Está en la página 1de 44

BIOTECNOLOGIA AVANZADA TRABAJO FINAL: ESTUDIO DE CASO. APLICACIONES DE LA BIOTECNOLOGÍA EN LA INDUSTRIA ENOLOGICA

Presentado por:

NIDIA LUCELY MESA RAMIREZ Código: 52905254 GRUPO: 201003_5

Tutora:

FEDRA LORENA ORTIZ

UNIVERSIDAD NACIONAL ABIERTA Y A DISTANCIA UNAD ESCUELA DE CIENCIAS BASICAS, TECNOLOGIA E INGENIERIA ESPECIALIZACION EN INGENIERIA DE PROCESOS DE ALIMENTOS Y BIOMATERIALES Bogotá, 04 de Diciembre de 2010

2

INTRODUCCIÓN

Aquí, bajo este templo donde el vino sabe rezar aromas y sabores; aquí, donde inspirados ruiseñores gorjearon su verso a lo divino; aquí, donde el pincel de los pintores aquí, donde el silencio se hace trino y la palabra pámpanos de amores; se hace abrazo floral, beso taurino. Aquí, donde se escribe la alegría, donde cabe en un vaso el universo y el corazón se sueña palmo a palmo; aquí, mosto cordial de la poesía, el vino se recita como un verso y la amistad se reza como un salmo. Tomado de: La Bodega. José María Fernández Nieto.

El vino parece haber nacido con el hombre, ha sido siempre su alegría y uno de los

mayores placeres de los que ha disfrutado, su inspiración y uno de los principales motores

de la cultura occidental.

A la luz de conocimientos recientes, sabemos que la vid tanto silvestre como

vinífera existe desde la Era Terciaria puesto que se ha encontrado hojas registradas en las piedras y semillas en asentamientos prehistóricos, en tumbas, pirámides y en pequeñas ánforas en las ruinas de ciento de ciudades.

Con el siguiente trabajo se pretende analizar la aplicabilidad de la biotecnología en la industria enológica.

Inicialmente se describe el proceso de producción del vino e identificando los puntos críticos de control desde la recepción de materias primas hasta el llenado de las botellas.

Posteriormente se resuelven los interrogantes planteados en la guía para el estudio de caso, describiendo las principales características de la levadura Brettanomyces/Dekkera, identificando en el proceso de la industria enológica los PCC para su control, así como las técnicas usadas en su detección y eliminación cuando se ha instalado en la industria vinícola. Se analizan resultados obtenido por detección de PCR en su estudio. Se presentan otros contaminantes biológicos en la industria enológica y sus consecuencias.

3

JUSTIFICACION

La industria enológica constituye una fuente importante de ingresos. En el proceso de producción de vinos, particularmente aquellos de guarda, las levaduras juegan un rol fundamental; sin embargo, una de ellas, Brettanomyces, puede contaminar los caldos destruyendo la producción.

Las levaduras del género Brettanomyces o Dekkera (su forma sexuada) son causantes de un desagradable aroma y sabor descrito como spoilage y off-flavor en cervezas y vinos, provocando en algunos casos la pérdida del producto vinificado. Las características de aroma de sus metabolitos causantes se han asociado a la presencia de etilfenoles en cantidades excesivas.

En algunos casos también se ha notificado alteraciones de la coloración del vino asociado a la presencia de Brettanomyces, en la cual la concentración del agente es de 10 3 o mayor.

Por otra parte, Dekkera bruxellensis se ha aislado de bebidas alcohólicas, donde se ha visto que produce compuestos fenólicos (4-etilfenol [4EP] y 4-etilguayacol), a través de la enzima cianato decarboxilasa, los que serían responsables de las alteraciones aromáticas del producto vinícola definidos como medicinales, aromas picantes o a clavo, o aromas a “perro mojado”, además de la producción de aminas en vinos rojos En algunos casos, altos niveles de 4EP no se han correlacionado con cantidades apreciables de Dekkera, lo que se explicaría por la utilización de medios inadecuados y la presencia de flora contaminante, los que actuarían como encubridores de dichas cepas

Por esto, el diagnóstico temprano y oportuno de este microorganismo reducirá pérdidas importantes en la industria enológica; esto se puede hacer mediante técnicas de ultima tecnología como el Método de PCR.

4

PROCESO DE ELABORACION DEL VINO

Definición

La ley nacional 14.878 de Argentina define que solo se considera vinos genuinos a los obtenidos por fermentación de la uva fresca, elaborados dentro de la zona de producción. En consecuencia, la ley de nuestro país niega el nombre de vino genuino a los vinos elaborados con pasas de uva y a los obtenidos de uvas frescas vinificadas fuera de la zona de producción, y con más razón aún a las bebidas elaboradas con ingredientes distintos de uva fresca, aun cuando el producto terminado, por su composición química y caracteres organolépticos, se identifique con los de vino genuino. Por lo tanto, la única materia prima legalmente apta para la elaboración de vino es la uva fresca en su zona de producción. El término vino se aplica a una bebida alcohólica elaborada por fermentación del jugo, fresco o concentrado, de frutas o bayas. La mayor parte del vino, sin embargo, se obtiene por fermentación del jugo de uvas frescas y el término, a falta de más aclaraciones, se entiende que responde a esta segunda definición. La graduación de los vinos varía entre un 7 y un 16% de alcohol por volumen; la mayoría de los vinos embotellados tienen entre 10 y 14 grados. Los vinos dulces tienen entre un 15 y 22% de alcohol por volumen.

Producción y Tipos de Vinos

El principio que guía la elaboración del vino es sencillo. Las uvas recién recogidas son prensadas para que liberen su zumo (llamado mosto), que es rico en azúcares fermentables. Las levaduras transportadas por el aire, o la adición de levaduras seleccionadas al mosto, provocan la fermentación de éste. Los principales productos de la fermentación son alcohol etílico y dióxido de carbono. Este último es liberado en forma de

5

gas. La fermentación se interrumpe normalmente cuando todos los azúcares fermentables han sido transformados en alcohol y dióxido de carbono, o cuando la concentración del primero supera la tolerancia de las levaduras. El mosto es ahora vino. Existen, no obstante, muchas variantes de este proceso. Las principales entran en juego para producir vinos blanco, tinto y rosado, vinos espumosos y vinos dulces. Otras variantes se usan para mejorar la calidad de los vinos anteriormente mencionados. El jugo de la mayoría de las uvas, incluido el de la mayoría de las uvas rojas, es incoloro. Las uvas blancas se prensan inmediatamente después de su recogida o vendimia y el jugo se separa de la piel antes de la fermentación para obtener vino blanco. (Tratadas de igual modo, la mayoría de las uvas rojas también producen vino blanco) Por el contrario, no es posible hacer vino tinto con uvas blancas. Para hacer vino tinto, las uvas rojas se aplastan y el mosto pasa parte o la totalidad del periodo de fermentación y, en muchos casos, un periodo de maceración previo o posterior a la fermentación, en contacto con las pieles u hollejos. Toda la materia colorante, además de múltiples compuestos saborizantes y taninos, se encuentran en los hollejos donde son liberados por los procesos de fermentación y maceración. Esta liberación se intensifica a menudo por técnicas de activación mecánica y/o enzimáticas. El vino rosado suele hacerse empleando uvas rojas que sólo permanecen en contacto con los hollejos durante un breve periodo de tiempo. Con menor frecuencia se obtiene mezclando vinos tinto y blanco. El vino espumoso (el que contiene dióxido de carbono disuelto, que se libera en forma de burbujas cuando se abre la botella) se elabora siguiendo una serie de métodos diferentes. El más barato y simple es la carbonatación, una técnica muy utilizada en la fabricación de bebidas refrescantes: se bombea dióxido de carbono en el vino, que se embotella a presión. El más primitivo es el embotellado del vino antes de finalizar la fermentación, y produce un vino ligeramente espumoso, a veces ligeramente dulce, con sedimento. La temperatura, en especial la temperatura de fermentación, es una variable importante. La mayoría de los vinos blancos se fermentan hoy en frío empleando algún tipo de refrigeración para preservar su frescura y su aroma. Los vinos tintos, por el contrario, se hacen fermentar a temperaturas más elevadas, a menudo a la temperatura ambiente de la

6

época de la vendimia. Se cree que las temperaturas óptimas de fermentación se encuentran entre los 9 y los 18 °C en el caso de los vinos blancos, y entre los 20 y los 30 °C en el de los tintos. La refrigeración se usa también para estabilizar los vinos antes del embotellado. En general, cuanto menos se mueva físicamente el vino, mayor será su calidad. Con todo, entre las manipulaciones de mejora de la calidad, hay que incluir las diversas formas de maceración que se aplican a los vinos tintos para darles color, sabor y contenido en taninos (en ocasiones se hace lo contrario: los vinos tintos ligeros, afrutados, se producen a menudo por fermentación de la uva entera, también llamada maceración carbónica, en la que las uvas rojas no son ni aplastadas ni maceradas, sino que fermentan enteras en un entorno anaerobio). Las „heces‟ del vino, depósitos de sedimentos, añaden a éste sabores deseados, y éstas pueden agitarse tras la fermentación para aumentar la absorción de sabores por parte del caldo. La clarificación de mostos o vinos puede lograrse por mecanismos físicos como la aplicación de la fuerza centrífuga, así como por efecto de la gravedad. La filtración es un medio importante para clarificar y estabilizar el vino, aunque empleada en exceso puede resultar dañina para su calidad. Los principales aditivos empleados en la elaboración del vino son, en las regiones vinícolas más frescas, el azúcar o mosto rectificado, que debe añadirse al mosto para incrementar el contenido final en alcohol (lo que recibe el nombre de chaptalización); en las regiones vinícolas más cálidas hay que añadir acidez al mosto para mejorar el equilibrio del producto final (ajuste de acidez). Otras adiciones incluyen el tanino, productos para clarificar el vino y esquirlas de roble (como saborizante). Todos los vinos tintos y algunos blancos experimentan, tras la fermentación primaria, una transformación bacteriológica llamada fermentación maloláctica, que puede garantizarse añadiendo bacterias lácticas al mosto en fermentación o al vino. El tipo de depósito en el que se almacena el vino afecta también a su sabor. Algunos contenedores, como los tanques de acero inoxidable, son neutros, y se emplean para los vinos en los que sólo se desea obtener el sabor de la uva fermentada; por contraste, los recipientes de madera, y en especial los pequeños de madera nueva, se utilizan para modificar y mejorar el sabor del vino. El sabor de todos los vinos cambia con el tiempo. La mayoría de ellos se deterioran y deben consumirse tan pronto como sea posible. Los vinos de mayor precio, por otra parte,

7

tanto los blancos como, con mayor frecuencia, los tintos, mejoran con el almacenamiento, generalmente en botella. Los periodos óptimos de almacenamiento son muy variables, pero sólo una exigua minoría de vinos mejora con un almacenamiento de más de diez años. La última etapa de la producción del vino comprende el envasado, el tapado, el etiquetado y el embalaje.

Operaciones Comunes a Todas las Vinificaciones

Cosecha

Una vez que la uva ha alcanzado la maduración deseada se realiza la recogida de la uva. Es importante realizar una selección del fruto sano separándolo del dañado

Transporte

Es un momento delicado que debe realizarse de la forma menos agresiva, evitando que el grano de uva sufra presiones excesivas y se rompa, provocando fermentaciones tempranas, ya que por lo general se realiza a granel.

Pesada

Los tipos de básculas que se instalan en los establecimientos vitivinícolas deben ser de una precisión tal que podamos controlar perfectamente el Kg. Y de un largo tal que permita pesar equipos (camión y acoplado). La relación uva vino es de 1,250 kg/L

8

Descarga

Se realiza sobre la "tolva de recepción", una especie de pirámide truncada invertida, que irá acumulando la uva sobre una cinta "sin fin" que la transportará a la estrujadora. En la tolva se analiza el fruto para determinar su estado sanitario y su contenido en azúcares y ácidos

Molienda

Tiene por objeto romper el grano de uva para lograr la liberación del mosto, que al ponerse en contacto con las levaduras (naturales o agregadas), en óptimas condiciones inician la fermentación. La molienda va acompañada del derasponado. La molienda puede ser reemplazada por el prensado, que se hace en grandes prensas tipo Vaslín, Wilmes, Buccolini, etc. El prensado se utiliza generalmente en la elaboración de vinos blancos de calidad. La estrujadora rompe por presión el grano, pero lo justo para que no se rompan las partes duras del racimo (pepitas, raspones y hollejos) y contaminen el mosto. La pasta viscosa resultante se trasladada mediante diversos métodos a las prensas, evitando que entre en contacto con el aire para evitar una fermentación prematura de la fermentación.

Figura 1. Proceso de molienda

de la fermentación. Figura 1. Proceso de molienda Fuente:

9

Sulfitado

Es una operación que se debe realizar inmediatamente después de la molienda. El método tradicional de la incorporación de SO 2 , es el de agregarlo en la vasija de fermentación luego de su encubado. Lo ideal sería incorporarlo después de la molienda. En la actualidad existen sulfitadores que incorporan mediante una bomba dosificadora el SO 2 , en solución acuosa, en la cañería que conduce el mosto a la vasija de fermentación. Las propiedades del SO 2 son: antioxidante, estimulante, solubilizante, defecante, antienzimático, acidificante, bactericida, selectivo; lo que hace de este aditivo una sustancia irremplazable en la fermentación. Las dosis normales de SO 2 , en la fermentación, son de 5 a 15 g/hL (150 mg/L), el límite legal del SO 2 es 210 mg/L

Encubado

y ponerla en

condiciones para que inicie una óptima fermentación, por lo cual deben hacerse los controles y las correcciones necesarias, como son: sulfitado, corrección de la acidez,

agregado o no del pie de cuba, control de temperatura, control de grado Baumé, etc.

Consiste en colocar la uva molida en

la vasija fermentadora,

Pie de cuba

Consiste en seleccionar las mejores levaduras indígenas del medio. El pie de cuba se puede lograr mediante selección de: 1- Levaduras indígenas o 2- Incorporación de preparados de levaduras seleccionadas.

10

Levaduras indígenas

Consiste en cosechar anticipadamente una cantidad de uva, encubarla en óptimas condiciones, a fin de que se multipliquen las levaduras más aptas. Cuando este se encuentra en plena fermentación, se incorpora en proporciones variables de acuerdo al criterio técnico, al resto de la uva en proceso de vinificación.

Levaduras seleccionadas

A la uva recién molida, dispuesta en óptimas condiciones se le incorporan preparados de

levaduras seleccionadas, que dominan rápidamente el medio y de esa forma, podemos obtener con seguridad el pie de cuba de las levaduras o levaduras que deseamos sembrar.

Fermentación

Es un proceso por el cual los azúcares se transforman en alcohol, CO 2 y otros que se encuentran en menor cantidad y que se conocen con el nombre de productos secundarios de

la fermentación, debido a la actividad enzimática producida por las levaduras. Este proceso

biológico se produce con una importante liberación de energía, debe ser controlado, a fin de que las levaduras se encuentren en un medio adecuado para desarrollar su actividad; la concentración de azúcares, la temperatura, la acidez, el pH, el desprendimiento de CO 2 , el

alcohol, son factores que inciden sobre la actividad de las levaduras, y que deben ser controlados y regulados a fin de que en el proceso se desarrollen normalmente. La cantidad de azúcar necesaria para producir un grado de alcohol (1% en vol.), es de 17.5 g/L, lo que equivale a 1° Be. (Baumé). Las levaduras pueden metabolizar a los azúcares de dos formas: oxidativamente y fermentativamente.

11

En la primera las levaduras transforman los azúcares en CO 2 , y H 2 O y pequeñas cantidades de alcohol, aprovechando esta energía para multiplicarse. En la segunda las levaduras escasamente se multiplican y producen grandes cantidades de alcohol.

Glucosa CO 2 + alcohol + H 2 O

40 Cal/mol

De las 40 calorías liberadas, 14.6 son utilizadas por las levaduras para su metabolismo; la diferencia, es decir, 25.4 calorías se liberan en forma de calor, provocando el calentamiento del mosto.

Refrigeración

Como hemos visto, la fermentación de 180 g de azúcar por litro, correspondía a una elevación de la temperatura de 25,4°C, que en la práctica se reduce a unos 10 a 15 °C. Si suponemos que la temperatura promedio al ingreso de la uva, oscila entre los 25 y 29°C, y que la temperatura de fermentación es de alrededor de los 30°C; es necesario enfriar el mosto de fermentación de 2 a 11° C/L.

Descube

Consiste en la separación del líquido de la fase sólida. El momento del descube lo determina el técnico, en base a la concentración de azúcar y a la temperatura de fermentación. El mayor o menor tiempo de fermentación, así como la mayor o menor maceración que haya sufrido el vino, determinará que éste sea más o menos suave, de color más o menos intenso, debido a la extracción de sustancias tánicas y colorantes de hollejo. De todas formas, podemos decir que el momento adecuado para el descube, es cuando existe una concentración azucarina de 5° Bé.

12

El inconveniente que surge es que si se consume totalmente el azúcar, debido a la disminución de la densidad y al desprendimiento de C0 2 , y el sombrero se puede sumergir provocando dificultades en el descube. Nunca debe disminuir a menos de 2° Bé, para evitar riesgos de que baje el sombrero. El mosto tiene una densidad superior a 1, mientras que el vino, por la transformación de los azúcares en alcohol, tiene una densidad inferior a 1.

Extracción De Los Orujos

Consiste en extraer del interior de la vasija el orujo que ha quedado luego del descube. Esta operación, generalmente se hace en forma manual, mediante carros o tornillo sin fin. Es por eso que las vasijas de fermentación deben tener una puerta lo suficientemente grande, como para permitir la entrada de un operario y, de una, dos o más tapas, de acuerdo con el tamaño de la vasija a fin de permitir una buena ventilación para desplazar el CO 2 y las sustancias volátiles de la fermentación, para que no dificulte el trabajo del personal.

Prensado

Consiste en la extracción del líquido que se encuentra embebido en el orujo. Esta operación se realiza mediante prensas continuas o discontinuas y prensas neumáticas. Las prensas continuas están compuestas por un tornillo sin fin y una malla perforada, con una tapa regulable a la salida de la misma. Las prensas discontinuas pueden ser mecánicas o hidráulicas, esta última es la más utilizada. El vino que se obtiene del prensado se identifica como vino prensa y generalmente se mantiene separado del resto del volumen, y se le realizarán tratamientos específicos y luego se lo corta proporcionalmente con el resto, para hacer los cortes de libre circulación, o se les da otro destino, como el de ser enviados a la

13

destilería. El vino prensa es rico en sustancias tánicas y en alcohol metílico, por ello no se lo destina directamente al consumo. El límite de alcohol metílico establecido por nuestra legislación es de menos de 0,35 mL/L

Trasiego

Una vez efectuado el descube el vino continúa fermentando, esta vez en forma más tranquila; esta fase de la fermentación se conoce con el nombre de fermentación lenta, y consiste en la transformación de los últimos gramos de azúcar en alcohol, y una vez que va finalizando se va produciendo la precipitación de partículas, entre ellas tejidos vegetales, sales tartáricas, partículas extrañas. Lo que constituye las borras y es necesario de separar del vino lo antes posible a fin de que éstas no le comuniquen gustos extraños, ni sustancias, que puedan ser elementos nutritivos para otros microorganismos (utolisis de las levaduras), en el primer trasiego. Una vez terminada la fermentación lenta, el primer trasiego se hace lo antes posible dentro de los 7 o 10 días; luego se puede efectuar un segundo y un tercer trasiego antes de la clarificación. El últimos de estos debería efectuarse una vez que el vino a sufrido los efectos benéficos del frío, es decir a fines del invierno

Clarificación

Consiste en incorporar al vino una sustancia de estado coloidal, que por razones físico-químicas, coagula en forma recíproca con otras sustancias del vino y al precipitar provoca la limpidez por acción mecánica o físico-químicas. Los principales clarificantes utilizados en enología son minerales, orgánicos y de síntesis industriales entre los que podemos mencionar: bentonita, gelatina, caseína, hemoglobina, albúmina, etc. Para cada tipo de vino existe un clarificante adecuado; por ejemplo: para la clarificación de tintos debería utilizarse gelatina, porque coagula en forma recíproca con el tanino, eliminándolo y por otro lado arrastra muy poco calor. Para vinos blancos se debería utilizar

14

caseína, porque arrastra mucho color y no produce sobre encolado (exceso de clarificante). El clarificante más usado es la bentonita que se la utiliza indiferentemente para cualquier vino común.

Filtración

Consiste en hacer pasar un líquido turbio a través de un lecho poroso, donde quedan retenidas las partículas que hacen el turbio. Esto se logra a través de diferentes medios. Por dos efectos mecánicos y físico químicos las partículas son retenidas porque simplemente su tamaño es mayor a los de los poros del lecho, en el mecánico. En el físico-químico, las partículas que cargadas estrictamente son retenidas por efecto de cargas de diferente signo. Entre los filtros más usados, podemos citar los filtros aluvionales, los filtros de placa, los filtros de prensa y los filtros al vacio. Los primeros para lograr la limpidez del vino, en algunos casos se logran una adecuada eliminación de microorganismos. Los segundos, de placa, se los utiliza como filtros esterilizantes, generalmente antes del embotellado. Los filtros de prensa se los utiliza exclusivamente para filtrar borras.

Defectos que puede presentar el vino

El vino ácido o agrio es descartado como vino, o considerado como vino malo. La acidez de un vino puede estar causada por dos factores:

Inmadurez de la uva al momento de producir el vino. Esta se detecta a través de un sabor a tártaro (ácido). Este defecto puede ser remediado dejando añejar la botella.

La acidez causada por una mala vinificación no puede ser remediada, y se detecta por un gusto a vinagre. (que en definitiva es la utilización que se le da a ese tipo de vinos defectuosos). Un vino pasado es reconocido por un cambio en su color y por tornarse acuoso.

15

Los vinos rosados tienen un periodo en el que generan un olor nauseabundo, llamado periodo de mareo de la botella, el que desaparece pasado cierto tiempo (semana o meses). El último defecto que puede presentar el vino, se origina en malos corchos, donde estos degeneran el sabor de la bebida.

PUNTOS CRITICOS DE CONTROL EN LA INDUSTRIA ENOLOGICA

Aunque sistema el sistema HACCP siempre estuvo relacionado con la prevención de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA), actualmente se está implementando

cada vez más con otra finalidad, que no es la de asegurar la inocuidad, sino la de cuidar la calidad comercial de los productos. En el vino como alimento, debido a sus características

de contenido alcohólico, pH, etc., deberá controlarse, desde el punto de vista organoléptico,

el crecimiento de levaduras indeseables y de bacterias lácticas y acéticas por contaminaciones, debido a la falta de higiene en el área de producción. Desde el punto de vista de la inocuidad deberá evitarse la posibilidad de que se presenten peligros sanitarios de tipo físico-químico, como restos de fitosanitarios, detergentes y desinfectantes procedentes del lavado del equipo y o botellas y oxidaciones debidas a aireaciones. Mediante la aplicación del sistema HACCP se pueden no sólo prevenir y eliminar estos peligros, sino también proporcionar al proceso un sistema de control.

PCC en la Elaboración del Vino

A continuación se presenta un cuadro con las diferentes fases del proceso de la industria

enológica con la descripción de los puntos críticos de control. Ha de tenerse presente que

todas las fases que constituyen el diagrama de flujo deben estar debidamente controladas, aunque no constituyan un punto crítico de control dentro del proceso productivo.

16

Figura 2. PCC en la elaboración del vino

16 Figura 2 . PCC en la elaboración del vino Fuente: Federación española del vino

Fuente: Federación española del vino

17

Figura 3. PCC en la elaboración del vino (Continuación)

17 Figura 3 . PCC en la elaboración del vino (Continuación) Fuente: Federación española del vino

Fuente: Federación española del vino

18

Elaboración

Presencia de Etilenglicol, Dietilenglicol, Propilenglicol

En aquellas bodegas que utilizan soluciones glicoladas como parte integrante de sus sistemas de refrigeración, puede aparecer etilenglicol, dietilenglicol, propilenglicol en los

productos, en el caso de que se produjera algún tipo de fuga en los mismos

riesgo toxicológico en el caso de la aparición de etilenglicol y dietilenglicol dada su toxicidad. Este riesgo no existe en el caso del propilenglicol que no es tóxico. La vigilancia de este punto crítico consistirá en el control cromatográfico sistemático de los vinos que han estado sometidos a ese riesgo. El mantenimiento adecuado y sistemático de las instalaciones implicadas será la acción preventiva a implantar. Asimismo, es aconsejable utilizar como refrigerante únicamente el propilenglicol y no sustancias tóxicas como el etilenglicol o el dietilenglicol. Si a pesar de la prevención, el modo de fallo ocurriera, deberá procederse a la reparación de la instalación y a la destilación del vino afectado. Se

Existe un

deberán llevar los registros de los resultados analíticos del vino y del mantenimiento efectuado, para demostrar que el punto crítico está bajo control.

Estabilización y Correcciones

Restos de ferrocianuro

Es sabido que ciertos vinos requieren un tratamiento con ferrocianuro potásico, al objeto de conseguir su estabilidad frente a ciertas quiebras metálicas. En los casos en los que se haya efectuado este tratamiento, deberá comprobarse que el vino está exento de ferrocianuro tanto en solución como en suspensión. Como medida preventiva, el tratamiento debe correr a cargo de un técnico autorizado, que fijará las dosis de ferrocianuro y su correcta aplicación. En el caso de que el modo de fallo ocurriera, si el ferrocianuro está en

19

suspensión, se filtrará el vino para eliminarlo y se comprobará su ausencia posteriormente. Si está en solución, se mezclará con otros vinos con alto contenido en hierro con el fin de combinarlo y posteriormente se filtrará y comprobará. Todos los resultados analíticos de las comprobaciones deberán ser registrados.

Incorporación al vino de productos tóxicos por equivocación

El manejo de productos tóxicos siempre supone un riesgo. Como medidas preventivas, estos productos deben estar correctamente identificados con el fin de no confundirlos con cualquier materia prima o auxiliar e incorporarlos al proceso productivo, debiendo guardarse en almacenes separados6. A título de ejemplo y sin ánimo de ser exhaustivos, estas sustancias pueden ser lubricantes, disolventes, detergentes, etc, que se hayan alojado en recipientes que no son los originales y que no se identifican claramente. Otras acciones preventivas que nos ayudan a evitar este modo de fallo son auditar periódicamente los almacenes de tal forma, que se detecte lo antes posible el uso indebido de estos productos y por supuesto mantener aisladas estas sustancias de tal manera que se deba Ir ex profeso a por ellas. Obviamente la acción a tomar será rechazar la partida afectada. Los registros de los resultados de los controles y las auditorías deben guardarse, así como de las incidencias que tengamos.

Embotellado

Contaminación microbiológica

Este punto de control será crítico en aquellas empresas que embotellen productos con una riqueza en azúcares tal, que la contaminación microbiológica pueda producir la fermentación de esos azúcares y como consecuencia de la presión interior producida en la botella, llegar al estallido de la misma En el caso de los vinos tranquilos, la contaminación

20

microbiológica, puede provocar un enturbiamiento de los mismos. El límite crítico deberá ser fijado en cada empresa de acuerdo con las especificaciones de sus productos y su propia experiencia. Las tres acciones preventivas descritas en el cuadro comparativo van encaminadas a garantizar el producto, asegurando el correcto funcionamiento del proceso. Muy especialmente para prevenir problemas microbiológicos, deben elaborarse instrucciones de limpieza de las líneas de embotellado con el fin de asegurar esta. La producción afectada deberá ser descorchada y reprocesada. Tanto los resultados de los controles microbiológicos, como los registros que se deriven del control de la integridad de los filtros y de la limpieza de circuitos deben ser registrados.

Presencia de cristales u otros cuerpos extraños en el vino

Los cristales y otros cuerpos extraños que puedan aparecer en el vino son normalmente debidos a su presencia en las botellas antes del llenado o a su incorporación durante el mismo. Los controles en la recepción de las botellas, así como el efectuado en las líneas de producción son fundamentales para detectar este fallo. Contar con proveedores capaces de proporcionar botellas en las debidas condiciones y mantener adecuadamente las líneas de producción, evitando roturas en bocas, presencia de insectos, etc, son medidas tendentes a eliminar estas causas potenciales de fallo. Se recomienda también, como medida preventiva, el enjuagado de botellas previo a su uso. Como siempre, es necesario el registro de los controles establecidos y del mantenimiento ejercido.

Aparición de residuos de productos de limpieza de máquinas

El empleo de diversos productos es práctica habitual en la limpieza de las bodegas. La supervisión diaria de la línea de producción tras la limpieza, está obligada con el fin de garantizar la ausencia de residuos en el vino.

21

Brettanomyces/Dekkera EN LA INDUSTRIA ENOLOGICA

Descripción

Brettanomyces, al contrario de las levaduras responsables de la fermentación del mosto, se caracteriza por una actividad fermentativa baja y crecimiento lento. En condiciones de cultivo sobre medio sólido forma colonias al cabo de siete a diez días. Crece en medios de cultivo habituales de crecimiento de levaduras (MEA, YPD), sin embargo, cuando se desea aislarlo de mosto o vino es necesario emplear medios de cultivo diferenciales que impidan el crecimiento de otros microorganismos, mucho más activos que Brettanomyces y que ocultan o impiden el desarrollo de las colonias de Brett. La morfología celular de Brettanomyces es ojival o cilíndrica, con gemación multipolar en reproducción vegetativa. Una de las características de este género es su tamaño celular variable y la formación de filamentos. En vinos se observan siempre células mucho más pequeñas que en medio de cultivo y son frecuentes estas formas filamentosas que ayudan a la adherencia del microorganismo a las superficies, por ejemplo de las barricas. Los defectos sensoriales asociados directamente a Brett aparecen mayoritariamente en vinos tintos de calidad y las causas radican en la propia fisiología del microorganismo. En efecto, la biosíntesis de fenoles volátiles se realiza a partir de ácidos hidroxicinámicos y en vinos tintos el contenido de estos compuestos es mayor. Además, al ser una levadura de crecimiento muy lento, la alteración se presenta principalmente durante el almacenamiento y sobre todo, la crianza del vino, habitual en los vinos tintos de gama alta. En las barricas de madera el microorganismo tiene a su disposición todo el sustrato y tiempo suficiente para realizar su actividad. La naturaleza porosa de la madera y su difícil limpieza contribuye a que las poblaciones existentes se mantengan incluso después del lavado de la barrica. Además, D. bruxelliensis tiene la capacidad de degradar uno de sus componentes, la celobiosa Junto con la formación de fenoles volátiles, Brettanomyces produce elevadas cantidades a de ácido acético y tiene la capacidad de sintetizar, en condiciones especiales,

22

tetrahidropiridinas que se identifican con el "gusto a ratón". También se le atribuye la producción de isovalérico y otros ácidos grasos que confieren gustos a rancio y de ciertas esterasas, acentuando la pérdida de aromas afrutados del vino. Por todo ello, el género Brettanomyces/Dekkera es uno de los más temidos agentes microbianos de los vinos.

Figura 4. Síntesis de etilfenoles por Brettanomyces/Dekkera ssp

4 . Síntesis de etilfenoles por Brettanomyces/Dekkera ssp Fuente: http://www.acenologia.com/ciencia78_2.htm

Brettanomyces es un microorganismo ubicuo, con poblaciones escasas pero repartidas en suelo, cortezas de arboles y sustratos azucarados (frutos miel). Su detección en uvas y mostos es poco frecuente debido sobre todo a la gran competencia existente con otros microorganismos mucho más activos. No obstante, se han detectado focos en viñedos particulares. Su aislamiento es frecuente en materiales de bodega, mangueras, depósitos, suelos, siempre asociado a higiene deficiente. Pero donde es más habitual su presencia es en las barricas y tinas de madera. El desarrollo de las poblaciones de Brettanomyces se inicia después de la fermentación alcohólica. En este momento, y a partir del reducido número de células procedentes del viñedo que durante la fermentación alcohólica no han tenido la oportunidad de multiplicarse debido a su escasa competitividad respecto a S. cerevisiae, inician su desarrollo en un vino poco o nada protegido (ausencia de sulfuroso). Dependiendo del arranque más tardío de la fermentación maloláctica, la población será mayor, y aunque luego se corrija con sulfuroso, mayor la probabilidad de presentar células viables capaces de desarrollar la alteración posteriormente.

23

Diagrama de Flujo del Proceso

Figura 5: Descripción del proceso enológico y control de Brettanomyces/Dekkera

PCC Brettanomyces/Dekkera PCC Brettanomyces/Dekkera
PCC Brettanomyces/Dekkera
PCC Brettanomyces/Dekkera
del proceso enológico y control de Brettanomyces/Dekkera PCC Brettanomyces/Dekkera PCC Brettanomyces/Dekkera
del proceso enológico y control de Brettanomyces/Dekkera PCC Brettanomyces/Dekkera PCC Brettanomyces/Dekkera
del proceso enológico y control de Brettanomyces/Dekkera PCC Brettanomyces/Dekkera PCC Brettanomyces/Dekkera

24

Métodos para la detección de Brettanomyces/Dekkera

Método de ELISA

La técnica ELISA (Enzyme Linked Inmunoabsorvent Assay) se basa en la detección de un antígeno inmovilizado sobre una fase sólida mediante anticuerpos que directa o indirectamente producen una reacción cuyo producto, por ejemplo un colorante, puede ser medido espectofotométricamente. Este principio tiene muchas de las propiedades de un inmunoensayo ideal: es versátil, robusto, simple en su realización, emplea reactivos

económicos y consigue, mediante el uso de la fase sólida, de una separación fácil entre la fracción retenida y la fracción libre. Además se han propuesto y desarrollado diferentes métodos de amplificación de la

que han permitido elevar la sensibilidad de

algunos ELISA a la obtenida en el RIA (radioinmunoensayo) hormonal. Este método ha tenido una enorme aplicación en todos aquellos campos en los que se precisaba la cuantificación de productos mediante anticuerpos: diagnóstico clínico, detección viral, clasificación de anticuerpos en isotipos, búsqueda de anticuerpos monoclonales, etc

señal (luminiscentes, cascadas enzimáticas,

)

Fases de un ensayo ELISA

Las 4 fases de un ensayo ELISA son las siguientes:

1. Conjugación del anticuerpo o del antígeno con un enzima (peroxidasa, fosfatasa

alcalina,

indirectos, sándwich, etc. El antígeno marcado se emplea en ensayos de competición de

El anticuerpo conjugado al enzima se emplea en los ensayos directos e

).

antígeno.

25

Figura 6. Conjugación del anticuerpo o antígeno

25 Figura 6 . Conjugación del anticuerpo o antígeno Fuente: http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/elisa.htm 2. Unión

2. Unión del antígeno (o del anticuerpo) a los pocillos. La unión de anticuerpos o antígenos se realiza con facilidad a la superficie de plásticos tratados que tienen gran afinidad por proteínas.

Figura 7. Unión del anticuerpo o del antígeno a la fase solida

7 . Unión del anticuerpo o del antígeno a la fase solida Fuente: http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/elisa.htm 3.

3. Formación de una o más capas de inmunocomplejos. En el caso del antígeno unido a la placa se puede detectar mediante un anticuerpo anti-antígeno marcado (ELISA directo) o empleando un anticuerpo primario anti-antígeno y un secundario anti primario marcado (ELISA indirecto). Este segundo método permite la amplificación de la señal al poderse unir uno o más anticuerpos secundarios a cada anticuerpo primario. En el

26

caso del anticuerpo unido a la placa se incuba con una mezcla de antígeno y antígeno marcado. Se ensayan diferentes relaciones de antígeno frio frente a una cantidad fija de antígeno marcado. Es el ensayo de competición del antígeno.

Figura 8. Formación de una o más capas de complejos inmunes sobre la fase solida

una o más capas de complejos inmunes sobre la fase solida Fuente:

4. Revelado de la reacción enzimática. Después de un lavado para eliminar todos las moléculas marcadas no fijadas en forma de inmunocomplejos se añade el sustrato enzimático en solución. Se deja reaccionar y se lee la densidad óptica (D.O.) mediante espectrofotometría. En el esquema se muestra la reacción asociada a un ELISA directo.

Figura 9. Reacción entre la enzima fijada y el sustrato: Formación complejo coloreado

enzima fijada y el sustrato: Formación complejo coloreado Fuente:

27

Tipos de ensayos ELISA

Se han desarrollado múltiples variantes de ensayos ELISA que permiten desde la cuantificación de un antígeno en solución, la detección de un anticuerpo en una solución o la determinación de la subclase (idiotipo) de un anticuerpo.

ELISA directo (ensayo ELISA simple de dos capas): Las placas ELISA se preparan recubriendo los pocillos con las soluciones en las que se sospecha se encuentra el antígeno. Se incuban con anticuerpos marcados. Indican la presencia de antígeno en la solución

analizada. Es necesario incluir controles negativos que serán muestras del mismo tipo de las

pero en las que se tenga la certeza de la ausencia del antígeno

analizadas (sangre, orina,

buscado. Asimismo se incluyen controles positivos (soluciones donde se encuentra el antígeno buscado, o bien se le ha añadido).

)

ELISA indirecto: Las placas ELISA se preparan de una forma idéntica a la anterior. Los controles positivos y negativos son los mismos. El sistema de detección emplea dos anticuerpos: uno primario contra el antígeno, y uno secundario marcado contra el primario. La detección tiene mayor sensibilidad por presentar una amplificación de señál debida a la unión de dos o más anticuerpo secunadarios por cada primario. Es el ensayo más popular, como lo es la inmunofluorescencia indirecta, pues un mismo secundario marcado y un mismo sistema enzimático permite cuantificar una gran cantidad de antígenos.

ELISA 'sandwich': (ensayo de captura de antígeno y detección mediante inmunocomplejos). Se trata de un ensayo muy empleado en el que se recubre el pocillo con un primer anticuerpo anti-antígeno. Después de lavar el exceso de anticuerpo se aplica la muestra problema en la que se encuentra el antígeno, que será retenido en el pocillo al ser reconocido por el primer anticuerpo. Después de un segundo lavado que elimina el material no retenido se aplica una solución con un segundo anticuerpo anti-antígeno marcado. Así pues cada molécula de antígeno estará unida a un anticuerpo en la base que lo retiene y un segundo anticuerpo, al menos, que lo marca. Este ensayo tiene una gran especificidad y sensibilidad debido a la amplificación de señal que permite el segundo anticuerpo.

28

El Método de Cromatografía para Realizar Perfil de Ácidos Grasos

La determinación de los perfiles de ácidos grasos mediante cromatografía de gases, es una técnica que permite una rápida y exacta identificación de los microorganismos, estos ácidos grasos son ácidos orgánicos de cadena larga que están presentes en el extracto de células bacterianas y su composición es característica en cada especie, lo cual permite la diferenciación entre ellas. Para realizar la caracterización de las cepas por esta técnica, se determinan sus perfiles de ácidos grasos y los de cepas patrones y los picos se identifican mediante la comparación de sus tiempos de retención con los de una mezcla patrón Esta técnica ha sido empleada exitosamente en la identificación de las familias Enterobacteriaceae y Vibrionaceae, así como en sistemática y ecofisiología

El Método de PCR

Esta técnica permite multiplicar ("amplificar" es, en realidad, el término que se ha impuesto) pequeñas cantidades de ADN entre cientos de miles y millones de veces. El tramo destinado a reproducirse puede tener desde cincuenta hasta más de dos mil nucleótidos de longitud. El segmento de ADN que sirve de molde no requiere estar necesariamente en estado puro, sino que puede ser parte de mezclas complejas. Puede ser, por ejemplo, ADN nuclear total. El método se basa, en su forma más simple en la realización de tres reacciones sucesivas llevadas a cabo a distintas temperaturas. Estas reacciones se repiten cíclicamente entre veinte y cuarenta veces. La muestra se calienta, en el primer paso, hasta lograr la separación de las dos cadenas que constituyen el ADN, hecho que se conoce como "desnaturalización". En el segundo paso, la temperatura se reduce para permitir el "apareamiento" de cada una de dos cadenas cortas de nucleótidos (oligonucleóridos) con cada una de las hebras separadas del ADN molde.

29

Figura 10. Pasos en el método de PCR

29 Figura 10 . Pasos en el método de PCR Fuente: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html Se trata de

Se trata de segmentos de ADN de cadena simple, sintetizados en el laboratorio y diseñados de manera tal que permiten definir los límites del tramo de ADN que se desea replicar. Obviamente, para que se pueda producir el apareamiento, cada uno de estos oligonucleótidos, a los que se denomina "iniciadores" o primers, debe ser complementario del tramo al que tienen que unirse en las cadenas separadas del ADN molde. En tercer lugar, una enzima ADN polimerasa extiende los primers, en el espacio comprendido entre

30

ambos, sintetizando las secuencias complementarias de las hebras del ADN molde. Para ello, la ADN polimerasa usa desoxidonucleósidos trifosfato (dNTPs) agregados a la mezcla de reacción. La temperatura a la que se realiza el tercer paso está condicionada por aquélla a la cual "trabaja" la enzima ADN polimerasa. Al cabo del primer ciclo de tres reacciones (desnaturalización, apareamiento, extensión) el tramo de ADN elegido se ha duplicado y el doble de su cantidad original se encuentra disponible para ser nuevamente replicado en un segundo ciclo. El resultado de la aplicación de numerosos ciclos "en cadena" da lugar a la amplificación geométrica del segmento de ADN delimitado por los primers.

Figura 11. Amplificación exponencial del gen en PCR

Figura 11. Amplificación exponencial del gen en PCR Fuente: http://users.ugent.be/~avierstr/principles/pcr.html

Una vez finalizada la reacción se habrá logrado fabricar, en pocas horas, gran cantidad de un fragmento génico con un alto grado de pureza. Obtener el mismo resultado utilizando las técnicas clásicas de clonado llevaría varios días de tedioso trabajo. Por otra parte, la técnica PCR es el método de detección de secuencias de ADN más sensible conocido hasta la fecha: mediante ella resulta posible identificar un gen a partir de un solo cabello, una célula somática o un espermatozoide. Es, por lo tanto, un instrumento extremadamente valioso para establecer, por ejemplo, lazos de parentesco.

31

Representación Grafica de Brettanomyces/Dekkera

Figura 12. Microfotografía de cultivo de Dekkera/Brettanomyces. a) variabilidad morfológica y de tamaño celular. b) forma filamentosa

morfológica y de tamaño celular. b) forma filamentosa Fuente:

32

¿Es fácil eliminar Brettanomyces/Dekkera, una vez instalada en la industria vinícola?

Brettanomyces es un microorganismo ubicuo, con poblaciones escasas pero repartidas en suelo, cortezas de arboles y sustratos azucarados (frutos miel). Su detección en uvas y mostos es poco frecuente debido sobre todo a la gran competencia existente con otros microorganismos mucho más activos. No obstante, se han detectado focos en viñedos particulares. Su aislamiento es frecuente en materiales de bodega, mangueras, depósitos, suelos, siempre asociado a higiene deficiente. Pero donde es más habitual su presencia es en las barricas y tinas de madera. El desarrollo de las poblaciones de Brettanomyces se inicia después de la fermentación alcohólica. En este momento, y a partir del reducido número de células procedentes del viñedo que durante la fermentación alcohólica no han tenido la oportunidad de multiplicarse debido a su escasa competitividad respecto a S. cerevisiae, inician su desarrollo en un vino poco o nada protegido (ausencia de sulfuroso).

Figura 13. Dinámica de las poblaciones levaduras fermentativas bacterias lácticas y Brettanomyces desde la entrada de uva hasta vino terminado. FA: fermentación alcohólica, FML: fermentación maloláctica.

fermentación alcohólica, FML: fermentación maloláctica. Fuente:

33

Dependiendo del arranque más tardío de la fermentación maloláctica, la población será mayor, y aunque luego se corrija con sulfuroso, mayor la probabilidad de presentar células viables capaces de desarrollar la alteración posteriormente. Durante la crianza, procedentes del vino o de las propias barricas ya contaminadas, las poblaciones aumentan de mansera lenta pero sin competencia. Aquí se originan los principales riesgos. Es destacable señalar que no hace falta un gran número de células para desarrollar la alteración, y que por encima de 1000 células/ml la calidad organoléptica del vino está seriamente comprometida

Métodos de Eliminación de Brettanomyces/Dekkera

Cuando el vino no manifiesta sensorialmente la alteración y el contenido de fenoles volátiles es inferior a 400 μg/l, el objetivo prioritario es detener el desarrollo de Brettanomyces y por tanto el aumento de la concentración de fenoles volátiles. Para ello se deben corregir los niveles de sulfuroso libre en cantidad suficiente y acorde con el pH, por encima de 0,8 ppm de SO 2 molecular.

Utilización tradicional de dióxido de azufre

La adición de dióxido de azufre en forma de gas o de solución salina ha sido siempre una de las bases para proteger el vino frente a alteraciones microbianas, así como para desinfectar los recipientes de madera. En efecto, la combustión del azufre elemental en el aire produce dióxido de azufre utilizado en forma gaseosa y en grandes concentraciones, y que permite actuar sobre la superficie y sobre los primeros milímetros de madera provocando una acidificación mortal del contenido intracelular de los microorganismos. Tradicionalmente, el dióxido de azufre gaseoso puede producirse por la combustión de una mecha (azufre sobre una trama metálica o textil), o de pastillas de azufre compactado sobre una carga mineral (silicatos, fibra de vidrio) u orgánica (madera, fibras textiles plásticas)

34

colocadas en el interior del recipiente vacío. También puede introducirse directamente en forma gaseosa a partir de gas industrial liquificado. El dióxido de azufre actúa sobre la superficie y sobre la microporosidad que está en contacto directo con el vino; el exceso de dióxido de azufre se disuelve parcialmente en el vino en el momento del llenado del recipiente por emulsión gaseosa, o se evacua al exterior por el desplazamiento de volúmenes.

Utilización de ozono

El ozono (O 3 ) es un gas con propiedades oxidantes muy potentes muy utilizado para la desinfección. A causa de su vida relativamente corta, el ozono siempre se genera in situ mediante un generador de ozono. El ozono se produce a partir del oxígeno como resultado directo de una descarga eléctrica. Esta descarga rompe la molécula estable de oxígeno y forma dos radicales de oxígeno y calor. Estos radicales se combinan con moléculas de oxígeno para formar el ozono. El ozono no es más que un desinfectante, no posee propiedades de limpieza. Teniendo en cuenta su modo de acción, es indispensable emplearlo sobre superficies perfectamente limpias para poderlas desinfectar. El ozono constituye una técnica perfectamente eficaz para el tratamiento en frío de las cubas de acero inoxidable, de resinas epoxídicas, de las canalizaciones, de las cadenas de embotellado…

Otros Contaminantes Biológicos en la Industria Enológica

Levaduras

Las levaduras del género Pichia y Hansenula son levaduras oxidativas comunes en la crianza en barricas; producen etanal, que puede formar velos en recipientes vaciados. La presencia de levaduras con un fuerte poder de fermentación pertenecientes a los géneros Saccharomyces (especie bayanus), Saccharomycodes (especie ludwigii) o

35

Zigosaccharomyces (especie baillii) puede causar graves problemas de re-fermentación de los vinos azucarados debido sobre todo a su resistencia al dióxido de azufre.

Bacterias

Las particulares condiciones de oxidación de la crianza en madera permiten siempre el mantenimiento de poblaciones bacterianas aerobias significativas (Acetobacter sp.). La actividad metabólica de estas bacterias es limitada mientras la presión parcial de oxígeno en el vino es débil. A la inversa, si se producen trasiegos o por evaporación natural (consumo) del vino entra aire, la reactivación de la cadena respiratoria de las bacterias es rápida y produce fácilmente ácido acético por oxidación del alcohol etílico. La crianza prolongada de vinos en madera en presencia de Acetobacter más o menos quiescente puede no traducirse en una formación importante de acidez volátil, pero a menudo se acompaña de una acumulación de acetato de etilo. Más allá de 180 a 200 mg/L, la nitidez aromática del vino se ve afectada con la aparición de un carácter acescente desagradable. Las bacterias del género Lactobacillus y Pediocococcus en vinos tintos de pH elevado (pH > 3,8), el dióxido de azufre activo (molecular) puede no presentar dosis suficientes. En estas condiciones, los gérmenes lácticos anaerobios pueden atacar los residuos de azúcares en C6 o C5 para formar ácido acético, aldehídos (glioxal, piruvaldehído) y productos acetoínicos (acetoína, diacetilo, butanodiona) no deseables. El ataque al ácido cítrico por parte de las bacterias lácticas, incluida Enococcus, puede por sí sólo generar entre 200 y 300 mg/L de ácido acético fácilmente. La degradación del glicerol del vino por estos mismos gérmenes puede causar la “enfermedad del amargor” asociada a la síntesis de propenal (acroleína), pero esta alteración es poco habitual. En cambio, mucho más habitualmente, ciertas cepas de estas mismas bacterias pueden producir a partir de este mismo sustrato cantidades bastante grandes de ácido láctico. En estas condiciones, la acidez total aumenta rápidamente sin que varíe la acidez volátil, de modo que a partir de 2 a 2,5 g/L se produce un importante endurecimiento del vino en el momento de la cata. Finalmente, incluso cuando la fermentación maloláctica no produce ninguna desviación y muy habitualmente en vinos de pH elevado (pH > 3,9), se registran aumentos, a veces impresionantes, de las

36

concentraciones de aminas biógenas en el transcurso de la maduración. Estas sustancias, producidas por la degradación de ciertos ácidos aminados, no suelen producir desviaciones detectables en la cata. En cambio, algunos países, como Suiza o los Países Bajos, discuten la importación de vino con un contenido en histamina superior a 10 y 3,5 mg/L, respectivamente.

Desarrollo de mohos

El desarrollo de mohos se limita normalmente a situaciones de conservación prolongada de los recipientes de madera vacíos y en ambientes húmedos. En estas condiciones, los mohos del género Mucor y Pennicilium, muy frecuentes en bodegas, pueden originar olores muy característicos. Como origen de estas desviaciones pueden identificarse diferentes compuestos. El metil-isoborneol, el fenchol, la fenchona y a veces la geosmina son moléculas terpénicas que suelen ser responsables de los defectos “alcanforado” y “terroso”. El octenol-3 y la octenona-3 pueden comunicar olores “achampiñonados”. En presencia de fuentes de los precursores adecuados, también es posible la formación de cloro (TCA) y de bromoanisoles (TBA) con la aparición de olores “a moho, a corcho”.

¿Por qué las muestras procedentes de superficies con mosto se cubren con bacterias u hongos?

Porque en el mosto se encuentran bacterias u hongos procedentes de la fermentación y de la reacción denominada fermentación maloláctica las cuales bajo condiciones adecuadas (Nutrientes, Tiempo, Temperatura y Oxigeno) que favorezcan su crecimiento empiezan a proliferar sobre la superficie en contacto directo con el mosto. Por tal razón son muy importantes las prácticas de higiene y desinfección para eliminar el riesgo de aumento de poblaciones de microorganismos sobre las superficies formando biopelículas que ocultan la

37

presencia de otros microorganismos de interés. La presencia de las innumerables bacterias y hongos que proliferan en zonas con restos de mosto imposibilita el aislamiento tradicional de colonias para analizar la presencia de levaduras contaminantes.

Detección por PCR de Brettanomyces/Dekkera en Uvas

Figura 14. Resultados

PCR de Brettanomyces/Dekkera en Uvas Figura 14. Resultados Fuente: Guía Trabajo final Análisis Como en 6

Fuente: Guía Trabajo final

Análisis

Como en 6 de las 8 muestras tomadas se detectó la presencia de Brettanomyces/Dekkera, en 1 no se detectó, y en la restante se encontró un resultado negativo (incluso en el control positivo), puede afirmarse que hay presencia de inhibidores, los cuales impiden obtener conclusiones para esta última muestra y no puede descartar la presencia de Brettanomyces/Dekkera en esta muestra. El control positivo tiene 10 5 células y el resultado arrojado en la primera reacción es +, lo que me indica que hay más de 1000 células de esta

38

levadura en la muestra analizada, y el control negativo arrojo resultados negativos para las dos reacciones, por lo tanto garantizo que el equipo está realizando lecturas correctas.

YPD

Está constituido por extracto de levadura, peptona bacteriológica y glucosa. el tratamiento de incubación con YPD durante 6 días sirve para el crecimiento exponencial de las levaduras ya que es un medio rico en nutrientes que favorecen el crecimiento de estos microorganismos.

Detección por PCR de Brettanomyces/Dekkera en Instalaciones

Figura 15. Resultados

Detección por PCR de Brettanomyces/Dekkera en Instalaciones Figura 15. Resultados Fuente: Guía Trabajo final

Fuente: Guía Trabajo final

39

Análisis

La presencia de las innumerables bacterias y hongos que proliferan en zonas con restos de mosto imposibilita el aislamiento tradicional de colonias para analizar la presencia de levaduras contaminantes, aunque este procedimiento ha permitido constatar su presencia. Como en 20 de las 50 muestras tomadas se detectó la presencia de Brettanomyces/Dekkera, en 12 no se detectó, y en las 18 restantes se encontraron resultados negativos (incluso en el control positivo), puede afirmarse que hay presencia de inhibidores, los cuales impiden obtener conclusiones para estas últimas.

Detección por PCR de Brettanomyces/Dekkera en las Moscas

Figura 16. Resultados

últimas. Detección por PCR de Brettanomyces/Dekkera en las Moscas Figura 16. Resultados Fuente: Guía Trabajo final

Fuente: Guía Trabajo final

40

Análisis

En la figura anterior se observa que 3 de las 4 muestras procesadas dan positivo para Brettanomyces/Dekkera, razón por la cual puede pensarse que la mosca Drosophila colabora con la difusión del contaminante. Ésta explicación se consolida aún más, al revisar los resultados anteriores, en los cuales se confirma la presencia de las levaduras tanto en las uvas como en las instalaciones de vendimia.

41

CONCLUSIONES

La detección rápida de Brettanomyces/Dekkera en el proceso de elaboración de los vinos permitiría al enólogo y al productor tomar medidas de prevención y eliminarla antes de la aparición del carácter fenolado característico de la alteración provocada por esta levadura. Al contrario que el método microbiológico tradicional y los métodos no específicos, la biología molecular (PCR) ofrece soluciones de detección con elevados niveles de rapidez, sensibilidad y especificidad.

La técnica más exacta para detección de Brettanomyces/Dekkera es la técnica de PCR, ya que con la Técnica de ELISA obtengo resultados presuntivos, los cuales debo confirmar y con la técnica de perfil de ácidos grasos por cromatografía de gases no diferencio entre células vivas y muertas

El diagnóstico de la presencia de Brettanomyces/Dekkera debe permitir determinar el nivel de riesgo en que se encuentra el vino y cómo evoluciona dicho riesgo con el tiempo, ya que el riesgo varía según el nivel de contaminación. En el caso de la cerveza, la fermentación es generada por la acción de la levadura Saccharomyces cerevisiae, siendo utilizada a gran escala para la producción de bebidas alcohólicas.

En ocasiones se tiende a definir muchos puntos como PCC, generando con esto retrabajos y pérdidas de tiempo y esfuerzos; por tanto la etapa de la definición y evaluación de PCC es fundamental el HACCP. Para el caso de control de Brettanomyces/Dekkera en la industria enológica se deben establecer antes de pasar el vino a barrica, antes de ser embotellado el vino y fermentaciones lentas

En los análisis realizados de PCR Brettanomyces/Dekkera está presente en numerosas partes de las instalaciones especialmente en la zona de recepción, conducción y prensado de la uva. Aunque no resultaron positivos los análisis en los

42

depósitos de desfangado, estos valores no son significativos ya que la particular composición del mosto inhibe el PCR, y de hecho en 6 de los 8 análisis realizados no se obtuvo positivo en el control al que expresamente se añaden levaduras contaminantes, por lo que no se puede excluir la presencia de Brettanomyces/Dekkera en estos depósitos.

43

BIBLIOGRAFÍA

Carter, M & otros (2008). Food Safety Handbook. Microbiological challenges. Biomerieux Editions. Francia.

Chatonnet, P. Limpieza y desinfección aplicadas a recipientes de madera destinados a la vinificación y crianza de vinos. Recuperado el 23 de Noviembre de 2010 desde:

Federación española del vino. Aplicación del sistema de análisis de riesgos y control de puntos críticos en vinos. Recuperado el 23 de Noviembre de 2010 desde:

Jay, J. (1994) Microbiología moderna de los alimentos. 3ª Ed. Editorial Acribia S.A. Zaragoza: España

López, E. Brettanomyces/Dekkera Control y detección en bodegas Año VI. N° 1 Enero-Febrero 2009 Revista Enología. Recuperado el 23 de Noviembre de 2010 desde:

Mendoza, E. (s.f.) Brettanomyces/Dekkera INTA. Centro de estudios enológicos:

desde:

Argentina

Recuperado

el

23

de

Noviembre

de

2010

Proceso de elaboración del vino. Mendoza: Argentina. Recuperado el 23 de

desde:

Noviembre

de

2010

Reina,

M

(2003).

Métodos

en

biología

celular.

Elisa.

Recuperado

el

23

de

Saavedra, D & otros. Brettanomyces, un contaminante de nuestras viñas. Año 7. Número 17 Julio-Septiembre 2005 Ciencia & Trabajo Recuperado el 23 de Noviembre de 2010 desde http://www.cienciaytrabajo.cl/pdfs/17/Pagina%2093.pdf

Satz, L & Kornblihtt, M. La reacción en cadena de la polimerasa. El método y sus aplicaciones. Volumen 4. Nº 23. Marzo-abril 1993 Revista de Divulgación Científica y Tecnológica de la Asociación Ciencia Hoy. Recuperado el 23 de Noviembre de 2010 desde:

44

UNAD. Biotecnología Avanzada Guía trabajo final.

Estudio de caso aplicaciones de

la biotecnología en la industria enológica Recuperado el 23 de Noviembre de 2010 desde:

Vierstraete, A. (1999).

Principle of PCR Recuperado el 23 de Noviembre de 2010

Vinos al mundo.com. Historia del vino. Copyright © 2005 VinosalMundo.com.

desde:

Recuperado

el

23

de

Noviembre

de

2010