Validación de Métodos

Francisco Rojo Callejas

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 Validación de Métodos

Definiciones
Parámetros básicos
Requisitos

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 Validación de Métodos
• El proceso de definir las condiciones analíticas y
confirmar que el método cumple los objetivos.
• El objetivo es garantizar que el método y el
lugar donde se implementan son capaces de
lograr resultados rutinarios dentro de las
especificaciones del método y que sus
resultados son confiables.

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Parámetros que otorgan validez
• Selectividad y Especificidad
• Precisión
– Repetibilidad
– Reproducibilidad intermedia (intra-laboratorio)
– Reproducibilidad Inter-laboratotrio
– Incertidumbre combinada de la medición
• Exactitud
– Materiales de referencia (trazabilidad)
– Ningún error sistemático en todo el intervalo de trabajo
• Linealidad, intervalo lineal y de trabajo
• Límites de detección y cuantificación
• Ausencia de efectos de matriz
• Estabilidad de la muestra
• Robustez
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 ¿Cuando hay que validar?
• Si se pretende una acreditación (EMA,
ISO/CIEC 17025) o certificación (ISO 9000)
• Cuando se desarrolla un método nuevo
• Si se adquiere un equipo nuevo se necesita una
transferencia de método.
• Cuando se le hace algún cambio significativo a
un método validado.
• Cuando se quiere demostrar que el método
propio es equivalente a uno publicado

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 Validación

• Las normas internacionales y las normas

mexicanas de acreditación y certificación
obligan a la validación de métodos.
• Opciones:
– Validación total de un método propio o nuevo: es
necesario validar todos los parámetros
– Implementación de un método validado: Solo hay que
evaluar linealidad, exactitud, repetibilidad y si aplica,
límite de detección y cuantificacción.

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 Implementación de Métodos
Validados
Si se va a montar un método oficial, o previamente
validado y publicado, solo se necesita evaluar:
• Linealidad
• Precisión (repetibilidad)
• Exactitud
• Incertidumbre de la medición
• Si aplica, límite de detección y cuantificación

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 Validación de Métodos
• La Selectividad y Especificidad es
fundamental en ellos
• Se requiere evaluar casi todos los
parámetros, puede que algunos no
apliquen

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 Selectividad / Especificidad
• Es la habilidad del método para medir solo lo que se
pretende.
• Debe confirmar que la medición obtenida proviene única y
exclusivamente del analito, las interferencias pueden
diferenciarse.
• Es muy común el uso de adiciones patrón (spiked samples)
• Si por la naturaleza de la medición el método es
inherentemente específico, no se necesita evaluar (p. ej. pH)
• En cromatografía es necesario el uso de un segundo método,
o segunda columna con selectividad diferente para demostrar
especificidad.

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 Selectividad/Especificidad
Que hacer Que medir Notas

Analizar muestras y Confirmar que el método a Planear el experimento

materiales de referencia por validar únicamente mide el ANTES de iniciar la
el método a evaluar y por analito de interés, separado validación, dependiendo del
otro método independiente, de las posibles método, el analito y las
trazable. interferencias. interferencias.

Analizar muestras Investigar el efecto de cada Desde el desarrollo del

conteniendo las posibles interferencia, de haberlo, método deben enumerarse
interferencias, en presencia puede ser positivo o incluso las posibles interferencias,
del (los) analito (s). negativo (quenching). ANTES de iniciar la
validación.

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 Ejemplo: especificidad de una
cuantificación cromatográfica.
• 1) Blanco (matriz) — sin analito
• 2 Matriz adicionada del analito
• 3) Matriz adicionada de interferencia
• 4) Matriz adicionada de otras interferencias
(triangulo de Pascal)
• 5) Muestra sola
• 6) Muestra adicionada del analito
• 7) Muestra adicionada de interferencia
• 8) Muestra adicionada de otras interferencias

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 Selectividad/Especificidad Cromatográfica

• El método puede considerarse específico si:

• El analito solo aparece en la matriz adicionada del mismo y en las muestras
• La señal del analito se incrementa de la muestra sola a la muestra
adicionada del mismo.
• Las interferencias dan picos separados del analito y no modifican su forma
ni área.
• El uso de una segunda columna (o fase móvil en HPLC) con
SELECTIVIDAD diferente confirma la identidad del analito
• Alternativamente, el uso de GC/MS o HPLC/MS corrobora la
identidad.

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 Precisión
Las mediciones tienen baja dispersión

• Repetibilidad
Una vez fijas las condiciones de trabajo, al realizar n
veces la medición de una muestra la dispersión de
los resultados es aceptable. (mismas condiciones,
mismo operador)

• Reproducibilidad (intra e inter-laboratorio)

Si se cumplen las condiciones del método, se logran
resultados similares, independientemente del
operador, el lugar, el instrumento o los materiales.
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 Precisión
• La precisión se evalúa a tres niveles:
• Repetibilidad: El análisis repetido de una muestra, por el mismo
analista, con el mismo instrumento en un lapso corto de tiempo. La
mayoría de las normas aceptan valores del 2% relativo o menores.
• Reproducibilidad intra laboratorio: El análisis repetido de la misma
muestra por diferentes analistas, con instrumentos diferentes, en
diferentes días, en el mismo laboratorio, en un intervalo de tiempo
amplio. La AOAC le llama “ruggedness”, variabilidad.
• Reproducibilidad ínter laboratorios: El análisis repetido de la misma
muestra en laboratorios diferentes, con analistas y equipos
diferentes, en un intervalo amplio de tiempo

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 Exactitud

• Mide la diferencia entre el

valor real, o aceptado como
tal, y el valor obtenido por el
método propuesto

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 Exactitud
• Es la medida de que los resultados obtenidos
son comparables con los valores aceptados de
un material de referencia o estándar certificado.
• Si no existen materiales de referencia, es
posible usar materiales propios, perfectamente
caracterizados.
• La exactitud nos permite garantizar la ausencia
de errores sistemáticos.

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 Aspectos generales:
Trazabilidad
La trazabilidad es importante, ya que permite la comparación de los
resultados propios con los de otros laboratorios.
La trazabilidad se logra:
• Usando estándares para la calibración del equipo (materiales de
referencia, balanzas certificadas, etc.)
• Usando materiales de referencia puros, trazables a estándares
internacionales (p. ej. NIST).
• Usando materiales de referencia certificados en matrices
apropiadas, también trazables a estándares internacionales.
• Usando un método validado ya publicado.
• Comparando los resultados logrados contra los de un método
publicado.

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 Trazabilidad
• Al adquirir materiales de referencia puros y/o
certificados, vienen acompañados de certificado
impreso, con pureza y contenidos.
• Si no existen materiales de referencia, se deben
adquirir los de mayor pureza disponible.
• Si no existen en el mercado, solo entonces es
posible utilizar muestras propias.

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FRC
 Exactitud
• Para implementar métodos oficiales de
análisis (EPA, AOAC, ASTM, USP, etc.)

Usar materiales de referencia (p. ej. NIST),

preferentemente uno de baja concentración y
otro de alta concentración.

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 Exactitud
• Para métodos de uso interno:

Se estudian muestras enriquecidas con un

estándar puro del compuesto de interés y se
demuestra que la cantidad adicionada y la
medida son iguales en todo el intervalo de
trabajo.

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 Linealidad
• Se necesita un mínimo de seis puntos de
calibración MAS el blanco, espaciados
uniformemente en todo el intervalo de trabajo.
• El factor de correlación r2 debe ser mayor de
0.99
• Es obligatorio trazar el gráfico de residuales y
observar una distribución aleatoria en el.
• La frecuencia de re-evaluación es variable.
• Al desarrollar métodos es necesario evaluar el
intervalo lineal y el intervalo de trabajo

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 Linealidad
• Linealidad del sistema
La respuesta del proceso de medición es
lineal en el intervalo de concentraciones
requerido. Determinar intervalo lineal e
intervalo de trabajo.
• Linealidad del método:
Es la exactitud de la medición en todo el
intervalo de trabajo.
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 Linealidad
• Intervalo lineal: Intervalo, desde el límite
de detección, hasta la máximo
concentración en que la respuesta del
método se comporta linealmente.
• Intervalo de trabajo: El intervalo que se
utilizará en el trabajo rutinario, las
muestras estarán dentro de los límites de
este y debe ser menor al intervalo lineal.

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Linealidad, intervalos de trabajo

Tipo de análisis Intervalo de trabajo

Compuesto principal 70 – 130% de la

concentración de las
muestras
Impurezas 50 – 120% del contenido
máximo aceptable
Compuestos cuyo Desde 20% por debajo de
contenido varía la especificación mínima
hasta un 20% por encima
de la máxima
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 Definiciones de límites
•Límite de decisión (Lc)
Aquella cantidad que si decimos que está presente
podríamos equivocarnos, pues probablemente no esté
presente. POR DEBAJO DEL LÍMITE DE DECISIÓN EL
RESULTADO ES CERO.
•Límite de detección (Ld)
Cantidad que si decimos que no hay, podríamos
equivocarnos, lo mas probable es que sí esté presente. POR
ENCIMA DEL LIMITE DE DETECCIÓN ESTAMOS
SEGUROS DE LA PRESENCIA DEL ANALITO.
•Límite de cuantificación (Lq)
Cantidad que podemos reportar con una incertidumbre
máxima aceptable.
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 Límite de decisión (Lc)
• Límite de decisión (Lc)
Aquella cantidad que si decimos que está
presente podríamos equivocarnos, pues
probablemente no esté presente. POR
DEBAJO DEL LÍMITE DE DECISIÓN EL
RESULTADO ES CERO.
n −1 s
α
Lc = tα
blanco
n
Lc
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 Límite de detección (Ld)

Cantidad que si decimos que no hay, podríamos

equivocarnos, lo mas probable es que sí esté
presente. POR ENCIMA DEL LIMITE DE
DETECCIÓN ESTAMOS SEGUROS DE LA
PRESENCIA DEL ANALITO

blanco

n −1 s
α Ld = 2tα
Ld n
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 Límite de cuantificación
• La cantidad mas pequeña que podemos
reportar con determinada variación
máxima.
Lq = µq ± ICq
tal que :
ICq
≤ variacion aceptable (E %)
µq
100 σˆ
Lq = tα
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E% 2 n
 Límite de detección, cálculo
• Diferentes opciones, dan diferentes
resultados.
– 3 veces el nivel del ruido (α=0.04%)
– Estimado a partir de la curva de calibración
– Usando la incertidumbre de un estándar
cercano al Ld (EPA, CFR).
– Usando la incertidumbre del blanco

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 Robustez
• En que medida el método analítico resiste cambios
pequeños, pero deliberados de sus parámetros
operacionales. Nos da información de su confiabilidad
durante el uso rutinario.
• Nos indica como se comportará el método si no se
implementan perfectamente sus condiciones
experimentales.
• Prueba cuáles son las variables críticas del método,
generalmente estas se identificaron durante el
desarrollo.
• Si el método involucra extracciones, es obligatorio
evaluar el recobro
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 Evaluación de la Robustez

Procedimiento Cálculos Notas

Listar variables críticas y Cuantificar efectos relativos de Garantizar que en todo el

normales. Diseñar cada variable, ordenarlas en experimento las variables
experimentos que prueben los función de la magnitud del críticas permanecen bajo
efectos sobre exactitud y efecto. control.
precisión

En cromatografía es necesario Todos los parámetros Resolución > 2

probar la validez del método cromatográficos Coleo < 1.8
(Especificidad). Número de platos acorde a la
técnica y dimensiones de la
columna

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 Robustez, efecto de la
concentración del analito
Procedimiento Cálculos Notas

Analizar matriz, muestras % Recobro = (Ci — C2)/ C3 x Generalmente se obtienen

puras y enriquecidas a
diferentes concentraciones, por
lo menos seis veces cada una.
100
C1 = concentración medida en
la muestra o matriz
enriquecidas.
C2 = Concentración medida en
la muestra, o matriz sin
enriquecer.
C3 = Concentración
adicionada.
si usa un estándar certificado,
calcule el recobro en base al
valor certificado.
resultados superiores a los de
muestras reales, ya que en
estas últimas el analito está
generalmente mas retenido por
la matriz.
Pueden resultar recobros
mayores al 100% dada la
relativa falta de exactitud y/o
precisión del método

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 Incertidumbre combinada
(Propagación del error)
• Al realizar una medición se involucran diversos
pasos, cada uno de ellos tiene una determinada
incertidumbre, y los errores de cada paso se
van acumulando hasta afectar la incertidumbre
d ela medición final.

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 Incertidumbre combinada
(Propagación del error)
• Cuatro pasos para estimarla:
• 1: Definir el mesurando
• 2: Identificar las fuentes de incertidumbre
• 3: Cuantificar cada fuente de incertidumbre.
• 4: Calcular la incertidumbre combinada.

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 Fuentes típicas de incertidumbre

• Muestreo
• Almacenamiento
• Instrumentos de medición
• Pureza de reactivos
• En pruebas microbiológicas, eficiencia del medio
• Condiciones de medición (T, P, g, ASNM, hora, etc)
• Efectos de matriz
• Cálculos numéricos (dígitos de cálculo de ordenador y redondeo)
• Aproximaciones
• Blanco
• Operador
• Efectos aleatorios

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 Expresión del Resultado Final
• Reporte sus resultados junto con la
incertidumbre como:
• ‘Resultado’ ± ‘Incertidumbre combinada con
factor de cobertura’ ‘unidades’ con un `nivel de
confianza’
• Ejemplo: Silicio, 87.65 ± 0.11 mg/L al 95 % de
nivel de confianza
• Exprese la incertidumbre combinada con
máximo dos dígitos.

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