UNIVERSIDAD AUTONOMA DE GUERRERO UNIDAD ACADEMICA DE CIENCIAS NATURALES PRACTICA No 4.

REACCIONES DE AMINOACIDOS Y PROTEINAS Introduccin Las protenas son polmeros de alto peso molecular, compuestos por aminocidos unidos entre s por enlaces peptdicos, que cuando se solubilizan son de dimensiones coloidales. Presentan propiedades qumicas y fsicas que dependen directamente de factores extrnsecos, como puede ser el pH, la temperatura, la presencia de sales, etc. Existen varios mtodos para la identificacin y cuantificacin de las protenas, pero la mayora tiene como principio alguna reaccin qumica caracterstica de los grupos R de los diferentes aminocidos. Puede decirse que las protenas reflejan las propiedades qumicas de los residuos de aminocidos que contienen, por lo que la mayora de las reacciones coloridas de identificacin dependen de la existencia de un aminocido especfico en ellas. Objetivos El alumno realizar algunas reacciones coloridas especficas para la identificacin de los aminocidos que constituyen a una protena. El alumno comprender la importancia de estas reacciones para distinguir las protenas. Material y Mtodos. Acido oxlico (sol. Saturada) Hidrxido de sodio al 10% Acido actico glacial Acetato de plomo al 5% Reactivo de biuret Ninhidrina al 1% en butanol saturado Gelatina al 5% con regulador de fosfatos 0.06M, Peptona al 5% pH 7.4. Albmina al 5% Acido ntrico concentrado. Tirosina al 1% Hidrxido de amonio concentrado Triptofano al 1% Oxido rojo de mercurio Fenilalanina al 1% Nitrito de sodio Cistena al 1% Magnesio en polvo o granallas Arginina al 1 %.

Gradilla Tubos de ensayo Pipetas de 1,5 y 10 ml Vaso de precipitados de 100 ml Bao mara Agitador de vidrio Pinzas para tubo

REACCION DEL PLOMO PARA CISTEINA.- Es una reaccin caracterstica para grupos sulfhidrilos. METODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema 2 ml de NaOH al 10% y calentar ligeramente. Adicionar de 3 a 5 gotas de acetato de plomo al 5% y calentar nuevamente hasta ver la aparicin de un precipitado negro. b) Anotar los resultados y observaciones en la tabla correspondiente. REACCION DE LA NINHIDRINA.- Es una reaccin caracterstica para grupos amino libres. METODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema, 5 gotas de la solucin de Ninhidrina en butanol. Observar a temperatura ambiente la aparicin de un color azul o violeta que se debe a la presencia de los grupos amino libres; si es necesario, calentar en bao mara 1 2 minutos los tubos en los que no aparece el color. b) Anotar los resultados y observaciones en la tabla correspondiente. REACCION DE HOPKINS-COLE.- Esta reaccin es caracterstica del anillo indol y por lo tanto del triptfano, por ser ste el nico aminocido que contiene este grupo. El reactivo contiene cido glioxlico que se prepara por reduccin del cido oxlico con magnesio en polvo o amalgama de sodio. Numerosos aldehdos pueden dar una reaccin similar con triptfano. La naturaleza del compuesto colorido formado no se conoce totalmente. Los cloratos, nitritos y cloruros interfieren en la reaccin. METODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problemas, 5 gotas del reactivo de Hopkins-Cole y mezclar bien. Estratificar cuidadosamente con 1 ml de cido sulfrico concentrado, procurando que se forme un lmite bien definido entre ambos lquidos. La aparicin de un anillo violeta-rojizo en la interfase es una prueba positiva de la presencia del triptfano. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados y observaciones. REACCION DE MILLON.- El reactivo de Millon contiene una mezcla de nitritos y nitratos mercricos en cido ntrico concentrado. Debido a la presencia del grupo fenlico se produce un compuesto de color rojo. METODOLOGIA. A) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema de 2 a 5 gotas del reactivo de

Millon y calentar en bao mara. La aparicin de un color rojo ser una prueba positiva. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados y observaciones.

REACCION XANTOPROTEICA.- Esta reaccin es positiva tanto para aminocidos aromticos activados como protenas en solucin, aunque es mucho ms sensible cuando stas se encuentran perfectamente secas. Esta reaccin depende de la nitracin de los anillos bencnicos activados produciendo un color amarillo. La prueba resulta negativa para protenas que no contengan aminocidos aromticos activados. Ciertos derivados del benceno, como el cido pcrico, reaccionan formando los nitro derivados amarillos. METOLODOLOGIA. a) Adicionar a 1 ml de las soluciones problema, 1 ml de cido ntrico concentrado, calentar la mezcla y enfriar. Estratificar cuidadosamente con 1 ml de hidrxido de amonio concentrado. La paricin de un color amarillo o naranja en la interfase ser prueba positiva. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados obtenidos. REACCION DEL BIURET.- Esta es una prueba general para protenas y pptidos de cadena no menor de 3 unidades de aminocidos. Una utilidad de esta reaccin es seguir el proceso de una hidrlisis protenica, ya que la reaccin ser negativa cuando la hidrlisis sea completa. METODOLOGIA. a)Adicionar 1 ml de la solucin problema 2 ml de NaOH al 10% y de 3 a 5 gotas del reactivo de biuret (solucin de CuSO4 al 0.5%), mezclar bien. La formacin de un color violceo o la precipitacin de hidrxido cprico ser una prueba positiva. Si el color de la reaccin del biuret no se presenta inmediatamente, deja reposar de 10 a 15 minutos. b) Anotar en la tabla correspondiente los resultados y observaciones.
Reaccin para grupos SH Gelatina Peptona Albnina Aspartame Tirosina Triptofano Fenilalanina Cistena Arginina Agua Interpretacin Reaccin de la Ninhidrina Reaccin de Hopkinscole Reaccin de Milln Reaccin de Xantoproteca Reaccin de Biuret

PREPARACION DE REACTIVOS. 1. Reactivo de Millon.- El reactivo se prepara aadiendo 60 g de xido de Mercurio a una mezcla de 45 ml de HNO3 concentrado y 50 ml de H2O. Cuando el xido de mercurio se ha disuelto, se aade 50 ml de una solucin de nitrito de sodio al 30%. El reactivo de millon contiene nitritos y nitratos mercricos.

2. Reactivo de Hopkins-Cole.- Se prepara aadiendo 10 g de magnesio en Polvo en 20 ml de agua destilada. Agregar lentamente 250 ml de una solucin fra y saturada de cido oxlico. La reaccin se produce con gran rapidez, desprendiendo tanto calor que se debe enfriar el matraz en la corriente de agua mientras se aade el cido. Cuando se ha terminado de aadir el cido. Agitar el contenido y verterlo sobre un papel filtro para separar el oxalato de magnesio insoluble. Se vierte un poco de agua sobre el filtro, se acidifica de magnesio al quedar largo tiempo en reposo, y se lleva a un litro de agua destilada en un matraz aforado. Esta solucin contiene nicamente la sal magnsica de cido glioxlico. 3. Nitrito de sodio al 30%.- Pesar 30 g de nitrito de sodio y llevar a 100 ml con Agua destilada. 4. Soluciones de aminocidos al 0.5%.- Pesar 0.5 del aminocido a preparar y Llevar a 100 ml con agua destilada. Si no se disuelve fcilmente, adicionar algunas gotas de solucin de NaOH o HCI para mejorar su solubilidad. Calentar un poco si es necesario. 5. Ninhidrina al 1% en butanol saturada con regulador de fosfatos 0.0006 M, PH 7.4.- Pesar 5 g de Ninhidrina y llevar a 500 ml con butanol. Mezclar 500 ml de regulador de fosfatos 0.006M, pH 7.4 con los 500 ml de Ninhidrina al 1% en butanol, agitar en embudo de separacin, eliminar la fase interior (acuosa) y usar la fase superior orgnica. 6. Regulador de fosfatos 0.006M, pH 7.4.- Pesar 2.136 g de Na2 HPO4*12H2O y llevar a 1000 ml con agua destilada en un matraz aforado. Pesar 0.816 g de 0.816 g de KH2PO4 y llevar a 1000 ml con agua destilada en un matraz aforado. Mezclar en proporciones 8:2 de Na2HPO4 y KH2PO4 respectivamente; ajustar el pH si es necesario. 7. Reactivo de biuret.- pesar 0.5 g de sulfato de cobre y llevar a 100 ml con Agua destilada.

Cuestionario 1. Cuales son los aminocidos esenciales y con que pruebas especficas se podran identificar? 2.A que se le denomina zw it terion? 3. Bibliografa 1. Clark, J: M: Bioqumica Experimental, Ed. Acribia, Espaa, (1966).
J.L. y A. L. Neal, Laboratory Experiments in Biochemistry, Academic Prees. Inc. , N.Y., pp. 129-141, (1967).
2.Daniels,

3. Dotty, L.B. y M.J. Morten, Laboratory Instruments in Biochemistry, Mosby Co., pp 29-31 (1971). 4. Johnston, B.R., Laboratory Manual of Biochemistry, Burges Publishing Co., Minnesota, pp. 1-13, 41-54, (1958). 5. Legget, B.J., Techniques in Protein Chemistry, Elsevier Publishing Co., pp. 349351, (1967). 6. Litwack, G., Bioqumica Experimental, Ed. Omega, S:A:, Barcelona, pp. 169180, (1967).

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