Universidad del Valle de México Escuela de Ciencias de la Salud

Práctica 1. Inhibición de la actividad enzimática de la catalasa obtenida de fuentes

naturales.
Integrantes: Altamirano Lopez Mariana, Ortiz Magallanes Nikole, Velarde Babun
Andrea, Yamil Hassan Guerrero Ríos, Luna Mendoza Rocío Ixchel.
Asignatura: Biotecnología farmacéutica.
Licenciatura QFBT
Periodo 2023-1
Fecha de entrega: 22 de Febrero de 2023.
Docente: Quezada Romero Rene.

Resumen
La catalasa es una enzima antioxidante presente en la mayoría de los organismos aerobios. Cataliza la
dismutación del peróxido de hidrógeno (H2O2) en agua y oxígeno. En esta práctica se realizó la
extracción de la catalasa del apio, con el fin de inhibir la actividad enzimática de la misma por medio
del uso como indicar al KMnO4 para poder reducir la reacción, así mismo, se adicionó H2SO4 para
poder detener la reacción ya que este compuesto tiende a degradar a la enzima por medio de de la
alteración del sitio activo, mientras que, con el KCN inhibió la actividad de la enzima ya que este el
cianuro meramente tiene afinidad por el ión metálico. Por otro lado, se obtuvo como resultado que
mientras menos concentrada estuviese la solución, menor era el gasto de volumen KMnO4.

Palabras clave: Actividad enzimática, Catalasa, Cianuro de Potasio, Degradación, Inhibición.

Introducción nivel celular se localiza en las mitocondrias y

La catalasa (peróxido de hidrógeno
oxidorreductasa) es una de las enzimas más
abundantes en la naturaleza y se encuentra
ampliamente distribuida en el organismo
humano, aunque su actividad varía en
dependencia del tejido; ésta resulta más
elevada en el hígado y los riñones, más baja en
el tejido conectivo y los epitelios, y
prácticamente nula en el tejido nervioso. A
los peroxisomas, excepto en los eritrocitos,
donde se encuentra en el citosol.
La catalasa ha sido ampliamente estudiada en
relación con su participación en numerosos
procesos patológicos de gran importancia en
las investigaciones biomédicas, y está
involucrada tanto en la génesis como en las
consecuencias de dichos procesos. (Miranda,
Hernández, & Janer, 1996)
Universidad del Valle de México
Las especies de oxígeno reactivas como el
radical superóxido, el radical hidroxilo y el
peróxido de hidrógeno (H2O2) se forman
durante la reducción del dioxígeno en agua.
Estas especies pueden dañar las proteínas, los
lípidos y los ácidos nucleicos, por lo que se
requieren sistemas antioxidantes eficientes,
entre los que se incluyen ciertas enzimas. El
peróxido de hidrógeno se forma por la
dismutación del radical superóxido y también
en la reacción de algunas oxidasas.
Hay varias enzimas capaces de degradar el
peróxido de hidrógeno: las catalasas, las
peroxidasas y las peroxirredoxinas. Las
peroxidasas eliminan el H2O2 usándolo para
oxidar otros sustratos. A diferencia de las otras
enzimas, que requieren de un sustrato
reducido, las catalasas dismutan el peróxido de
hidrógeno.
Las catalasas catalizan la dismutación del
peróxido de hidrógeno en agua y dioxígeno
evitando así que se forme el radical hidroxilo y
el oxígeno singulete, especies de oxígeno que
son muy reactivas. En el hombre, la catalasa
protege la hemoglobina del peróxido de
hidrógeno que se genera en los eritrocitos.
También tiene un papel de protección en la
inflamación, en la prevención de mutaciones,
evita el envejecimiento y cierto tipo de cáncer.
(Díaz, 2003)
Función enzimática
La CAT como parte del sistema antioxidante
está involucrada en la destrucción del H2O2
generado durante el metabolismo celular. Esta
enzima se caracteriza por su alta capacidad de
reacción pero relativamente poca afinidad por
el sustrato. Presenta 2 funciones: la catalítica y
la peroxidativa. Ambas se pueden representar
por la ecuación:
H2O2 + H2R ----------® 2H2O + R
sustrato donador CAT
La reacción general entraña la reducción del
sustrato tomando los átomos de hidrógeno
aportados por el donador, y los productos
finales serían el sustrato reducido y el donador
oxidado.
Escuela de Ciencias de la Salud
En la función catalítica, el donador es otra
molécula de H2O2. Esta función sólo puede
ser realizada por la enzima en su forma
tetramérica.
H2O2 + H2O2 -----® 2H2O + +O2
En la reacción peroxidativa la enzima puede
utilizar como donadores de hidrógeno al
metanol, etanol, ácido fórmico, fenol y
formaldehído. Esta función se puede realizar
con monómeros, dímeros y tetrámeros.
La actividad de la CAT puede ser inhibida por
el cianuro, la azida, el sulfuro, la
hidroxilamina, el paracetamol, la bleomicina,
la adriamicina, la benzidina y el paraquat.
(Miranda, Hernández, & Janer, 1996)
Función de la catalasa en frutos
La catalasa es una oxidorreductasa esencial en
el sistema antioxidante de las plantas; degrada
el H2O2 y tiene la particularidad de evitar la
necrosis de los frutos que suele aparecer
durante la senescencia y en las lesiones por
frío. (Dueñas, & Restrepo, 2008)
La tolerancia al frío ha sido vinculada con
una activación del sistema antioxidante, que
previene la acumulación de sustancias
reactivas de oxígeno, y con la protección
contra la lisis celular. Este sistema
involucra enzimas como la catalasa,
ubicada principalmente en los peroxisomas
y en la mitocondria, que se encarga de
descomponer el H2O2 en H2O y O2.
(Cuenca, & Restrepo, 2003)
Planteamiento del problema
Las enzimas son biomoléculas constituidas por
diversas proteínas, estas estructuras permiten
catalizar reacciones químicas en diferentes
células del organismo permitiendo un
funcionamiento adecuado. Al realizar
múltiples funciones la extracción y
determinación de actividad enzimática se
vuelven técnicas y herramientas aplicadas en
diferentes industrias, como la farmacéutica.
Justificación
Universidad del Valle de México
Se desea conocer y realizar la inhibición
enzimática de la catalasa posteriormente de su
obtención de una fuente natural, a su vez,
determinar su actividad enzimática después de
la adición de un inhibidor enzimática (KCN)
por medio de la titulación con KMnO4.
Objetivos
General:
Realizar la inhibición de la actividad
enzimática de la catalasa obtenida del apio una
fuente natural.
Específico
● Conocer la forma y condiciones para
obtener un preparado de catalasa a
partir del apio.
● Verificar el efecto de la concentración
de la enzima sobre la actividad de la
catalasa.
● Verificar la influencia de un inhibidor
sobre la actividad enzimática.
Hipótesis
En esta práctica se espera realizar la extracción
de la enzima catalasa presente en el apio, para
con ello realizar la determinación de la
actividad enzimática, y posteriormente
verificar el efecto de la concentración
progresiva del sustrato en presencia de un
inhibidor
Metodología
Se realizó la extracción de la enzima,
preparando polvos de acetona: se utilizó 2 g de
pulpa del apio, se maceraron con 6 ml de
acetona a -8°C, posteriormente se filtró al
vacío y el retenido (polvos de acetona) se lavó
con acetona a -8 °C. Este proceso se realizó
dos veces. El sedimento incoloro se suspendió
en buffer fosfatos 200 mM, pH 6,8 y se
sometió a agitación continua, durante 1 hora a
2°C. La suspensión se centrifuga a 12000 x g
durante 30 min; el sedimento se desechó y el
sobrenadante se utilizó para las medidas de
actividad enzimática.
Escuela de Ciencias de la Salud
Se realizó la determinación de la actividad
enzimática. En un tubo de ensayo (por
triplicado), se mezcló 900 μL H2O2 a ciertas
concentraciones (100, 200, 300 y 400 Mm)
más 100 μL de extracto enzimático. Al agregar
la enzima al primer tubo, se puso en marcha el
cronómetro a fin de que en cada frasco
transcurran exactamente 5 minutos de reacción
con la enzima. Transcurridos los 5 min, se
detuvo la reacción con 900 μL H2SO4.
Finalmente, se tituló el H2O2 no degradado
con KMnO4 estandarizado (10 mM). Para el
blanco, el H2SO4 será incorporado antes de
adicionar el extracto enzimático. La unidad de
actividad (UCAT) fue definida como los μmol
H2O2 degradado/min.
Se verificó el efecto de la concentración
progresiva del sustrato en presencia de un
inhibidor. Se procedió de igual forma al
experimento anterior, con la diferencia de la
presencia en todos los tubos, de 100 μL KCN.
Al momento de agregar la enzima al primer
tubo, se puso en marcha el cronómetro a fin de
que en cada frasco transcurran exactamente 5
minutos de reacción con la enzima,
transcurridos los 5 min, se detuvo la reacción
con 900 μL H2SO4, finalmente, se tituló el
H2O2 no degradado con KMnO4
estandarizado (10 mM). Para el blanco el
H2SO4 será incorporado antes de adicionar el
extracto enzimático. La unidad de actividad
(UCAT) fue definida como los μmol H2O2
descompuesto/min.
Posteriormente se realizaron los cálculos de:
La velocidad de reacción para cualquier tubo
experimental se expresa en la siguiente unidad:
ⱱ = mmoles de H2O2 degradados / minuto. La
velocidad expresado en esa unidad deben
realizarse los siguientes cálculos siguiendo
esta secuencia:
1.- mEq de KmnO4= N KMnO4 x Volumen
gastado (mL)
2.- mEq de H2O2 = mEq de KmnO4
Universidad del Valle de México Escuela de Ciencias de la Salud

3.- mmoles de H2O2 = mEq de H2O2/ N° de Análisis de resultados

hidrógenos (2) Durante el desarrollo de esta práctica se buscó
visualizar la inhibición de la catalasa, obtenida
4.- mmoles degradados de H2O2 = mmoles del apio. La catalasa es una enzima que
totales (control) – mmoles remanentes podemos encontrar en todos los seres vivos. Es
(experimental) esencial pues descompone el peróxido de
hidrógeno, un compuesto tóxico, que se
e. ⱱ (velocidad de reacción) = mmoles
produce durante el metabolismo celular.
degradados de H2O2/ tiempo de reacción (5
minutos)
En esta práctica la visualización del efecto de
inhibición, se expresa mediante el gasto de
Se construyeron gráficas de concentración
permanganato de potasio, pues este reacciona
enzimática contra velocidad de reacción y
con el peróxido de hidrógeno, ocasionando
concentración progresiva de inhibidor contra
una reacción colorimétrica qué nos permite
velocidad de reacción.
conocer el punto de equivalencia. Puesto qué
la catalasa se encarga de descomponer el
Resultados peróxido de hidrógeno, la relación entre el
Posteriormente de la extracción de la enzima gasto de permanganato de potasio es directo a
catalasa de origen natural (apio), se realizó la la inhibición de la catalasa. Siendo este qué a
titulación para determinar la actividad menor gasto de permanganato de potasio
enzimática de la enzima extraída. Debido a la menor inhibición de la catalasa. Pues se
poca cantidad permanganato potásico encuentra menor cantidad de peróxido de
(KMnO4) implementada para el grupo, hidrógeno, debido a qué la enzima sigue
únicamente se realizó la titulación con el intacta.
inhibidor enzimática KCN, obteniendo los La inhibición de la catalasa se llevó a cabo
siguientes volúmenes: mediante la adición de dos soluciones. La
adición del ácido sulfúrico, busco
Tabla 1. Volumen gastado de KMnO4 durante desnaturalizar la enzima, deteniendo su
la titulación de cada tubo con extracto función. Por su parte la catalasa es fuertemente
enzimático, diferentes concentraciones de inhibida por el cianuro ya qué este es capaz de
peróxido de hidrógeno e inhibidor enzimático combinarse con el hierro de su grupo
KCN. Debido a la poca cantidad de KMnO4 prostético porfirínico,
que se encontró en el laboratorio no se logró
realizar la titulación de cada tubo, incluyendo En comparación a otros equipos cuyo origen
el tubo 10 con mayor concentración de H2O2. de la catalasa no provenía del apio, el gasto del
volumen del permanganato de potasio fue
Tubo Concentraci Volumen mayor. Por lo qué la concentración enzimática
ón de H2O2 gastado de
de la catalasa presente en el apio, era
(mM). KMnO4
(mL) demasiado baja. Por ello la concentración de
peróxido de hidrógeno fue mayor qué la de
1 100 2.400 mL otros equipos. Es debido a esto qué las
titulaciones no se completaron, pues
4 200 4.300 mL requerirían de un alto volumen de
permanganato de potasio, con el cual
7 300 7.100 mL
lamentablemente no se contaba.
10 400 X .
Universidad del Valle de México Escuela de Ciencias de la Salud

Conclusión
La enzima catalasa es encontrada en
mitocondrias, peroxisomas y citosol
(eritrocitos), su amplia distribución es debido a
que participa en diferentes procesos biológicos
donde se generan especies químicas conocidas
como radicales libres y en la destrucción de
H2O2 generada en el metabolismo celular.
Durante el desarrollo de esta práctica se logró
la inhibición de la enzima catalasa con KCN
obtenida a través de su extracción de una
fuente natural, el apio, manteniendo bajas
temperaturas para evitar así la
desnaturalización de las proteínas. Además, se
determinó la presencia de actividad enzimática
a través de su titulación con KMnO4, sin
embargo, no fue posible calcular las
velocidades de reacción de cada uno de los
tubos debido a la poca cantidad de reactivo y
su distribución para todos los equipos.

Referencias
1. Cuenca, C. E. N., & Restrepo, P.
(2003). Efecto del almacenamiento de
Uva Caimarona (Pourouma
cecropiifolia) a diferentes
temperaturas sobre los sólidos solubles
y la actividad de catalasa. Revista
Colombiana de Química, 32(2), 81-92.
2. Díaz, A. (2003). La estructura de las
catalasas. REB, 22(2), 76-84.
3. Dueñas, M., Narváez, C. E., &
Restrepo, L. P. (2008). Inhibición de
lesiones por frío de pitaya amarilla
(Acanthocereus pitajaya) a través del
choque térmico: catalasa, peroxidasa y
polifenoloxidasa. Acta Biologica
Colombiana, 13(1), 95-106.
4. Miranda, E. M., Hernández, I., &
Janer, N. (1996). Enzimas que
participan como barreras fisiológicas
para eliminar los radicales libres: II.
Catalasa. Revista Cubana de
Investigaciones Biomédicas, 15(2),
0-0.