anlisis bioqumicos comprende una gran variedad de aplicaciones, ms all de los anlisis de rutina. Los ensayos de anomalas genticas y cromosmicas representan un instrumento invalorable en el diagnstico de enfermedades asociadas a dichos problemas. Gracias a ellos es posible la identificacin, en algunos casos temprana, de gran cantidad de patologas, imposibles de confirmar por otros medios, permitiendo la aplicacin de un tratamiento que puede incluso salvar la vida del paciente, o mejorar su calidad.

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Bibliografa
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Indice
1. Introduccin...................................................................................................................................................... 3 2. Introduccin a los anlisis genticos...................................................................................................... 4 2.1. Situaciones en las que se plantea la realizacin de un anlisis gentico....... 4 2.2 Los tres desafos a resolver en un anlisis gentico.. 5 2.3. Material biolgico que puede ser utilizado en los ensayos.. 6 3. Mutaciones 8 3.1 Tipos de mutaciones............................................................................................................................. 8 3.2 Anlisis de mutaciones conocidas................................................................................................... 9 3.2.1. Generalidades............................................................................................................................... 9 3.2.2. Estrategias de reconocimiento de mutaciones especficas.......... 10 3.2.3. Ejemplos de deteccin de anomalas genticas conocidas.......................................... 12 3.3. Anlisis de mutaciones desconocidas. 17 4. Laboratorios donde se realizan anlisis genticos........................................................................... 19 4.1. Organismos....... 19 4.2 Laboratorios Privados. 19 5. Conclusin. 21 Bibliografa.. 22

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