PRODUCCIN Y SECRECIN DEL FACTOR ESTIMULANTE DE COLONIAS DE GRANULOCITOS Y MONOCITOS DE HUMANO BIOLGICAMENTE ACTIVO EN CULTIVO SUSPENDIDO DE TOMATES TRANSGNICOS

Tae-Ho Kwon, Young-Sook Kim, Jae-Hwa Lee & Moon-Sik Yang Introduccin El factor estimulante de colonias de granulocitos y monocitos o GM-CSF por sus siglas en ingls (Granulocyte Macrophage Colony-Stimulating Factor), son reguladores importantes de la respuesta inmune y de la homeostasis tisular. Pertenece a la familia de glicoprotenas que modulan la hematopoyesis y la capacidad funcional de los leucocitos maduros. Sus acciones sobre las clulas fagocticas incluyen incremento en la sntesis de citoquinas (IL-1, TNF alfa), de la capacidad fagoctica y destruccin de patgenos. Regula, adems, el trfico de los leucocitos. El factor GM-CSF es usado en el tratamiento de: Neutropenia y anemia aplstica. Disminuye el riesgo de contraer infeccin asociada con el trasplante de mdula sea Acelera la formacin de los neutrfilos

Para las aplicaciones clnicas, el GM-CSF ha sido expresado y purificado a partir de varios organismos: - Aspergillus niger - Escherichia coli - Levaduras - Clulas de insecto - Clulas vegetales Una amplia gama de protenas biolgicamente activas pueden ser producidas en plantas transgnicas. La produccin de protenas de alto valor agregado en cultivos celulares de la planta tiene varias ventajas sobre la produccin en sistemas de expresin en procariotas y clulas animales, como: Son generalmente de bajo costo para cultivar a gran escala. Las modificaciones post-traduccionales son ms similares a las de las clulas animales, que son las modificaciones introducidas en las clulas procariotas. Las protenas son ms seguras que las producidas a travs de sistemas de expresin procariticos y animal. La purificacin de la protena es mucho ms econmico y ms fcil que en otros sistemas de expresin.

Sin embargo, existen varias limitaciones de los sistemas de cultivo de clulas vegetales, tales como: Tasa de crecimiento lento - Bajos niveles de expresin de la protena Estas limitaciones deben ser resueltas para establecer slidamente cultivos de clulas vegetales como eficientes sistemas de expresin.

Objetivo: Analizar la expresin de GM-CSF en suspensiones celulares derivados de lneas de tomate genticamente modificados. Materiales y Mtodos Material vegetal y Vector de expresin Como material vegetal se utilizaron las semillas provenientes de Lycopersicon esculentum cv. Posteriormente se esterilizaron en etanol al 70% (v/v) por 10 segundos, despus se colocaron en hipoclorito de sodio al 2% (w/v) por 10 minutos y se enjuagaron 3 o 4 veces con agua destilada estril. Para su germinacin se utiliz el medio MS slido, sin adicionar reguladores de crecimiento, a 25 C en oscuridad. Para la posterior transformacin de las plantas, se utiliz la cepa de Agrobacterium tumefaciens LBA4404, que contiene el vector de expresin binario pMYO64 (Kwon et al. 2003b), este vector es portador del gen humano del GM-CSF fusionado con el promotor CaMV 35S. Transformacin de las Plantas Despus de 7 a 10 das de germinacin de las semillas provenientes de Lycopersicon esculentum cv., se seleccionaron segmentos de hipoctilo de tomate de 5 mm, estos segmentos fueron pre-cultivados en medio MS, adicionando 0.5 mg de cido indol actico y 0.1 mg de 6-bencilaminopurina. Despus de 2 das esos explantes fueron co-cultivados con Agrobacterium tumefaciens LBA4404, y posteriormente se transfirieron a medio MS suplementado con 0.5 mg de cido indol-3-actico, 0.1 mg de bencilaminopurina, 50 mg de kanamicina y 300 mg de cefotaxima. Para inducir el enraizamiento de estos supuestos brotes transgnicos, se transfirieron a medio MS libre de hormonas y se adicion 50 mg de kanamicina y 200 mg de cefotaxima. Las plntulas enraizadas se colocaron en macetas con una mezcla al 1:1 de vermiculita y turba, para su posterior anlisis. PCR Genmico y anlisis de Northern blot El DNA genmico se aisl de las hojas jvenes de las supuestas plantas transgnicas (molidas con un mortero) con el Mini kit Dneasy Plant. Para realizar el anlisis por PCR se utiliz primers especficos para hGM-CSF, el ciclado trmico (30 ciclos) se realiz: 1 min a 94C, 1 min a 55 C y 1 min a 72C. Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en gel con 1% (w/v) de agarosa y fueron visualizados por tincin con bromuro de etidio y bajo luz ultravioleta. Para aislar el RNA de las plantas transgnicas se utiliz el Mini kit Rneasy Plant. El anlisis de Northern blot se llev a cabo con el procedimiento Alwine (1977), los RNA blots se hibridaron con una sonda marcada -32P de un fragmento de 470pb de DNA que contiene el cDNA del gen de hGM-CSF. Cultivos celulares de las plantas Las lneas de suspensin de clulas de tomate se iniciaron a partir de los callos derivados de las hojas de las plantas transgnicas, estos fueron cultivados en medio MS suplementado con 0.1 mg de cido 2,4diclorofenoxiactico, 0.05 mg de cinetina, 3% (w/v) de sacarosa y 50 mg de kanamicina. Las condiciones de operacin fueron 100 rpm a 25C, el cultivo de clulas en suspensin se mantuvo mediante la transferencia de una dcima parte de este cultivo a medio fresco, cada 10 das.

Cuantificacin de hGM-CSF La concentracin de GM-CSF en los medios de cultivo se determin mediante el Kit ELISA especfico para hGM-CSF y se us como estndar el GM-CSF humano derivado de E. coli Recombinante. Resultados Construccin del vector y la Transformacin del tomate El clon de HGM-CSF cDNA fue sintetizado utilizando RT-PCR con fitohemaglutinina (PHA) y la IL-12 recombinante humana que estimula las clulas mononucleares de sangre perifrica. La secuencia de nucletidos del cDNA fue confirmado por anlisis de secuencias de ADN utilizando el mtodo de terminacin de la cadena didesoxinucletidos. El cDNA HGM-CSF fue clonado en el vector de expresin pMY27 (Kwon et al. 2003a) bajo el control de un promotor 35S CaMV duplicados, pMYO64 (Figura 1).

Figura 1. Vector pMYO64 Los segmentos de hipoctilo de tomate fueron transformados con la cepa de A. tumefaciens LBA4404 que alberga el vector pMYO64, que contiene adems la neomicina fosfotransferasa II (NPTII) para la seleccin de plantas transformadas con kanamicina. Por ltimo, tres plantas fueron seleccionadas para el anlisis. Anlisis genmico por PCR y Northern Blot La presencia del hGM-CSF en las plantas transgnicas de tomate (Figura 2-A), fue analizado usando PCR con DNA genmico y los primers diseados para amplificar el gen, apareciendo una nica banda de 470 pb, esta banda no se observ en el control negativo. La hibridacin de esas muestras fue marcada con sondas -32 P y revel una fuerte seal. Las tres plantas transformadas con el gen hGM-CSF tuvieron altos niveles de transcripcin [Figura 2-B], demostrando que el hGM-CSF fue satisfactoriamente transcrito en las plantas.

Figura 2. Anlisis de la expresin por PCR [A] y Northern Blot [B] del gen hGM-CSF en plantas transformadas con pMYO64

Crecimiento celular y anlisis cuantitativo del hGM-CSF en cultivo en suspensin Las clulas alcanzaron 17.6 g de peso seco/Litro en el da 10, como se muestra en la Figura 3-A. El hGMCSF recombinante fue secretado en el medio de cultivo hasta 45 g/L en el da 10, y degradado rpidamente. La taza de hGM-CSF intracelular y extracelular fue determinada por la medicin de la cantidad total de protenas intracelulares y extracelulares por ELISA cuando se encontraba en el da 10 (Figura 3-B).

Figura 3. Cintica de crecimiento celular durante el cultivo en suspensin en lote [A] y anlisis cuantitativo de la localizacin del hGM-CSF secretado durante el cultivo en lote [B]. El rendimiento de hGM-CSF en este sistema es cerca de una quinta parte del producido en un sistema de cultivo de clulas de tabaco, el cual alcanz 250 g/L, sin embargo, a pesar de la cantidad de protenas totales secreta en medio de cultivo, es casi el mismo 50 mg/L en ambos casos (James et al. 2000). Anlisis adicionales son necesarios para explicar las diferencias entre estos dos sistemas de expresin. Modificacin Elicitacin La elicitacin consiste en inducir la biosntesis de metabolitos por exposicin de los cultivos a molculas capaces de causarle una situacin de estrs. Esta presencia determina la expresin de genes asociados con las enzimas catalizadoras de diferentes vas metablicas (Roberts & Shuler, 1997). Los elicitores se agrupan en dos clases: biticos y abiticos. Entre los elicitores biticos se encuentran micelios y componentes de la pared celular de hongos, polisacridos, glucanos, glucoprotenas y cidos orgnicos de bajo peso molecular. Los elicitores abiticos ms conocidos como agentes de estrs incluyen a la radiacin ultravioleta, las sales de metales pesados, los herbicidas y el estrs osmtico. Una de las ventajas de los tratamientos de elicitacin es que no se requiere la transferencia de la biomasa a un medio de produccin y que generalmente generan respuestas rpidas. La desventaja es que la produccin, en general, no es sostenible en el tiempo. Las clulas vegetales en cultivo in vitro pueden biotransformar un determinado sustrato en un producto deseable. Los compuestos qumicos que se transforman son variables e incluyen alcaloides, esteroides, cumarinas y terpenoides que pueden ser oxidados, reducidos, metilados, acetilados y/o esterificados, entre otras reacciones. Los productos no necesariamente tienen que ser los intermediarios naturales en el metabolismo vegetal. Las biotransformaciones por cultivo de tejidos vegetales son procesos comercialmente muy prometedores, pero lo costoso de algunos precursores limita su aplicacin. Resultan atractivos sobre todo si la transformacin no puede realizarse por sntesis qumica o por microrganismos.