CFGS Técnico Superior Laboratorio

Clínico y Biomédico
Análisis Bioquímico
Curso 2023/24

TEMA 2: APLICACIÓN DE TÉCNICAS

UTILIZADAS EN EL LABORATORIO DE
BIOQUÍMICA CLÍNICA (II)

Alberto García Bartolomé

Departamento de Sanidad
CIFP Camino de la Miranda (Palencia)
alberto.garbar@educa.jcyl.es
 ÍNDICE
1. INTRODUCCIÓN:
2. REFRACTOMETRÍA.
3. FOTOMETRÍA DE REFLECTANCIA. QUÍMICA SECA.
4. ESPECTROMETRÍA DE MASAS.
5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN.
5.1 CENTRIFUGACIÓN.
5.2 ELECTROFORESIS.
5.2.1 Tipos de electroforesis.
6. CROMATOGRAFÍA.
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.
6.1.1 Cromatografía de reparto.
6.1.2 Cromatografía de adsorción.
6.1.3 Cromatografía de intercambio iónico.
6.1.4 Cromatografía de exclusión molecular..
6.1.5 Cromatografía en papel.
6.1.6 Cromatografía en capa fina.
6.1.7 Cromatografía en columna.
7. OSMOMETRÍA.
8. AUTOMATIZACIÓN.
9. USO EFICIENTE DE RECURSOS.
 1. INTRODUCCIÓN
v Las técnicas analíticas instrumentales son empleadas universalmente en diversos
laboratorios.

v Además de las técnicas espectroscópicas existen otros tipos de técnicas

instrumentales analíticas.
 2. REFRACTOMETRÍA
v Es un método óptico que se basa en las propiedades de la luz.

v Consiste en la refracción de la luz, y se basa en la ley de Snell.

v En clínica se utiliza la refractometría para la medida de la densidad urinaria y de las

proteínas totales en suero.
 2. REFRACTOMETRÍA

v En la práctica clínica se utiliza el

refractómetro desarrollado por Abbé.

v El refractómetro consta de dos prismas: el de iluminación y el de refracción. Entre

ellos se sitúa una delgada capa de la muestra que se va a analizar.
 3. FOTOMETRÍA DE REFLECTANCIA
v Está basada en la medición de las
longitudes de onda que no absorbe (refleja)
el elemento a analizar.

v El sistema contendrá un soporte que contiene una

serie de reactivos para que tenga lugar una
reacción colorimétrica al entrar en contacto con la
muestra problema.
 4. ESPECTROMETRÍA DE MASAS
v Es una técnica relativamente actual.

v No es una técnica espectroscópica.

v El dispositivo consta de: fuente de ionización, acelerador de partículas, imán,

analizador de masa y carga (m/z), detector y registrador
 4. ESPECTROMETRÍA DE MASAS

v Cada molécula se fragmentará de

manera específica generando unos iones
resultantes que sirven para la identificación y
cuantificación.

v Estos “espectros” se identifican mediante la comparación con librerías de datos.

v La espectrometría de masas (MS) generalmente se acopla

a un método de separación previo (GC o LC).

v Esta técnica tiene una elevada sensibilidad y especificidad.

 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
v En la naturaleza, las sustancias se suelen encontrar formando parte de mezclas.

v Una mezcla es un material formado por dos o más componentes unidos

físicamente pero no combinados químicamente.

Combinación química Combinación física

 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
v Las mezclas se pueden clasificar en:

Heterogénea Homogénea

v En el laboratorio en cantidad de ocasiones se requiere separar los componentes de

una mezcla, bien sea para determinar su composición o para purificar sus
componentes.

v Métodos de separación son: centrifugación, electroforesis y cromatografía.

 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.1 CENTRIFUGACIÓN.

v Con la centrifugación se pueden separar sólidos o partículas suspendidas en un

líquido, al ser sometidos ambos a una fuerza centrífuga.

v La magnitud de la fuerza centrífuga es directamente proporcional a la masa del solido

(m), el radio de giro (r) y la velocidad de giro (w).

Fcentrífuga = m x r x w2
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.1 CENTRIFUGACIÓN.

v La fuerza centrífuga necesaria para la separación, es provista por una centrífuga o

centrifugadora. Consta de las siguientes partes:
- Tapa
- Eje: Alrededor del cual se produce el
- Rotor o cabezal: Es la pieza que
giro del rotor.
gira. Puede ser fijo u oscilante

- Carcasa protectora
Rotor fijo Rotor oscilante

- Panel de mandos: Varía de unas

centrífugas a otras.
- Motor: Mueve al eje. Se encuentra
dentro del aparato.
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.1 CENTRIFUGACIÓN.

v Existen diferentes tipos de centrifugación :

- Centrifugación diferencial

Isopícnica
- Centrifugación en gradiente
Zonal

- Ultracentrifugación
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.1 CENTRIFUGACIÓN.

v Hay que tener en cuenta una serie de aspectos a la hora de manejar una centrífuga:

Ø Rotores siempre limpios y libres de residuos.

Ø Usar tubos resistentes y del tamaño adecuado.

Ø Correcto equilibrado.

Ø Recipientes correctamente cerrados.

Ø No forzar el paro de la centrífuga.

Ø Chequeo de la velocidad de centrifugación cada cierto tiempo.

 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

v Técnica que separa solutos o partículas

según su movilidad en un medio bajo la
influencia de un campo eléctrico.

v Existen dos tipos de electroforesis: electroforesis libre y electroforesis en zona.

 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

v El proceso de electroforesis consta de los siguientes pasos:

1. Preparación de la muestra

2. Selección y preparación
del soporte

3. Aplicación de la muestra

4. Ejecución electroforesis

5 Detección/revelado

6 Cuantificación
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

v El proceso de electroforesis consta de los siguientes pasos:

1. Preparación de la muestra
Restrictivo

2. Selección y preparación No restrictivo

del soporte

3. Aplicación de la muestra
Químicamente inerte
Consistente y homogéneo
4. Ejecución electroforesis
Estable
5 Detección/revelado Barato

6 Cuantificación
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

v El proceso de electroforesis consta de los siguientes pasos:

1. Preparación de la muestra

2. Selección y preparación
del soporte

3. Aplicación de la muestra

4. Ejecución electroforesis

5 Detección/revelado

6 Cuantificación
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

v El proceso de electroforesis consta de los siguientes pasos:

1. Preparación de la muestra

2. Selección y preparación
del soporte

3. Aplicación de la muestra

4. Ejecución electroforesis

5 Detección/revelado

6 Cuantificación
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

v La migración electroforética va a depender de una serie de factores:

• Características del campo eléctrico.

• Carga neta de la partícula.

• Coeficiente de fricción.

• Fuerza iónica del tampón.

• Propiedades del soporte.

• Temperatura.
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

v El proceso de electroforesis consta de los siguientes pasos:

1. Preparación de la muestra

2. Selección y preparación
del soporte

3. Aplicación de la muestra

4. Ejecución electroforesis

5. Detección/revelado

6. Cuantificación
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

5.2.1 Tipos de electroforesis.

v Dentro de la electroforesis en soporte o zonal se distinguen varios tipos:

• Electroforesis en papel.

• Electroforesis en acetato de celulosa.

• Electroforesis en gel de agarosa.

• Electroforesis en gel de poliacrilamida.

• Isoelectroenfoque.

• Electroforesis bidimensional.

• Electroforesis capilar.
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

5.2.1 Tipos de electroforesis.

v Dentro de la electroforesis en soporte o zonal se distinguen varios tipos:

• Electroforesis en papel.
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

5.2.1 Tipos de electroforesis.

v Dentro de la electroforesis en soporte o zonal se distinguen varios tipos:

• Electroforesis en acetato de celulosa.

 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

5.2.1 Tipos de electroforesis.

v Dentro de la electroforesis en soporte o zonal se distinguen varios tipos:

• Electroforesis en gel de agarosa.

 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

5.2.1 Tipos de electroforesis.

v Dentro de la electroforesis en soporte o zonal se distinguen varios tipos:

• Electroforesis en geles de acrilamida.

 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

5.2.1 Tipos de electroforesis.

v Dentro de la electroforesis en soporte o zonal se distinguen varios tipos:

• Isoelectroenfoque.
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

5.2.1 Tipos de electroforesis.

v Dentro de la electroforesis en soporte o zonal se distinguen varios tipos:

• Electroforesis bidimensional.
 5. TÉCNICAS DE SEPARACIÓN
5.2 ELECTROFORESIS.

5.2.1 Tipos de electroforesis.

v Dentro de la electroforesis en soporte o zonal se distinguen varios tipos:

• Electroforesis capilar.
 6. CROMATOGRAFÍA
v Método de separación basado en las diferentes velocidades de migración de los
componentes individuales de una mezcla a través de un medio estacionario (fase
estacionaria) bajo la influencia de una fase móvil.

Fase estacionaria Fase móvil Detector

Componente con mayor retención Componente con menor retención

v Coeficiente de reparto o distribución.

v Selectividad.
 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

v Según el tipo de interacción entre soluto y fase estacionaria:

• Cromatografía de reparto.

• Cromatografía de adsorción.

• Cromatografía de intercambio iónico.

• Cromatografía de exclusión molecular.

 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

v Según como esté dispuesta la fase estacionaria:

• Cromatografía plana:

- Cromatografía en papel.

- Cromatografía en capa fina.

• Cromatografía en columna:

- Cromatografía de líquidos.

- Cromatografía de gases.
 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

6.1.1 Cromatografía de reparto.

v Se basa en la diferente solubilidad que tienen los

componentes de una mezcla en la fase móvil y en la
estacionaria.

v La fase estacionaria siempre es líquida. La fase móvil

puede ser líquido o gas.

v Dos tipos: cromatografía en fase normal y en fase reversa.

 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

6.1.2 Cromatografía de adsorción.

v La separación se da por las diferentes interacciones entre los componentes de

la mezcla con la fase móvil y la estacionaria.

v La fase estacionaria siempre es sólida.

 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

6.1.3 Cromatografía de intercambio iónico.

v La separación se consigue mediante mecanismos de atracción de cargas

opuestas.

v La elución se puede acelerar mediante

adición de solución iónica o mediante
ajuste de pH.

v Se distinguen dos tipos: Resina-SO3-H+ + Muestra-A+ à Resina-SO3A+ + H

cromatografía de intercambio
Resina-CH2+N(CH3)3Cl- + Muestra-A- à Resina-
catiónico y de intercambio aniónico. CH2+N(CH3)3A- + Cl-
 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

6.1.4 Cromatografía de exclusión molecular.

v Separa los componentes o partículas de una muestra en función de su tamaño.

v La fase estacionaria está formada por geles que conforman una red
tridimensional con poros.
 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

6.1.5 Cromatografía plana en papel.

v La fase estacionaria está constituida por una tira de papel de filtro.

v Dependiendo del grado de retención de los componentes, la fase móvil los

arrastrará a diferentes velocidades y distancias. Para la interpretación del resultado se
usa el factor de retención (Rf) o el factor de retención relativo (Rx).

Distancia recorrida por la sustancia Distancia recorrida por la sustancia

Rf= Rx=
Distancia recorrida por el disolvente Distancia recorrida por un patrón específico
 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

6.1.6 Cromatografía plana en capa fina.

v El fundamento y procedimiento son muy similares a la cromatografía en papel.

v La fase estacionaria se basa en un material

inerte que se extiende formando una fina capa sobre
un soporte de cristal, vidrio o plástico.

v Los componentes separados se identificarán mediante su Rf o su Rx.

 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

6.1.7 Cromatografía en columna.

v Las columnas están compuestas por un tubo de longitud y ancho variables.

v Dentro de la columna estará empaquetada la fase estacionaria (sólida o

líquida).

v La fase móvil es un solvente (gas o líquido) que se pasa a través de la

columna.

v Después de la separación, los componentes

son eluidos fuera de la columna y son
identificados como picos de elución.
 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

6.1.7 Cromatografía en columna.

v La resolución da la capacidad del sistema cromatográfico para separar las

sustancias (separar dos picos en el cromatograma). Para su cálculo, se han de
medir dos parámetros:.

- La distancia a las que aparecen los picos

- El ancho de base de cada pico.

v La resolución se calcula según la fórmula:

R = d2-d1 / 0,5(a2+a1)
 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

6.1.7 Cromatografía en columna.

v Si la fase móvil es un gas inerte, se hablará de cromatografía de gases.

v Existen dos tipos de cromatografía de gases: cromatografía sólido-gas y

cromatografía líquido-gas.
 6. CROMATOGRAFÍA
6.1 TIPOS DE CROMATOGRAFÍA.

6.1.7 Cromatografía en columna.

v Si la fase móvil es líquida, se

hablará de cromatografía de
líquidos.

v En función de cómo fluye la fase móvil se distinguen dos tipos: cromatografía

líquida clásica o cromatografía líquida de alta eficacia (HPLC).

v En función de la composición de la fase móvil: CL isocrática o en gradiente de

elución.
 7. OSMOMETRÍA
v La ósmosis es el fenómeno que consiste en la difusión pasiva de líquido, a través de
una membrana semipermeable, entre el comportamiento más diluido y el más
concentrado.

v Presión osmótica es la presión necesaria para contrarrestar el flujo de agua desde el

compartimento más diluido.
 7. OSMOMETRÍA
v La osmometría es una técnica físicoquímica que se basa en la inferencia de la
osmolalidad, a partir de alguna de las propiedades coligativas de las soluciones.

Osmolaridad Osmolalidad

v Las propiedades coligativas que se miden en la

práctica clínica para determinar la osmolalidad son:

- Presión de vapor.
 7. OSMOMETRÍA
v La osmometría es una técnica físicoquímica que se basa en la inferencia de la
osmolalidad, a partir de alguna de las propiedades coligativas de las soluciones.

Osmolaridad Osmolalidad

v Las propiedades coligativas que se miden en la

práctica clínica para determinar la osmolalidad son:

- Descenso crioscópico.
 7. OSMOMETRÍA
v Existe una alternativa a la medida de la osmolalidad denominada osmolalidad
calculada.

v Se estima cuando se conocen otros parámetros séricos (que son mayoritarios en

cuanto a concentración): cationes, glucosa y urea.
 8. AUTOMATIZACIÓN
v A partir de los años 70 empezaron a aparecer los autoanalizadores.

v No se concibe un laboratorio clínico sin automatización.

v Ventajas:

- Aumenta el número de muestras

- Mayor sensibilidad.
- Análisis rutinarios.
- Mayor fiabilidad.
- Escasa intervención humana.

- Mayor rapidez.
- Se necesita menor cantidad de muestra.
 RECORDAR DE GESTIÓN DE
MUESTRAS

Las mediciones Las mediciones Las mediciones están Las mediciones no

están cerca del están cerca unas cerca del valor están cerca del
valor verdadero de otras pero no verdadero pero no valor verdadero ni
y cerca unas de del valor están cerca unas de cerca unas de
otras. verdadero. otras otras.
 8. AUTOMATIZACIÓN
v Su mayor desventaja es el coste y el mantenimiento.

v Los sistemas automatizados pueden ser: discontinuos o continuos.

Fase preanalítica Fase analítica Fase postanalítica

v Los sistemas actuales combinan distintos tipos de

analizadores: bioquímica, hematología, coagulación,
inmunoanálisis, etc..
 9. USO EFICIENTE DE RECURSOS
v Al igual que en otros ámbitos es necesario optimizar todo trabajo en el laboratorio.

v Para ello, se tendrán en cuenta entre otros aspectos:

Ø Calibración

Ø Seguir parámetros de calidad

Ø Limpieza

Ø Prevención de riesgos

Ø Puesta a punto del equipo

 RECORDAR DE GESTIÓN DE
MUESTRAS
v Las pruebas o estudios que se realizan para:

- Determinar si un componente está presente o no.

- En qué concentraciones está ese componente (analito).

MÉTODO PROCEDIMIENTO PROTOCOLO

ANALÍTICO ANALÍTICO ANALÍTICO
 RECORDAR DE GESTIÓN DE
MUESTRAS

CONTROL
INTERNO

1º 2º
CALIBRACIÓN ANÁLISIS
MUESTRA