1er Manual de laboratorio de Microbiología Oral.

Con énfasis en competencias.

Elaborado por.
Alexander Salazar-Ceballos. 2021.
 Programación de actividades del laboratorio de Microbiología Oral.
Elaborado por: Alexander Salazar-Ceballos - 2019

Semana Tema Material a traer y consultar por los Material disponible en el

estudiantes laboratorio de la U
1 Introducción a la bioseguridad en Consultar: 1. Microscopios
laboratorio. Laboratorio de
microscopía. Cálculo del poder de Numerical Aperture [Internet].
resolución Nikon’s MicroscopyU. 2010
[cited 2020 Aug 19]. Available
from: https://www.microsco-
pyu.com/microscopy-ba-
sics/numerical-aperture

What is the Resolving Power? |

Learn about Microscope |
Olympus [Internet]. Olympus-
ims.com. 2020 [cited 2020
Aug 19]. Available from:
https://www.olympus-
ims.com/en/micro-
scope/terms/resolving_power/

2 Observación de microorganismos Microscopios, láminas teñidas de

en fresco. Observación de
microorganismos tinción de
Gram. Reporte del laboratorio
3 Fermentación. Utilizar harina de
pan y levadura para fermentar.
bacterias (cocos y bacilos) gram de
gram positivas y gram negativos.
Portaobjetos y cubreobjetos, agua
destilada. Colorantes de la tinción
de gram, medios de cultivos con
bacterias gram de gram positivas y
gram negativos.
Video del profesor Alexander Salazar- Parrilla eléctrica
Ceballos futuroal2030. Panadería
Molecular: Saludable, Sostenible y
Sabrosa [Internet]. YouTube. 2020 [cited
2020 Aug 19]. Available from:
https://www.youtube.com/watch?v=S8C_
yoRoKr4&fbclid=IwAR0UKw_ftTfFGru
QK7AUzea6dIKDRcAM1jR_9GXolQrD
9iROvqyn6RiclvY

Materiales: harina de pan, levadura

fresca, envase de plástico, azúcar,
agua,
cuchara de madera, parafilm o paño

Video tutorial de YouTube:La

fermentación de la levadura
https://www.youtube.com/watch?v=V
XhrrHDbTFc

4 pH: medición pH en diferentes pH metro, agua destilada

bebidas con papel de pH ¿Cómo hacer un detector de pH
preparado por los estudiantes casero? 1.
https://www.youtube.com/watch?v=z

5 Taller-laboratorio 1er seguimiento
6 Preparación y observación de
medios de cultivo. Aislamiento de
microorganismos en medios
cultivos. Pruebas bioquímicas.
7 Taller de comprensión y lectura
de los casos clínicos
8 Caso clínico de VIH y diagnóstico
clínico e inmunológico
9 Casos clínicos. Herpes virus.
PVH
10 Taller-laboratorio 2do seguimiento
11 Casos clínicos.
Candidiasis + VIH.
Tríada de Axell de la candidiasis
12 Taller de infografías de la tríada de
Axell de candidiasis
13 Casos clínicos con Correlación entre
periodontitis y enfermedades
sistémicas
14 Casos clínicos con Correlación entre
periodontitis y enfermedades
sistémicas
15 Taller de infografías y correlación
entre periodontitis y enfermedades
sistémicas
16 Taller-laboratorio final de infografías
17 Examen teórico
OFhzWBvD5s
2.
https://www.youtube.com/watch?v=Q
neeMMEjcvw
3. Leer el artículo de referencia: Effect
of Various Sugary Beverages on
Salivary pH, Flow Rate, and Oral
Clearance Rate amongst Adults.
Scientifica
Volume 2016, Article ID 5027283, 6
pages.
https://www.youtube.com/watch?v=tk Diferentes medios de cultivo. Serie
GpcdBH9N0 de pruebas realizadas y para hacer
práctica
Se hace lectura de un caso modelo
Rúbrica de lectura de los casos clínicos
elaborada por el docente
Documentos suministrados por el
profesor en las clases teóricas.
Documentos suministrados por el
profesor en las clases teóricas.
Casos clínicos. Candidiasis. Práctica Medios de cultivo con mohos
de mohos y ¿levaduras?
Documentos suministrados por el
profesor en las clases teóricas.
Documentos suministrados por el
profesor en las clases teóricas.
Documentos suministrados por el
profesor en las clases teóricas.
Documentos suministrados por el
profesor en las clases teóricas.
 Rúbrica de competencias para comprender la formación de la caries

Nivel de habilidades
Tema Nivel 1 Nivel 2: Recordar Nivel 3: Comprensión Nivel 4: Análisis
Ecología de la No tiene claro el concepto Define el rango de pH Comprende que el pH Relaciona el pH aćido con la
cavidad oral de pH ni sus variaciones. salivar normal. salivar varía con los caries.
No define que es un pH alimentos.
ácido ni básico Define los factores Comprende que la fermentación
involucrados en la tríada Comprende que la de los azúcares favorece el pH
de la enfermedad: del saliva amortigua las ácido y por consiguiente la
microorganismo, del variaciones del pH. formación de la caries
hospedador y factores
medioambiente oral.

Streptococcus No relaciona S. mutans con Define que el S. mutans Comprende que el S. Analiza la interacción entre el
mutans, principal caries. es un coco gram positivo. mutans es el principal receptor gp340 en el diente y el
causante de la agente patógeno ligando AgI/II en el S. mutans
caries No define que es una causante de la caries.
bacteria acidúrica. Comprende que la fermentación
Define que es una Comprende que el pH de la sacarosa por la
No define que es una bacteria acidúrica. crítico de 5,5 (pH Glucosiltransferasa conlleva a la
bacteria acidogénica ácido) es el nivel en el formación de glucanos y estos
Define que es una cual se inicia la son puentes de unión entre los
bacteria acidogénica desmineralización del S.mutans.
diente.
Comprende que la fermentación
La caries dental es una de la sacarosa por la
enfermedad multi- Fructosiltransferasa forma
factorial. fructanos los cuales sirven como
reserva de energía
 1er laboratorio:
Bioseguridad.
Partes del microscopio.
Poder de resolución y apertura numérica.

1a.Normas de bioseguridad
1b.Tamaño de los microorganismos y observación al microscopio (videos) (Actualización
marzo 2021)
1c. Partes del microscopio

1ª.
1b: https://www.youtube.com/watch?v=h0xTKxbIElU Tamaño de microorganismos
https://www.youtube.com/watch?v=nfdwt_6b4Qs Observación de microorganismos en fresco

https://www.youtube.com/watch?v=8H1Bp4jkc74 Observación con aceite de inmersión

https://www.youtube.com/watch?v=_a7b3EzY8GM Cálculo del poder de resolución

https://www.youtube.com/watch?v=U0xMLUUc1e4 Objetivos del microscopio

1c.
Objetivo de aprendizaje: Comprender el poder de resolución y la apertura
numérica del microscopio de luz, aplicando la fórmula de Reyleigh en cada
objetivo de acuerdo a su poder de aumento
Conceptos y aplicaciones:

1. ¿Qué es poder de resolución?

2. ¿Cuál es la medida más utilizada en microscopía de luz?
3. ¿Cómo se calcula el poder de resolución?
4. ¿Cuál es el poder de resolución del microscopio de luz? Es de 0.2 um
5. ¿Cómo es la fórmula de Reyleigh?
6. ¿Cómo se calcula la apertura numérica?
7. ¿Cómo utilizar las ayudas online, la simulación, para observar la apertura
numérica en cada objetivo?

1c. Poder de resolución: es la capacidad de un microscopio de distinguir dos puntos

distintos y adyacentes.
 Medidas en microscopía

Resolving power. Olympus.

https://www.olympus-ims.com/en/microscope/terms/resolving_power/

El poder de resolución está dado por la fórmula de Reyleigh:

𝜆
𝑅 = 0,61
𝐴𝑁
R = Fórmula de Reyleigh
0,61
λ= lambda= 0.55 um para la luz visible . Nota: esto lo deben consultar los estudiantes
AN= Apertura numérica

1c. Apertura numérica: la apertura numérica del objetivo de un microscopio es la cantidad

de luz que es captada y que permite visualizar con detalle el objeto a observar.
Numerical Aperture. Nikon. MicroscopyU
https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/numerical-aperture

Fórmula : 𝐴𝑁 = 𝑛 × 𝑠𝑒𝑛𝛼

AN= apertura numérica

n = es el índice de refracción (IR). El IR del aire es de 1, el IR del aceite de inmersión es de
1,5.
sen α = sen Θ = es la mitad del ángulo del cono de luz

En este link https://www.microscopyu.com/microscopy-basics/numerical-aperture

observa la AN a diferentes valores de α.
Tutorial: Immersion oil – Refractive index.
https://www.olympus-lifescience.com/en/microscope-
resource/primer/java/microscopy/immersion/
 Imagen tomada de Numerical aperture and resolution. http://zeiss-
campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/resolution.html

Figure 1(a) is a simple microscope system consisting of an objective and specimen

being illuminated by a collimated light beam, which would be the case if no condenser
 was used. Light diffracted by the specimen is presented as an inverted cone of half-
angle (α), which represents the limits of light that can enter the objective. In order to
increase the effective aperture and resolving power of the microscope, a condenser
(Figure 1(b)) is added to generate a ray cone on the illumination side of the specimen.
This enables the objective to gather light rays that are the result of larger diffraction
angles, increasing the resolution of the microscope system. The sum of the aperture
angles of the objective and the condenser is referred to as the working aperture. If the
condenser aperture angle matches the objective, maximum resolution is obtained.

One way of increasing the optical resolving power of the microscope is to use
immersion liquids between the front lens of the objective and the cover slip. Most
objectives in the magnification range between 60x and 100x (and higher) are designed
for use with immersion oil. Good results have been obtained with oil that has a
refractive index of n = 1.51, which has been precisely matched to the refractive index of
glass. All reflections on the path from the object to the objective are eliminated in this
way. If this trick were not used, reflection would always cause a loss of light in the
cover slip or on the front lens in the case of large angles (Figure 2).

Imagen tomada de Numerical aperture and resolution. http://zeiss-

campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/resolution.html

Resolution for Selected Objectives

 d0 D0
Objective/NA n
(μm) (μm)
0.5x / 0.15 2.2 11.2 1786
10x / 0.30 1.1 11.2 1786
20x / 0.50 0.7 13.4 1493
40x / 0.75 0.45 17.9 1117
40x / 1.30 (oil) 0.26 10.3 1942
63x / 1.40 (oil) 0.24 15.1 1325
100x / 1.30 (oil) 0.26 25.8 775
 2do laboratorio : Observación de microorganismos en fresco y en tinción de Gram

Objetivo de aprendizaje:

Comprender los principios bioquímicos de la diferenciación de las bacterias a la tinción de Gram en

Gram positivas y Gram negativas.

Actividades:

Recordar el nombre científico de los microorganismos

Presentación de imágenes de microorganismos a la tinción de Gram (del CDC):

Observar microorganismos en fresco. Vídeo de YouTube: Andrea Gómez Montoya. Observación al microscopio: muestra en
fresco [Internet]. YouTube. 2017 [cited 2020 Aug 31]. Available from: https://www.youtube.com/watch?v=KcsbflXvnU8

Neural Academy. GRAM POSITIVE VS GRAM NEGATIVE BACTERIA [Internet]. YouTube. 2019
[cited 2021 Mar 13]. Available from: https://www.youtube.com/watch?v=Didrc3wJ3E8

Observar microorganismos a la tinción de Gram. Vídeo de YouTube: SAVUNISEVILLA. Prácticas de Microbiología. Tinción de
Gram. Vídeo 1 [Internet]. YouTube. 2014 [cited 2020 Aug 31]. Available from:
https://www.youtube.com/watch?v=FceD8FFhuew

Dr.G Bhanu Prakash Animated Medical Videos. Gram Staining Procedure Animation Microbiology -
Principle, Procedure, Interpretation [Internet]. YouTube. 2019 [cited 2021 Mar 13]. Available from:
https://www.youtube.com/watch?v=AZS2wb7pMo4

Resolver la siguiente pregunta problema: ¿Cuál es el mecanismo de acción del alcohol-acetona en la

pared celular de las bacterias durante la tinción de Gram?

Link de tinción de Gram y explicación del mecanismo de acción: 1.

Gram Staining [Internet]. Microscopy. 2021 [cited 2021 Mar 13]. Available from: https://serc.car-
leton.edu/microbelife/research_methods/microscopy/gramstain.html#:~:text=Gram%20stain-
ing%20is%20a%20common,these%20cells%20red%20or%20violet.

A decolorizer such as ethyl alcohol or acetone is added to the sample, which dehy-
drates the peptidoglycan layer, shrinking and tightening it. The large crystal violet-
iodine complex is not able to penetrate this tightened peptidoglycan layer, and is
thus trapped in the cell in Gram positive bacteria. Conversely, the the outer mem-
brane of Gram negative bacteria is degraded and the thinner peptidoglycan layer of
Gram negative cells is unable to retain the crystal violet-iodine complex and the
color is lost.
3er laboratorio: Fermentación de carbohidratos. Práctica de amasar harina.
Objetivo de aprendizaje y sus competencias (entendidas como habilidades):

Comprender que la fermentación (ausencia de oxígeno) de los carbohidratos (principalmente

el azúcar presente en los alimentos y bebidas gaseosas) es la principal responsable de la
producción de la caries dental; esta comprensión o habilidad se hará evidente durante la
actividad de amasar la harina con el azúcar refinado y la levadura. Ahora, en la cavidad oral,
el proceso de fermentación de los carbohidratos es principalmente realizado por la bacteria
Streptococcus mutans, principal causante de la caries dental. Recuerda que las bacterias no
tienen mitocondrias ¿Y esto que quiere decir en este contexto del párrafo?

Debes comprender la relación entre la producción de ácidos, principalmente ácido láctico,

derivado de la fermentación de los carbohidratos, y que estos generan un medio ambiente
ácido el cual conlleva a la desmineralización del esmalte dental, originando la caries dental.

Video del profesor Alexander Salazar-Ceballos: 1.

futuroal2030. Panadería Molecular: Saludable, Sostenible y Sabrosa [Internet]. YouTube. 2020 [cited
2020 Aug 19]. Available from: https://www.youtube.com/watch?v=S8C_yoRoKr4&t=2s

Editor de video gratuito:

https://www.openshot.org/es/
Terminología:
Acidogénico: productor de ácido
Acidúrico: tolerante al ácido

Materiales a traer por los estudiantes:

1. Harina de trigo
2. Levadura (Levapan u otra)
3. Azúcar
4. Bowl (recipiente de plástico curvo para amasar la harina)
5. Parafilm (para envolver la masa)

Procedimiento:
1. En un beaker de 50 ml, colocar cerca de 20 ml de agua y calentar brevemente por 30
segundos en el microondas.
2. Al agua previamente calentada (tibia) adicionar una cantidad de levadura, revolver y
dejar incubar por aproximadamente 5 minutos, esto es la semilla para fermentar.
3. Luego adicionar la harina en el bowl e ir adicionando suavemente la semilla (agua con
levadura) previamente calentada, e ir mezclando con la mano.
4. La técnica es alcanzar que la masa no sea pegajosa y permita amasar: como un
artesano o artesana del pan.
5. La clave es adicionar suavemente el agua que contiene la semilla de la levadura.
6. Envolver en el parafilm, e ir observando cada media hora aproximadamente.
7. Registrar los datos cada tiempo de observación.

Reporte de resultados:
1. ¿Qué se observó en el tiempo 0 (t0)?
2. ¿Qué se observó en cada uno de los tiempos siguientes = t1, t2, t3, etc...?
 3. ¿Por qué se presentó la fermentación?
4. ¿Cómo se relaciona este proceso de la fermentación con la producción de la caries?
Ver el siguiente gráfico:

Gráfico tomado de: Miki Kawada-Matsuo M, Oogai Y, Komatsuzawa H. Sugar Allocation to

Metabolic Pathways is Tightly Regulated and Affects the Virulence of Streptococcus mutans.
Genes; 2017, 8(1), 11; https://doi.org/10.3390/genes8010011. https://www.mdpi.com/2073-
4425/8/1/11
Gráfico tomado de: Dragana Ajdić et al. Genome sequence of Streptococcus mutans UA159, a
cariogenic dental pathogen. PNAS. October 29, 2002 ; 99 (22) 14434-14439;
https://doi.org/10.1073/pnas.172501299
 4to laboratorio: Medición del pH

Competencia:

Comprender que el pH ácido, generado por la fermentación de los azúcares presentes en los
alimentos y bebidas gaseosas, es el principal responsable de la desmineralización de los
dientes, y por consiguiente este pH ácido es aprovechado por la bacteria Streptococcus
mutans para producir la caries dental.

Procedimientos preliminares:

Los estudiantes previamente deberán hacer un detecto de pH casero a partir del repollo
morado. Se sugiere observar los siguientes videos en YouTube:

¿Cómo hacer un detector de pH casero?

1. https://www.youtube.com/watch?v=zOFhzWBvD5s
2. https://www.youtube.com/watch?v=QneeMMEjcvw

Leer previamente el artículo de referencia:

Effect of Various Sugary Beverages on Salivary pH, Flow Rate, and Oral Clearance Rate
amongst Adults. Scientifica Volume 2016, Article ID 5027283, 6 pages.
https://www.hindawi.com/journals/scientifica/2016/5027283/
En este artículo el pH de la saliva oral se midió con un pH-metro de laboratorio. Pero la
lectura con el detector de pH casero no es muy sensible.

Comprender la curva de Stephan : ¿Cuál es el pH crítico de la cavidad oral para iniciar

el proceso de desmineralización? Referencia bibliográfica: Salud dental: relación entre
la caries dental y el consumo de alimentos. (ver gráfico 1) Link:
http://scielo.isciii.es/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0212-16112013001000008 )

Materiales a traer por lo estudiantes:

Agua
Agua con limón
Gaseosa sabor cola
Café
Leche
Saliva : recolectarla en clase en un recipiente plástico

Procedimiento en el laboratorio:

Leer el pH de cada líquido y anotarlo en el cuaderno de reportes de laboratorio.

La imagen siguiente es el color que adquiere la tira de detección de pH realizada con el repollo
morado (red cabbage) (Tomado de : https://thewiseprepper.com/ph-meters-a-brief-guide/

Red Cabbage pH Indicator Colors

(tomado de https://www.thoughtco.com/making-red-cabbage-ph-indicator-603650)

pH 2 4 6 8 10 12
Color Red Purple Violet Blue Blue-Green Greenish Yellow

Introduction to the Cabbage pH Indicator

Red cabbage contains a pigment molecule called flavin (an anthocyanin). This water-soluble pigment is
also found in apple skin, plums, poppies, cornflowers, and grapes. Very acidic solutions will turn
anthocyanin a red color. Neutral solutions result in a purplish color. Basic solutions appear in greenish-
yellow. Therefore, it is possible to determine the pH of a solution based on the color it turns the
anthocyanin pigments in red cabbage juice. The color of the juice changes in response to changes in its
hydrogen ion concentration. pH is the -log[H+]. Acids will donate hydrogen ions in an aqueous solution
and have a low pH (pH 7).
Ahora ¿Cuál es el pH de los alimentos que consumes? Imagen tomada de
https://www.littlethings.com/ph-levels-of-food/ ¿Cambiarías tus hábitos alimenticios? = Piensa en tu
salud oral y en la de tus pacientes.
 5to laboratorio: Preparación de medios de cultivo y aislamiento de microorganismos.

Competencia:
Comprender los componentes nutricionales de los medios de cultivo y el aislamiento de
microorganismos de diferentes fuentes.

Del libro = 50 experimentos con microorganismos, las prácticas 9 y 10.

Presentar reporte de resultados:

 6to laboratorio: Prueba de sensibilidad y resistencia

Competencia: Comprender que los microorganismos pueden sobrevivir (resistencia) o morir

(sensibilidad) a diversos componentes del medio ambiente que los rodea

Del libro = 50 experimentos con microorganismos, las prácticas 9 y 10.

Presentar reporte de resultados:

 7o laboratorio. GUÍA DE LECTURA DE UN CASO CLÍNICO.
(Guía para enfermedades infecciosas en cavida oral).

Competencia: Comprender la estructura genérica de un caso clínico publicado en revistas

científicas

Caso clínico modelo: Oral Candidiasis: Aiding in the Diagnosis of HIV—ACase Report
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3335721/

Datos del paciente:

1. ¿Cuál es el sexo del paciente?

2. ¿Cuál es la edad del paciente?
3. ¿De dónde procede el paciente? ¿Ciudad, país, etc.?
4. ¿Cuál fue el motivo de consulta? Relatar los síntomas
5. ¿Cuál es el tiempo de evolución? Días, meses...
6. ¿Cuáles antecedentes presenta-relata el paciente? Antecedentes de comportamiento
como: la frecuencia de fumar, beber, etc...

Examen extraoral e intraoral:

7. ¿Qué características clínicas se observan al examen extraoral?

8. ¿Qué características clínicas se observan al examen intraoral?
9. ¿Qué características clínicas se observan en las fotos?
10. ¿Cuál es el diagnóstico clínico presuntivo?

Interpretación de exámenes de laboratorio y complementarios:

11. ¿Qué pruebas complementarias (RX, TAC,...) se realizaron y cuáles fueron los
resultados y su interpretación?
12. ¿Puede mencionar con qué microorganismos se debe hacer diagnóstico diferencial?
13. ¿Cuál es el diagnóstico confirmatorio?
14. ¿Cómo evolucionó el paciente al tratamiento?

Inglés técnico

15. ¿Cómo está su inglés técnico en la lectura de estos casos? No envíe el artículos a los
robots-traductores, es por su bien; ellos también hacen sus “jugadas”.

Bibliografía...muy recomendada:

Salazar Ceballos A, Alvarez Miño L. Manual de Sometimiento a publicación de casos clínicos

y estudios transversales. Editorial UniMagdalena. 2012. Colombia. ISBN 978-958-746-052-0.
Código biblioteca Unimagdalena: 616.02/S161 (26 ejemplares)
 8o laboratorio. LECTURAS DE CASOS CLÍNICOS.

Competencias en el diagnóstico de VIH:

El estudiante deberá comprender el algoritmo de diagnóstico (pacientes mayores de 13 años)
por laboratorio de un paciente con VIH, a partir del Protocolo de Vigilancia en Salud Pública de
VIH (Disponible en la página 22: https://www.ins.gov.co/buscador-
eventos/Informacin%20de%20laboratorio/Gu%C3%Ada%20Vigilancia%20por%20laboratorio
%20VIH.pdf).
Interpretar adecuadamente la tabla de clasificación clínico-inmunológica de VIH/SIDA para
conocer y diferenciar el estado de un paciente en las fases de VIH o SIDA (Disponible en la
página 7 : https://www.ins.gov.co/buscador-
eventos/Lineamientos/PRO%20VIH%20sida_.pdf).
Re-leer el caso clínico modelo: Oral Candidiasis: Aiding in the Diagnosis of HIV—ACase
Report, a partir de estas nuevas competencias adquiridas.

Competencias en la interpretación de los casos clínicos:

El estudiante deberá correlacionar los síntomas presentados por el paciente con las pruebas
de laboratorio y las ayudas diagnósticas.
Comprender como los síntomas y las ayudas diagnósticas condujeron al diagnóstico
presuntivo y/o confirmatorio.

Caso clínicos a interpretar: favor analizar cada caso siguiendo la guía de lectura del
caso clínico del laboratorio anterior.

VIH y candidiasis: Oral Candidiasis: Aiding in the Diagnosis of HIV—ACase Report

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3335721/

¿Cuál era la clasificación inmunológica del paciente?

¿Qué es un evento centinela?

Otros casos clínicos:

Herpes zoster of the trigeminal nerve: a case report and review of the literature.
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15041920

Squamous papilloma: A report of two cases with review of literature

http://www.jiaomr.in/article.asp?issn=0972-
1363;year=2016;volume=28;issue=1;spage=102;epage=104;aulast=Singh

Recalcitrant oral squamous cell papilloma lesions in two HIV-infected patients

successfully treated with topical imiquimod
https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4410887/

Fascitis necrotizante de origen dental

http://www.scielo.org.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0120-971X2017000100007