TEMA 20: INTRODUCCIÓN A LA HISTOLOGÍA:

1.-CONCEPTO DE HISTOLOGÍA:

La histología es el estudio científico de las estructuras microscópicas de los tejidos y los órganos del cuerpo. La histología
es una ciencia descriptiva e incluye aspectos de la biología molecular y celular, que ayudan a describri la organización y la
función celular

➢ Ciencia que estudia los tejidos, tanto animales como vegetales. Ciencia morfomicroscópica que estudia la
estructura de los tejidos, así como su organización en sistemas u órganos, con una visión funcional de los mismos.
El término ``Histo´´ etimológicamente significa ``tejidos´´.

Está ligada a los avances del microscopio y a la resolución de los mismos, de modo que hasta que no surge el microscopio
compuesto no se hacen los primeros descubrimientos. El primero fue desarrollado por M. Malpighi en el siglo XVII y
contaba con un ocular y un objetivo. Fundador de la disciplina de histologia, estudió por primera vez órganos como el
riñón, el bazo o la piel.

R. V. Köelliker fue el primero que postuló que todo nuestro organismo está formado por 4 tejidos básicos: tejido epitelial,
conjuntivo, muscular y nervioso.

2.-CONCEPTO DE TEJIDO:

Un tejido es un complejo constituido por células de características morfológicas y funcionales básicas comunes, y por
material extracelular que elaboran.

Un individuo está formado por unos 50 billones de células organizados en al menos 250 tipos de tejidos diferentes. Los
cuatro tipos de tejidos básicos son:

1. Epitelial: es el que reviste todas las superficies, y es el único capaz

de llevar a cabo funciones de barrera. El tejido epitelial tiene
distintos orígenes embriológicos: endodermo, mesodermo y
ectodermo. La piel, por ejemplo, deriva del ectodermo, el endotelio
y el mesotelio del mesodermo y el epitelio digestivo del endodermo.

Un tejido epitelial se diferencia de uno conjuntivo porque el

conjuntivo tiene mayor material extracelular. En el epitelial apenas o
no hay material celular y las células están yuxtapuestas y muy
próximas entre sí.

2. Conjuntivo: Hay muchos subtipos. La imagen es de la dermis de la

piel, el cual es un tejido resistente rico en fibras de colágeno. Deriva
del mesodermo.

3. Muscular: tiene capacidad contráctil. Lo encontramos formando los músculos del cuerpo, y también asociado a
muchos órganos. El tejido muscular está formado por miofilamentos porque está especializado en la contracción.
Se llaman fibras musculares porque tienen una forma alargada y siguen una misma dirección, y cuando el
músculo se contrae se acortan. Tres tipos de tejido muscular: esquelético, cardíaco y liso. Deriva del mesodermo.

4. Nervioso: Está formado principalmente por neuronas, junto con una serie de células igual de importantes, las
células gliales. Las neuronas tienen una morfologia más diversa. No hay apenas matriz, es más un entramado de
fibras nerviosas, por eso el SNC está protegido por el hueso y las meninges Recibe, procesa y transmite la
información, coordinando la acción de todos los órganos, aparatos y sistemas. Procede del neuroectodermo, por
tanto es un neuroepitelio. Es decir, que tampoco hay material extracelular porque es una variante especializada
de epitelio.

3.-MÉTODOS DE ESTUDIO:

Para que las muestras sean observables bajo el microscopio, es necesario seguir un proceso específico debido a dos
limitaciones fundamentales: se debe realizar un corte lo suficientemente delgado para que la luz pueda atravesarlo y ser
visible en el microscopio (generalmente de 5 μm), y se requiere aplicar una tinción, ya que las muestras suelen ser
transparentes.

A. PROCESAMIENTO DE MUESTRAS:

a) Fijación: la fijación tiene como objetivo la estabilización de estructuras. Preservar la vitalidad celular y
prevenir las alteraciones post mortem que puedan afectar a las células (procesos autolíticos) implica
mantener la estructura morfológica de las células y los tejidos sin cambios notables. Para lograrlo, se
requiere la inmovilización de las moléculas proteicas (ya sea por coagulación o precipitación) y, sobre
todo, la inhibición de las enzimas, convirtiéndolas en insolubles. Esta acción asegura la integridad de las
células y los tejidos y se logra mediante el uso de agentes químicos conocidos como fijadores.

Los fijadores se dividen en dos categorías principales:

• Oxidantes: incluyen sustancias como el tetraóxido de osmio (ácido ósmico), el bicromato

de potasio, el ácido crómico, el bicloruro de mercurio (conocido como "sublimado
corrosivo"), el ácido pícrico y el ácido acético.

• Reductores: esta categoría comprende el formaldehído, el glutaraldehído, el alcohol

etílico y el alcohol metílico.

La naturaleza oxidante o reductora de los fijadores proporciona a las células condiciones particulares
que mejoran la aplicación de sustancias colorantes. Por ejemplo, el alcohol etílico absoluto preserva el
glucógeno, el bicloruro de mercurio intensifica el colorido de las fibras colágenas y el bicromato de
potasio facilita la tinción de las mitocondrias.

b) Inclusión en parafina (medio duro) para poder obtener cortes muy finos de 5 micras (con el microtomo).
La parafina es una cera. Los tejidos no son miscibles en parafina y por eso se tienen que deshidratar. Se
quita la parafina.

c) Obtención de cortes para la observación al microscopio. Se coloca el corte sobre un portaobjetos.

Planos de corte: Es importante tener en cuenta que no podemos controlar la orientación durante el
proceso de corte, dado que estamos tratando con estructuras microscópicas y numerosas. Debido a la
aleatoriedad de este proceso, es posible obtener cortes transversales, longitudinales, sagitales y otros
tipos. Por tanto, podemos observar imágenes diferentes de la misma estructura si realizamos cortes
distintos en distintos planos de corte.

En la preparación de muestras de tejido u órganos, el proceso comienza con la fijación, que tiene como objetivo
conservar la estructura del tejido para futuros procedimientos. Esto se logra mediante el uso de sustancias
químicas, y es esencial sumergir las muestras en el fijador inmediatamente después de su extracción del cuerpo.
La fijación cumple varias funciones, como detener el metabolismo celular, prevenir la degradación enzimática,
eliminar microorganismos patógenos y endurecer el tejido al formar enlaces cruzados o desnaturalizar proteínas.

La formalina, una solución acuosa de formaldehído al 37%, es el fijador más comúnmente utilizado y se aplica en
diversas concentraciones y combinaciones con otros compuestos y amortiguadores. El formaldehído preserva la
estructura general de la célula y sus componentes extracelulares al reaccionar con grupos amino en las proteínas.
Es importante destacar que no afecta la estructura tridimensional, lo que permite que las proteínas mantengan
su capacidad de reacción con anticuerpos.

El siguiente paso es la inclusión en parafina, lo que facilita el proceso de corte. Para ello, la muestra se impregna
con un medio de inclusión que permite la realización de cortes extremadamente delgados, generalmente en el
rango de 5 a 15 micras. Después de la fijación, la muestra se lava y deshidrata en soluciones de alcohol, cuya
concentración se incrementa hasta el 100% para eliminar el agua. En la etapa de aclaramiento, se utilizan
solventes orgánicos como xileno o tolueno, que no se mezclan con el alcohol ni la parafina, para eliminar el
alcohol antes de la infiltración en parafina.

Una vez que la parafina fundida se enfría, se corta para formar un bloque de tamaño adecuado. Este bloque se
coloca en un microtomo, que produce los cortes. Luego, los cortes se montan en portaobjetos utilizando un
 medio de montaje que se endurece, manteniendo la muestra unida al vidrio para evitar su deterioro con el
tiempo.

B. MÉTODOS DE TINCIÓN:

Se denomina técnica histológica al conjunto de procedimientos aplicados a un material biológico (animal o

vegetal) con la finalidad de prepararlo y conferirle las condiciones óptimas para poder observar, examinar y
analizar sus componentes morfológicos a través de los microscopios fotónicos y electrónicos.

El procedimiento de coloración o tinción consiste en que una estructura celular o tisular adquiere
específicamente un color bajo la acción de una sustancia colorante. Se considera que una estructura se ha
coloreado o teñido cuando al ser lavada con el líquido que disuelve al colorante, no se decolora.
Podemos clasificar las técnicas de tinción en dos categorías:
• Técnicas histológicas convencionales
• Técnicas histológicas no convencionales

C. OBSERVACIÓN AL MICROSCOPIO: Para estimar el aumento de un corte podemos observar el tamaño de los
nucleos, como referencia. Los límites celulares no se ven a menos que se tiña la membrana, por eso nos fijamos
en el núcleo. También es habitual usar como refencia a los eritrocitos para medir distancias a ojo, teniendo en
cuenta que tienen una longitud aproximada de 7,5μm.

B. MÉTODOS DE TINCIÓN:

Para ilustrar estos tipos de tinciones, tomemos como ejemplo la glándula tiroides. Este
órgano tiene la particularidad de ser el único capaz de retener yodo desde el entorno, al
igual que sus hormonas y sus precursores. Estos precursores se almacenan en vesículas
llamadas folículos tiroideos, rodeados por células denominadas tirocitos. Estos tirocitos
se encargan de liberar los precursores y producir hormonas, liberándolas al torrente
sanguíneo cuando es necesario. Estas hormonas desempeñan un papel crucial en la
regulación del metabolismo, entre otras funciones esenciales. Además de los tirocitos,
en la glándula tiroides también se encuentran las células C, responsables de la síntesis,
almacenamiento y liberación de calcitonina, una hormona que regula el metabolismo
óseo. Estos componentes se hallan rodeados por vasos sanguíneos y tejido conjuntivo.
La capacidad de visualizar estas estructuras dependerá de la técnica de tinción
empleada. Células de tiroides

B.1.-TÉCNICAS CONVENCIONALES:

1) HEMATOXILINA-EOSINA:

En el procedimiento de rutina, se realiza con mayor frecuencia el corte de tejidos que

han sido teñidos con hematoxilina-eosina. Consiste en la tinción de:

• Los núcleos mediante una hematoxilina, previamente oxidada y transformada

en hemateina a la que se le añade una sustancia mordiente para formar una laca.
Los núcleos se colorean de azul, azul morado, violeta, pardo oscuro o negro,
dependiendo de los agentes oxidantes y mordientes que se utilizaron.

• El citoplasma y material extracelular utilizando la eosina que les confiere Tiroides teñido mediante hematoxilina-eosina
diversos grados de color rosado.

Los colorantes ácidos, también conocidos como colorantes aniónicos, llevan una carga eléctrica negativa. A menudo se les
llama colorantes citoplasmáticos debido a su capacidad para teñir el grupo químico que se encuentra cargado
eléctricamente en el extremo de la cadena de aminoácidos que forma parte de las proteínas citoplasmáticas. Estas
sustancias que atraen a los colorantes ácidos se llaman "acidófilas" y su estructura química incluye componentes básicos o
alcalinos. Los colorantes ácidos reaccionan con grupos catiónicos en células y tejidos, en particular con grupos amino
ionizados en proteínas. Ejemplos de colorantes ácidos incluyen la eosina, el amarillo de metanilo, la fucsina ácida, el ácido
pícrico, el verde rápido, el naranja G, la safranina, el azul de anilina, entre otros.
Por otro lado, los colorantes básicos son sales que tienen una base coloreada y una porción ácida incolora. Un ejemplo de
esto es el azul de metileno o clorhidrato de azul de metileno, cuyo componente colorante es la base azul de metileno, no
el ácido clorhídrico, que es incoloro. Los colorantes básicos tienen carga eléctrica positiva, por lo que se les conoce como
colorantes catiónicos, e interactúan con componentes aniónicos en células y tejidos, que poseen una carga neta negativa.
Estos componentes incluyen grupos fosfato en ácidos nucleicos, grupos sulfato en glucosaminoglucanos y grupos carboxilo
en proteínas. La capacidad de estos grupos aniónicos para reaccionar con colorantes básicos se llama basofilia. Los
componentes teñidos con hematoxilina también muestran basofilia. La reacción varía según el pH:

- Con un pH alto (alrededor de 10), los tres grupos están ionizados y pueden interactuar con el colorante básico
mediante interacciones electrostáticas.

- Con un pH ligeramente ácido a neutro (entre 4 y 7), los grupos de fosfato y sulfato están ionizados y reactivos al
colorante básico.

- Con un pH bajo, solo los grupos sulfato están ionizados y reaccionan con colorantes básicos.

Las sustancias que se tiñen con colorantes básicos se denominan "basófilas" y generalmente contienen componentes
ácidos. La basofilia también se observa en componentes citoplasmáticos como el retículo endoplasmático rugoso (RER) y
en materiales extracelulares, como los hidratos de carbono complejos presentes en la matriz del cartílago.

Ejemplos de colorantes básicos incluyen la hematoxilina, el rojo nuclear, el azul de metileno, la tionina, el azul de toluidina,
la fucsina básica, entre otros.

Por otro lado, los colorantes neutros son sales en las que tanto la parte básica como la parte ácida contribuyen al color. Un
ejemplo de esto es el eosinato de azul de metileno o el eosinato de azur de metileno. Estos colorantes tienen la propiedad
de teñir simultáneamente tanto los componentes nucleares como los citoplasmáticos, a veces proporcionando colores
diferentes (metacromasia) a ciertos componentes citoplasmáticos, como las granulaciones específicas de los granulocitos,
un tipo de leucocitos. Los colorantes neutros se utilizan en fórmulas de tinción para frotis sanguíneos, como los colorantes
de Wright, May Grünwald, Giemsa, entre otros.

En cortes teñidos con hematoxilina-eosina, no es posible determinar la composición química de los componentes
celulares. Por lo tanto, se requieren diversas técnicas de fijación para preservar estos elementos y sus estructuras. Algunos
productos químicos, como los alcoholes y los solventes orgánicos, pueden disolver los lípidos neutros, lo que puede
resultar en daño a las células.

Para conservar los lípidos neutros, se emplean cortes de tejido congelado previamente fijados en formalina, y se utilizan
colorantes solubles en grasas. Para preservar las estructuras de la membrana celular, se utilizan fijadores especiales que
contienen metales pesados, como el permanganato y el osmio, que se adhieren a los fosfolípidos. En el contexto de la
microscopía electrónica, se utiliza el tetraóxido de osmio como agente de fijación.

2) TRICRÓMICOS (Mason, Gomori, etc)

Se emplean tres colorantes de diferentes tipos, lo que se identifica por la presencia de

tres colores distintos en la muestra. Por lo general, se inicia teñiendo los núcleos
(conocido como tinción de fondo) utilizando hematoxilina, un colorante básico que
otorga un tono morado. Asimismo, se utiliza un colorante ácido, como el escarlata de
Biebrich, para teñir en rojo intenso las proteínas básicas. Por último, el tercer color se
aplica a las fibras conjuntivas, utilizando colorantes como el azul de anilina o el verde
metilo.

3) IMPREGNACIONES METÁLICAS: Método tricrómico

En la técnica histológica, existen otros métodos que permiten la observación de

células y tejidos sin la necesidad de recurrir a colorantes naturales o artificiales. Estos
procedimientos implican el uso de sales de metales pesados que entran en contacto
con los componentes celulares y tisulares. Luego, a través de sustancias reductoras u
oxidantes, estos metales pesados se depositan en algunos de estos componentes
mediante precipitación o impregnación. Este conjunto de técnicas se conoce como
"impregnaciones metálicas."

Impregnación metálica
Un ejemplo de este enfoque es el uso de sales de plata u oro, que tienen la capacidad de teñir selectivamente algunas
neuronas, aunque no todas. Esto lo convierte en una herramienta extremadamente útil para el estudio de tejidos
nerviosos.

B.2.-TÉCNICAS HISTOLÓGICAS ESPECÍFICAS: tiñen grupos químicos concretos

Los métodos químicos específicos pueden proveer información acerca de la función de las células y los componentes
extracelulares de los tejidos.

Los métodos histoquímicos y citoquímicos pueden tener su fundamento en la unión específica de un colorante, el uso de
anticuerpos marcados con un colorante fluorescente dirigidos contra un componente celular en particular o la actividad
enzimática de un elemento constitutivo de las células.

1) TÉCNICAS HISTOQUÍMICAS:

Grupos aldehído y Reactivo de Schiff: La reacción característica del reactivo de Schiff,

que proviene de la fucsina básica decolorada, es su capacidad para interactuar con
grupos aldehído, generando un color rojo distintivo. Esta reacción es fundamental
en las pruebas de ácido peryódico de Schiff y en la técnica de Feulgen.

La prueba de ácido peryódico de Schiff o PAS se utiliza para teñir carbohidratos y

macromoléculas que contienen una cantidad significativa de ellos. Esta técnica se
emplea para visualizar el glucógeno en las células, el moco en varios tipos de células
y tejidos, así como la membrana basal en epitelios y las fibras reticulares en el tejido
conjuntivo. Tejido renal teñido con PAS
T: Túbulo renal
La tinción PAS de la membrana basal y las fibras reticulares se basa en la presencia o C: capilares glomerulares
asociación de proteoglucanos, que son carbohidratos complejos unidos a un núcleo CB: cápsula de Bowman
proteico.

2) INMUNOFLUORESCENCIA

El principio fundamental de la inmunocitoquímica se basa en la especificidad de la interacción entre un antígeno y un

anticuerpo.

Los anticuerpos, también conocidos como inmunoglobulinas, son glucoproteínas

producidas por células específicas del sistema inmunológico en respuesta a
proteínas extrañas o antígenos. En el laboratorio, es posible purificar los
anticuerpos de la sangre y luego marcarlos con un tinte fluorescente. En términos
generales, los tintes fluorescentes son compuestos químicos que absorben luz de
distintas longitudes de onda y, posteriormente, emiten luz visible en una longitud
de onda específica, como verde o rojo, por ejemplo. No estamos limitados a usar
solo un color, podemos usar varios colores en varios anticuerpos, lo que se conoce
como doble inmunofluorescencia, triple inmunofluorescencia, etc. Los anticuerpos
marcados con fluorocromos se pueden aplicar a cortes de muestras en
portaobjetos para identificar antígenos en las células y tejidos. Luego, la interacción
Imagen obtenida utilizando la técnica de
del anticuerpo con el antígeno se puede examinar y fotografiar utilizando un inmunofluorescencia
microscopio de fluorescencia o un microscopio confocal.

En la inmunocitoquímica, se utilizan dos tipos de anticuerpos: los anticuerpos

policlonales, derivados de animales inmunizados, y los anticuerpos monoclonales,
producidos por líneas celulares en constante replicación. El proceso se inicia
mediante el aislamiento de una proteína específica de una especie, la cual se inyecta
en otra. El sistema inmunológico de la especie receptora identifica esta proteína
inyectada como un antígeno, dando lugar a respuestas inmunológicas que involucran
diversos grupos o clones de linfocitos B. La clonación de estos linfocitos B resulta en
la generación de anticuerpos dirigidos a la proteína original, como la actina en este
caso. Los anticuerpos policlonales son mezclas de anticuerpos producidos por
múltiples clones de linfocitos B, cada uno de los cuales reconoce una región distinta
en la molécula de actina. Estos anticuerpos se purifican y posteriormente se marcan

Doble inmunofluorescencia
 con un tinte fluorescente, lo que facilita la detección de proteínas como la actina en las células de la especie original. Si la
actina se encuentra presente en una célula o tejido, los anticuerpos se unen a ella, y esta reacción puede observarse a
través del microscopio de fluorescencia.

En contraste, los anticuerpos monoclonales son generados por líneas celulares productoras de anticuerpos que
pertenecen a un solo grupo o clon de linfocitos B idénticos.

Se pueden emplear métodos tanto directos como indirectos para identificar estas células:

Directos: Esta técnica utiliza un anticuerpo primario, generalmente

monoclonal, que se encuentra marcado con un fluorocromo y se une
directamente al antígeno presente en la muestra. En este enfoque, se emplea
un solo anticuerpo marcado para la detección.

Indirectos: Tiene una mayor sensibilidad. En lugar de marcar directamente un

anticuerpo específico con un fluorocromo, se utiliza un anticuerpo secundario
que se une al anticuerpo primario. Luego, este anticuerpo secundario se
encuentra conjugado con colorantes fluorescentes diferentes, lo que permite
la aparición de múltiples marcas en una misma sección de tejido cuando se
realizan estudios microscópicos.

3) INMUNOHISTOQUÍMICA

En esta situación, se emplea un microscopio de luz visible, y el anticuerpo anti-

calcitonina se tiñe del siguiente modo: el anticuerpo anti-calcitonina es reconocido
por otro anticuerpo que posee un esqueleto compuesto por moléculas de
peroxidasa. Estas moléculas son incoloras; sin embargo, cuando entran en contacto
con sustrato (peróxido de hidrógeno) y un cromógeno (diaminobencidina),
experimentan una reducción que da lugar a una tinción de color marrón. Al igual
que en los métodos previos, esta técnica es altamente específica, ya que se basa en
la reacción entre el antígeno y el anticuerpo.

tiroides: marcaje de la calcitonina empleando

técnicas inmunohistoquímicas

4.-TIPOS DE MICROSCOPIO:

MICROSCOPIO DE CAMPO CLARO O COMÚN: Emplea luz blanca.

Este microscopio se caracteriza porque emplea luz natural o luz artificial como
energía luminosa para formar las imágenes del objeto que se observa. La
imagen muestra puntos o áreas iluminadas (generalmente coloreados) sobre un
fondo claro o transparente.

Para lograr una imagen nítida, es esencial que el objeto bajo observación esté
coloreado o tintado. Esto implica la aplicación de colorantes específicos que
destacan los componentes celulares y tisulares de la estructura al absorber y
transmitir ciertas longitudes de onda del espectro visible. Las longitudes de
onda no absorbidas son transmitidas hacia el ojo humano o un material
fotográfico sensible, lo que resulta en la apariencia coloreada de la estructura
teñida.

El campo microscópico, en contraste, se presenta como claro o transparente cuando los rayos luminosos directos
procedentes del condensador no encuentran estructuras coloreadas en su camino, permitiendo que ingresen como rayos
de luz blanca en dirección al objetivo. Si se examinan objetos sin colorear, la imagen mostrará detalles con poco contraste,
casi transparentes.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE DE FASES:

Permite la observación de cultivos celulares sin causar daño a las células, lo
que facilita la continuidad de su estudio. Este tipo de microscopio se basa
en la variación de los índices de refracción entre los distintos componentes
celulares, y su resultado se presenta en una imagen en escala de grises. Por
esta razón, es ampliamente utilizado en investigaciones científicas.

Es el microscopio óptico más comúnmente empleado para la observación

de objetos o estructuras que son transparentes y no requieren tinción.
Similar al microscopio de campo oscuro, esta herramienta posibilita la
observación de células vivas para identificar y analizar sus características
morfológicas, así como diversas funciones que puedan llevar a cabo, como
fagocitosis, mitosis y movimientos ameboideos, ciliares o flagelares.

El principio óptico subyacente en este tipo de microscopio radica en su capacidad para transformar las pequeñas
diferencias en los índices de refracción de los distintos componentes celulares en variaciones de intensidad luminosa. Esto
se traduce en imágenes en las que las estructuras del objeto observado se destacan en tonos oscuros, brillantes y tonos
intermedios, lo que permite un contraste adecuado para su análisis.

MICROSCOPIO DE CONTRASTE INTERFERENCIAL:

Este tipo de microscopio se basa en principios ópticos similares al microscopio de contraste de fases, ya que su imagen se
genera a partir de las diferencias de fase en los rayos de luz que atraviesan el objeto observado. Sin embargo, se diferencia
del microscopio de contraste de fases en su sistema óptico.

Este microscopio utiliza un filtro especial de luz polarizada para orientar las ondas de luz en un único plano, generalmente
a un ángulo de aproximadamente 45 grados. Estas ondas de luz polarizada se dirigen hacia un prisma especial, conocido
como prisma de Wollaston. En la primera parte del prisma, estas ondas de luz se dividen en dos, vibrando en dos planos
diferentes con un ángulo de 90 grados entre ellos, pero con un pequeño desfase. Posteriormente, al atravesar la segunda
parte del prisma, estas dos ondas luminosas emergen como dos ondas luminosas separadas, pero ahora están en fase.

Estas ondas luminosas separadas y en fase se dirigen hacia el objeto que se está observando, iluminando puntos muy
cercanos en el mismo. De esta manera, se revelan detalles de la muestra, como zonas con índices de refracción
homogéneos, regiones con diferentes índices de refracción o los bordes de estructuras con índices de refracción variados,
entre otros aspectos.

MICROSCOPIO DE FLUORESCENCIA:

Ciertas sustancias naturales o artificiales exhiben una propiedad especial: cuando son estimuladas por energía de una
longitud de onda específica, como la radiación ultravioleta o la radiación luminosa violeta o azul, absorben esta energía y
emiten fotones que conforman ondas de luz visibles, con longitudes de onda siempre mayores que las que las excitó
inicialmente. Este fenómeno se conoce como fluorescencia. La luz emitida se percibe como destellos de colores en
contraste con un fondo oscuro.

La condición fundamental para que se produzca la fluorescencia es que la longitud de onda de la energía radiante que
actúa como estímulo sea menor que la longitud de onda de la luz emitida como respuesta.

La fuente lumínica es un filtro de wolframio, y en este caso es luz negra, por lo que solo se observarán los colorantes
fluorescentes y el fondo será oscuro.

MICROSCOPIO CONFOCAL:

MICROSCOPÍA ELECTRÓNICA:

El microscopio de luz convencional tiene una capacidad limitada para mostrar detalles de la
imagen de un objeto, conocida como el poder de resolución. Esta capacidad se encuentra
restringida a objetos separados por una distancia de aproximadamente 0.2 micrómetros. El
microscopio óptico es incapaz de ofrecer un poder de resolución mayor debido a dos factores limitantes: la longitud de
onda (λ) de la energía luminosa utilizada y la apertura numérica (A.N.) de la lente del objetivo.

La única manera de incrementar el poder de resolución de un microscopio era encontrar una fuente de energía radiante
con longitudes de onda más cortas que las presentes en el espectro luminoso visible.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE TRANSMISIÓN

El microscopio electrónico de transmisión se basa en principios similares a los de un microscopio de luz convencional, pero
en lugar de utilizar luz visible, emplea haces de electrones. Además, reemplaza las lentes ópticas tradicionales por "lentes"
generadas mediante campos electromagnéticos. Las imágenes que proporciona son imágenes bidimensionales. Los
principales componentes de este tipo de microscopio incluyen:

1. Cátodo: Este componente consta de un filamento de alambre de

tungsteno que se calienta para emitir un flujo de electrones cuya
velocidad y longitud de onda están vinculadas al voltaje aplicado.

2. Ánodo: El ánodo se sitúa cerca del cátodo y orienta los haces de

electrones, los agrupa y acelera.

3. Lente condensadora (primer campo electromagnético): Los

haces de electrones procedentes del ánodo se concentran y dirigen
hacia el soporte de la muestra.

4. Soporte de la muestra: En este lugar, los electrones atraviesan o

interactúan con la muestra, dependiendo de la densidad de sus
componentes. Las muestras deben ser secciones extremadamente
delgadas para permitir el paso de los electrones.

5. Lente objetivo (segundo campo

electromagnético): Los electrones que atraviesan o son desviados por la muestra llegan a esta
área, donde se enfocan para crear una imagen ampliada. Esta imagen se proyecta en una
pantalla fluorescente o una placa fotográfica.

6. Lente ocular o de proyección (tercer campo electromagnético): Refocaliza la imagen y la

proyecta, aumentada varias veces, hacia una pantalla fluorescente.

El M.E. de transmisión utiliza un haz de electrones para iluminar una muestra, y la imagen
resultante se compone de áreas iluminadas o electrónicas (electronlúcidas) y áreas oscuras o
electrondensas, según cómo interactúen los electrones con los componentes de la muestra.

MICROSCOPIO ELECTRÓNICO DE BARRIDO (SCANNING)

El microscopio electrónico de barrido sigue los mismos principios electrónicos que

el M.E. de transmisión pero con una diferencia fundamental: los electrones no
atraviesan la muestra para formar la imagen. En cambio, se concentran y aceleran
hasta crear un haz extremadamente delgado, que rastrea o "barrre" la superficie
de la muestra. Proporciona pues imágenes 3D. Cuando estos electrones inciden
en la muestra, pueden ser reflejados o generar electrones secundarios al chocar
con los componentes de la misma.

En ambos casos, los electrones enviados inciden en un detector cerca de la

muestra. Este dispositivo está conectado a un amplificador que envía señales en
forma de rayos catódicos a un monitor de televisión. La imagen se registra
generalmente con una cámara fotográfica.