Manual de Laboratorio de Inmunologia Practica No. 2 Toma de Muestra OBJETIVOS * Asistir a la conferencia “Métodos Actuales de! Manejo de Muestras’. * Practicar las diferentes metodologias de toma de muestra. INTRODUCCION La sangre es una forma especializada del tejido conjuntivo, compuesta por una sustancia intercelular liquida llamada plasma, en la cual se encuentran en suspensién los elementos figurados: hematies, leucocitos y plaquetas. La sangre circula a través de un sistema de tubos cerrados, denominados vasos sanguineos. En el adulto sano el volumen de la sangre es de 5 L y constituye aproximadamente el 8 % del peso corporal. Tiene un olor caracteristico y una densidad relativa que oscila entre 1,056 y 1,086. Una gran parte del plasma es agua, medio que facilita la circulacién de muchos factores indispensables que forman la sangre. Un milimetro clibico de sangre humana contiene unos cinco millones de corpusculos gidbulos ojos, llamados eritrocitos o hematies; entre 5.000 y 10,000 corpiisculos 0 glébulos blancos que reciben el nombre de leucocitos, y entre 200.000 y 300.000 plaquetas, denominadas trombocitos. La sangre también transporta muchas sales y sustancias organicas disueltas ' Funciones de la Sangre Respiracién: La sangre transporta oxigeno desde los pulmones hasta los tejidos y lleva CO, desde los tejidos a los pulmones. Nutricién: La sangre transporta los materiales alimenticios absorbidos. Excrecién: La sangre lleva los desechos metabilicos a rifiones, pulmones, piel ¢ intestino para su eliminacién. 4. La sangre interviene en el mantenimiento de! equilibrio Acido-basico normal del organismo. 5. Interviene en la regulacién del balance hidrico por los efectos que ella tiene sobre el recambio de agua que ocurre entre el compartimiento intravascular y el intersticial. 6. Interviene también en la regulacién de la temperatura corporal distribuyendo el calor en el organismo. Constituye uno de los mecanismos de defensa del organismo contra la infeccién por medio de los leucocitos y de los anticuerpos circulantes. on ~ 1Manual de Laboratorio de Inmunologfa 8. Contribuye a la regulacién del metabolismo, transporte de hormonas. 9. Transporta a los metabolites. FUNDAMENTO La postura ideal para la toma de muestra es mantener el brazo en posicién horizontal, de ha demostrado que existen incrementos significativos en varias determinaciones con respecto a la postura vertical, debido al aumento de presién de filtracién efectiva la cual aumenta cuando se cambia a la posicién vertical. Las venas mas comunmente utilizadas son las del area ante cubital, debido a su accesibilidad, facil manejo y comodidad para el paciente 2, 26% nT) Tpev Figura 1. Descripcién de los patrones venosos de la fosa cubital.? VC: vena cefalica; VB: vena basilica; VCA: vena cefalica accesoria; VIC: vena intermedia cefalica; VIB: vena intermedia basilica; VIA: vena intermedia del antebrazo; VICo: vena intermedia del codo; EPM: epicéndilo medial. MATERIAL + Tubos al vacio * Lanceta + Ligadura 12Manual de Laboratorio de Inmunologa Torundas con isopropanol al 70% Gasa seca Pipeta de transferencia Tubos Eppendorf Centrituga Aguia Soporte para tubo REACTIVOS * Isopropanol 70% METODOLOGIA Puncién venosa 1. Procure mostrar seguridad al paciente, de esta manera sera mas facil tomar la muestra. 2. Tome la aguja y rompa el sello de seguridad a la vista del paciente 3. Coloque la aguja en el sistema de tubos al vacio (Vacutainer) o bien en el caso de jeringa de plastico puede ser necesario no realizar este paso **En caso de utiizarse una jeringa debe de sacarle el aire y verificar que la aguja esté bien apretada** 5. Coloque el brazo que se va a puncionar apoyando en la mesa de trabajo formando un angulo 6. Ponga la ligadura, localice la vena de mejor grosor, haga asepsia correspondiente y destape la aguja colocando el bisel hacia arriba quedando en forma paralela a la vena. 7. Introduzea la aguja, cuando esté en vena, en el caso de tubos al vacio es en este momento cuando se introduce el tubo de vacio para obtener la muestra, en cambio en el caso de jeringa de plastico se debe de jalar el émbolo para aplicar la presién negativa. En ambos casos se debe de fijar la aguja, esto es para evitar movimientos de avance hacia dentro o fuera la vena. 8, Quite la ligadura y presente la torunda en donde se encuentra la aguja, saque ésta lentamente y aplique presién sobre el sitio de la puncién. 9. Retire y agite suavemente el tubo en caso de tubos al vacio. 10. Quite la aguja y en el caso de la jeringa introduzca la sangre por las paredes de tubo de ensaye. 11. Coloque su muestra en la centrifuga cuidando que tenga un tapén, asi como un contrapeso exacto, Centrifugue a 3500 rpm por 10 minutos, 12. Una vez centrifugada extraiga su muestra de la centrifuga y retire el suero (parte clara y superficial) con la ayuda de una pipeta Pasteur y deposite en un microtubo para muestras de SHT (Tubo Eppendorf de 1.5 mL). Tenga cuidado de hacerlo en un area cercana a la interfase de su muestra ya que esto puede contaminar su muestra con eritrocitos y demas células sanguineas. 13Manual de Laboratorio de Inmunologia 13, Para la extraccién de sangre de la mano se utiliza la aguja en mariposa o sistema alado pero la metodologia y cuidados son los mismos sélo que en esta se debe de tener en consideracién que el flujo sanguineo es menor y por esto tardardn en llenarse los tubos. ‘nyt a a Soles Sow eseremte Puncién capilar 1. Hacer asepsia en el dedo que se va a puncionar. 2. Abrir la lanceta por la parte superior. 3, Presionar el dedo y picar con fuerza una sola vez. 4. retirar la primera gota de sangre con una gasa seca. 5, Llenar el tubo capilar hasta % partes dando ligeros masajes al dedo puncionado sin tocar el sitio de puncién. BIBLIOGRAFIA * Sangre y tejido hematopoyético. (2007). Recuperado de: http:/www.sid.cu/galerias/pdfisitios/histologia/sangre_y_tejido_hematopoyetico.pdf 2 Beckton- Dickinson. Manual de capacitacién. (2012). Recuperado de: https://es. scribd. com/doc!248643142/Manual-de-Capacitacion-Beckton0001Toma- de-Muestra 3Giovanni E., Gémez O., Nifio M., Ramirez |., Zarate L. (2014). Distribucién de los Patrones Venosos de la Fosa Cubital en una Muestra de Personas Nacidas en el Departamento de Santander, Colombia. Int. J. Morphol. 32(1):221-226, http://dx.doi.org/10.4067/S07 17-95022014000100037 14oo Manual de Laboratorio de Inmunologia Practica No. 3 Fagocitosis: Reduccion de Nitroazul de Tetrazolio (Punci6on Capilar) OBJETIVO Determinar la capacidad fagocitica de las células como método de evaluacién de la respuesta inmune inespecifica. INTRODUCCION La fagocitosis representa la forma mas primitiva de defensa del huésped (respuesta inmune natural), en el cual una cantidad de células especializadas del organismo (leucocitos) ingieren y digieren a cuerpos extrafios para su nutricién o para ser eliminados, mediante la produccién de agentes quimicos y enzimaticos (microbicidas) Estas células fagociticas se encuentran en el interior de los vasos sanguineos y salen de ellos por diapédesis, siendo atraidas quimicamente hacia los focos inflamatorios. La fagocitosis es una categoria de endocitosis, por la cual las células (fagocitos) tienden a captar y comer agentes patégenos, fragmentos celulares y otros, mediante un mecanismo de adhesin y englobamiento formando asi el fagosoma para la posterior destruccién y finalmente la expulsién del microorganismo, Los fagocitos mas conocidos son los, neutréfilos, monocitos y macr6fagos, células que poseen receptores de reconocimiento de patron (PRR) 0 receptores de opsoninas como anticuerpos y proteinas conocidas como complemento. * En los organismos unicelulares como los protozoarios, la funcién fagocitica es el Gnico medio por el cual estos organismos adquieren su alimento, La funcién fagocitica de estas células se mejora a lo largo de la evolucién y se mantiene en los, animales mas evolucionados, aunque aqui la funcién de los fagocitos deja de ser preponderantemente nutricional para constituirse en un eficiente mecanismo de proteccién no especifico contra agentes infecciosos y de eliminacién de células muertas 0 seniles. Cada etapa del proceso fagocitico (ia migracién, el reconocimiento de lo que puede y debe ingerirse, la endocitosis y la destruccién de particulas) se descubre cada vez mas complicada; dia a dia se identifican mas componentes moleculares y se establecen mas interacciones y rutas metabdlicas. Aunque el proceso de la fagocitosis no esta esclarecido en su totalidad, ahora tenemos una mejor idea de cémo se reconocen las particulas que deben eliminarse y de los mecanismos subsecuentes que llevan a su destruccién 2. 15Manual de Laboratorio de Inmunologa FUNDAMENTO En la prueba del Nitroazul de Tetrazolio (NBT), los fagocitos se incuban con un microorganismo de prueba (usualmente levaduras) en presencia de NBT, y se examinan al microscopio para buscar el grado de endocitosis y de reduccién del NBT, por la formacién de un formazan de color azul dentro de las células, el NBT en presencia de O2 es reducido a formazan. Normalmente la mayoria de las células, (290%) son capaces de ingerir levaduras, sobre todo cuando éstas estan opsonizadas y la totalidad de las células que ingieren levaduras son capaces de reducir el NBT en condiciones “normales" o sanas °. MATERIALES Lanceta Portaobjetos REACTIVOS Sangre periférica Levaduras opsonizadas NBT Metanol Safranina METODOLOGIA 1 2 Por puncién con lanceta, poner en un portaobjetos, una gota de sangre periférica del paciente y en el otro extremo un testigo (paciente normal). Colocar los portaobjetos, en una camara hiimeda, incubar a 37 °C durante 15 minutos. Desfibrinar con una aguja, quitando la capa superior de cada una de las gotas de sangre y queda una capa inferior donde se encuentran los fagocitos. Lavar las preparaciones con solucién salina con cuidado que escurra lentamente en la tarja 16Manual de Laboratorio de Inmunologa 5. Colocar los portaobjetos en la cémara hiimeda y agregar 1 gota de NBT cubriendo la superficie de la preparacién, mas 1 gota de levaduras opsonizadas. Incubar a 37 °C durante 30 minutos, Lavar con solucién salina para quitar el exceso de NBT. Fijar con metanol por 1 minuto. Tefiir con safranina por 7 minutos. 0. Observar al microscopio y contar las células que reduzcan el NBT (granulos de formazan) y reportar en porcentaje de reduccién. BOOrne INTERPRETACION DE RESULTADOS Observar oélulas fagociticas endocitando levaduras y distinguir entre células que redujeron el NBT (levaduras azules en su interior) de aquellas que no lo hicieron (solo levaduras rojas en su interior). De las células que fagocitaron cuente y determine el porcentaje de células que redujeron el NBT, Reportar los resultados obtenidos ¢ Nhe Reduccién NBT Positiva — Reduccién NBT negativa 17Manual de Laboratorio de Inmunologa [| Resultados © ‘| No. total No. de células No. de células canoe alin, | Saneieiuas || sereaeene contadas | _(fagosoma) (Fagolisosoma) 2 3 4 5 6 7 8 9 10 BIBLIOGRAFIA. + Machaca, N. (2011). Fagocitosis. Rev. Act. Clin. Med v.13 La Paz oct. 2011 2 Espinoza, O. (2004), Fagocitosis: Mecanismos y consecuencias. Volumen 29 No. Abril-Junio 2004. pp 55-67. 2 Rojas, O. (2010). Fagocitosis, Evaluacién estallido respiratorio. UNAM. 4 Rodriguez, C. (2010). Evaluacién del funcionamiento de células fagociticas. Manual de Inmunologia, 3era edicién, p: 213-243. 18Manual de Laboratorio de Inmunologa Practica No. 4 Demostracion de Organos Linfoides OBJETIVO \dentificar los érganos infoides y las diferentes células que intervienen en la respuesta inmune utilizando modelos animales. INTRODUCCION En la respuesta inmune participan células y moléculas distribuidas por todo el organismo, tanto en la circulacién como en los diversos tejidos del organismo. Sin embargo, grupos de células inmunocompetentes conforman tejidos especializados del sistema inmune, los que a su vez se integran como érganos linfoides. Se dividen funcionalmente en dos tipos, primarios 0 centrales que incluye timo y Médula ésea, y secundarios o periféricos que incluyen bazo, ganglio linfatico y tejido linfoide asociado. Timo: Es un érgano bilobulado, situado en la parte anterior del térax. Cada Idbulo se divide por trabéculas de tejido conjuntivo en pequefios Idbulos constituidos por varias zonas. En la corteza se encuentran células epiteliales también llamadas nodriza (nurse) que interaccionan con los timocitos proporciondndoles, al igual que los otros tres tipos de células epiteliales, hormonas timicas (timosina, timopoyetina, factor timico sérico) que les ayudan a madurar. Desde /a corteza hasta la médula existe un gradiente de diferenciacién. El timo de los mamiferos va involucionando con la edad, a partir de la pubertad Médula ésea: En este organo se generan las células troncales hematopoyéticas (stem cells) o células madre, origen de todas las células sanguineas. En la vida fetal emergen inicialmente de! saco embrionario y posteriormente del higado y del bazo; al nacimiento, la médula ésea se convierte en el principal centro hematopoyético. Si la demanda de células es muy grande o hay dafio medular, se perfilan como auxiliares en la hematopoyesis, el higado y el bazo Ganglios linfaticos: El ganglio forma parte del sistema linfatico que filtra por zonas los antigenos procedentes del liquide intersticial y de la linfa. Los antigenos libres 0 las células portadoras de los antigenos pueden penetrar al ganglio por los ductos denominados vasos linfaticos aferentes, para establecer contacto con los linfocitos ubicados en él. Los linfocitos sanguineos llegan al ganglio principalmente por via hematégena a través de vénulas Bazo: Es un érgano situado en el hipocondrio izquierdo con un peso aproximado de 150 g. Tiene dos tipos de tejidos, el que corresponde a la pulpa blanca esta constituido por una arteriola central cubierta con una vaina de tejido linfoide periarteriolar, los linfocitos T se encuentran alrededor del vaso sanguineo y las 19Manual de Laboratorio de Inmunologa células B confluyen y forman foliculos primarios. En el sitio de transicién entre ambas zonas hay un gran ntimero de macréfagos que presentan antigenos a los linfocitos y fagocitan células deterioradas, principalmente eritrocitos. La otra zona del bazo denominada pulpa roja esta integrada por sinusoides vasculares que finalmente conectan con la vena esplénica *. MATERIALES Guantes Equipo de diseccién Cajas Petri Embolo de jeringa Pipetas Pasteur Alfleres REACTIVOS + Anestesia * Solucién salina fisiolégica + Hemocolorantes 1. Solucién fijadora (Metanol) 2. Hemocolorante dcido (eosina) 3. Hemocolorante basico (hematoxilina) METODOLOGIA 1. Aplicar la anestesia indicada por via intraperitoneal. 3. Tomar al ratén de la cabeza y tirar fuertemente de la cola, sosteniendo con la otra mano la base de las orejas, con el fin de desnucarlo. 4. Colocarlo boca arriba en la plataforma y asegurar las patas en cada extremo, con la ayuda de alfiles. 5, Hacer un corte, en forma de botén, en la parte ventral del cuello a la altura de las. extremidades superiores y se hace el corte longitudinal (del cuello a la base de la cola). 6. Cortar con las tijeras por el borde del térax, las costillas y extraer los érganos linfoides con pinzas y depositarlos en la caja petri (que contiene solucién salina) para su observacién. (ver figura 1) 7. Macerar los érganos con el émbolo de la jeringa 20Manual de Laboratorio de Inmunologia Figura 1. Distribucién anatémica de los érganos linfoides en el ratén, Completar la siguiente tabla: Numero ‘Organo linfoide Primario | Secundario Bazo Jeo] ~] 5] on] }eo] no] > 8. Cortar una de las patas traseras del animal y retirar el tejido adherido al hueso. 9. Inyectar solucién salina por uno de los extremos y recibir el contenido en un portaobjetos (Figura 2) 21Manual de Laboratorio de Inmunologa Figura 2. Obtencién de células de médula ésea. 10. Realizar un frotis haciendo una extensién* sobre un portaobjetos tanto de sangre como de cada uno de los érganos a analizar (figura 3). Marcar los portaobjetos. * La extensién ideal comprende una porcién gruesa y una delgada, con una transicién gradual entre ambas; su aspecto ha de ser liso y nivelado, sin ondulaciones, resaltes, ni poros. Figura 3. Frotis sanguineo 11, Dejar secar al aire todos los frotis. 22Manual de Laboratorio de Inmunologa TINCION RAPIDA CON HEMOCOLORANTE 1. Sumergir el frotis en la solucién fijadora 5 veces durante 1 segundo cada vez, dejar escurrir el exceso. 2. Sumergir el frotis en el hemocolorante UNO, 5 veces durante 1 segundo cada vez, dejar escurrir el exceso. 3. Sumergir el frotis en el hemocolorante DOS, 5 veces durante 1 segundo cada vez, dejar escurrir el exceso. 4. Lavar con agua destilada y dejar secar. 5. Observar al microscopio. INTERPRETACION DE RESULTADOS Los eritrocitos se observan rosa salmén, Los niicleos de los neutréfilos son purpura, sus grdnulos son lila marrén y el citoplasma incoloro o rosa palido. Los eosinéfilos tienen niicleo violeta; con granulos rojo a naranja y citoplasma azul. Los baséfilos tienen un nicleo purpura 0 azul oscuro, con grénulos purpura oscuro (casi negro). Los linfocitos tienen un nticleo purpura oscura y citoplasma azul. Los monocitos tienen nucleo purpura y citoplasma azul-gris. Las plaquetas tienen coloracién violeta © purpura. BIBLIOGRAFIA ‘Vega, G. (2009). Organos linfoides. Rev Fac Med UNAM Vol. 52 No. 5 Septiembre- Octubre. 2 Gradwohl S. y Jarett. (1986). Métodos y diagnésticos del Laboratorio Clinico. Ed. Méd. Panam. 8a. Ed 2 Vives J.L., Aguilar J.L. (1992) Manual de Técnicas de Laboratorio en Hematologia. Ed. Masson-Salvat Med. DOF. (2001). NORMA Oficial Mexicana NOM-062-Z00-1999, Especificaciones técnicas para la produccién, cuidado y uso de los animales de laboratorio. 23