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  • Manual de Guías para Prácticas de Laboratorio de Microbiologia de Alimentos e Industrial

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    Miriam Lucia Solarte
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    Manual de Guías Para Prácticas de Laboratorio de Microbiologia de Alimentos e Industrial (1)

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    UNIDAD UNIVERSITARIA DEL SUR DE BOGOTA FACULTAD DE INGENIERIA MANUAL DE GUIAS PARA PRACTICAS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA DE ALIMENTOS E INDUSTRIAL Autores Dr. JOSE A, DE SILVESTRI S. Dra. EMILIA MARIA DE SILVA Profesores Departamento de Farmacia Universidad Nacional de Colombia Bogoté,D.£., 1987 Powered by @ CamScanner INTRODUCCION f las prdcticas que contienen estas gufas, son una adaptacién de algunas de las técnicas recomendadas por la ICMSF (Inter- national Commission on Microbiological Specifications for Foods 3 no estén todas las pruebas que deben practicarse a un alimento sino sélo aquellas que pueden realizarse sin mayor complicacién pero que son representativas en la deter- minacién de la calidad de un alimento, Ba asf como se encuentran experimentos dénde se determinan el niimero de microorganismos, pretendiendo comparar los re- sultados obtenidos con los 1{mites recomendados para los a- Limentos y decidir sobre su calidad microbiolégica, adends se detectan aquellos microbios cuya presencia invalida el consumo de un alimento. El estudiante debe hacer-una revisién cuidadosa sobre las caracterfsticas de algunos microorganismos cuya presencia no es conveniente en un alimento, La revisién debe enfocar- se hacia aquellas condiciones que afecten su viabilidad en el alimento, ya que son estas las condiciones la que permi- Powered by @ CamScanner | 8 r-sultados obtenidos con log 2 gar mejor 10 hte 7 consiguiente, interpretar correctazent, a calidad microbiolégica dey af ante igualmente deberd analizar el por qué de le medios utilizados en cada uno de los en- Bl estudil utilizacién de 10s poder entender el re riendo el estudio del fundamento y la sultado que se obtenga, posi- sayos para tivo o negativo, requii composicién de los medios de cultivo. Ia bibliograffa recomendada al final de las gufas, es @ nuestro juicio, la indicada por cuanto recoge todas las ex- periencias que los especialistas mundiales en microbiologia de alimentos han estado acumulando durante largos afios de trabajo en sus laboratorios y que es conveniente sea revi-~ sada por el estudiante antes, durante y despiies de la rea~ iizacién del laboratorio; s6lo as{ creemos puede obtener un buen aprendizaje en esta drea de la ciencia y de mucha in- Portancia en su trabajo posterior como tecnélogo o ingenie- mt on er pans ant moe Per los errores que puedan estar presentes Sn estas guias y esperamos 1a, as 5 valiosas sugerencias que Puce dan hacerse para mejorar o te mate: fe 3 Y corregir e, naa ste material, los Autores. Powered by 8 CamScanner Introduceién coNranDo Evaluacién Inicial a Informacién de Retorno Prdctica No. Prdctica No. Prdctica No. Practica No. Prdéctica No. Prdetica No. Practica No. Préctica No. Prdéctica No. Evaluacién Final 1. 3. 4. Se 9. Preparacién de Muestras para el Ané- lisis Microbioldgico. Recuento de Mieroorganismos Aerobios Meséfilos Viables. Recuento de Anaerobios. Recuento de Coliformes. Técnica del Nimero m4s Probable. . Prueba de Presencia o Ausencia.de Ente- robacteriaceae y Recuento. Recuento y Confirmacién de Enterococos. Recuento de Mohos y Levaduras, Deteccién.de Salmonelas. Recuento de Estafilococos Coagulasa Positivos. Informacién de Retorno > Bibliograffa. Powered by @ CamScanner EWALWACIOIN HNICIAL Cuél es la 1az6n para preparar especialmente una muestra de un alimento que serd sometido a anélisis microbiolégi co? Cuél es la razén para estandarizar y adecuar un método para la obtencién de una suspensién inictal de microorganismos? Qué importancia tiene el recuento de mi croorganismos aerobios meséfilos en un alimento? El recuento de anaerobios, qué significado tiene?. Cuél es el indicador universal y 300 12 a> 300° 173 A>300 B> 300 B > 300 B >300 104 A>300 B 7300 Se toman las placas correspondigntes a ta diluetén 104 se divide por ejemplo en 4 secciones; 40 cuentan todas las colonias de la seccién 1 volores: Powered by 8 CamScanner fl, Caja A: Seccién 1170 Seccién 42190 Caja B: Seceién 1: 180 Seccién 42190 Colonias en la Caja Ar 170+ 190.x 4 = 180 x 4 = 720 ty 90 Colonia en la Caja Bz 1804 190x4 = 185 x 4= 740 24 190) UFC/g 6 ml 20 +740 x 104 = 7300000 2 6.2.2, Cuando en una seccién de una o ambas placas que se han divi- dido en 8 y se han inoculado con Ia dilucién menos concentrada Se encuentran més de 200 colonias se debe multiplicar el factor de dilucién por 1,600 (200 x 8) y el recuento eskindar estimado se expresa como superior ( > ) al valor obtenido, Ejemplo: : : 3 2 *4>300 10 io! = A>300 10" A 2300 B > 300 B > 300 B > 300 104 = aes00 1S A > 300 B > 300 B > 300 Si en las cajas de.10° se encuentras, en una seecién cualquiera de 8 més de 200, entonces el valor estimado es 71,600 x 10'S = >160000000 UFC/g 6 ml. Powered by @ CamScanner 2. los las stonbras 62 F5 diluciones sen los cv 4.2.3, Enaquelbs 2 colon we resentan ) multiplicado por el factor de gi. jas, el recuento se mis concentradas nO fi exprea lucién. 5 (<1 como inferior | jemplot Ejempl: 12 At No colonias 10°) A! No colonias B+ No colonias y ast 8! No colonias sucestvamente el némero de U,F.C por gramo 0 mililitro es ian UFC/g$ml= <1 x10 = <10 Otro ejemplo: worl asd 102 Asng colontas Br 2 B: no colonias UFC/g6 ml.» = <1x 10°? = <100 Presentacién de resultados Se debenutilizar Gnicamente dos cifras significativass fel cao del ejemplo presentado en 6,1, el némero de U.F.C,/g 6 a 416 302500 se debe expresar edmo 30 2, x10", en el ejemplo 6, We dis. 7300000 se debe expresar como 73 *108 y en el 6,22 que is 9 tor (>) « 160000000 g, ed be expresar coma 5-16 x 197 UFC/g 6a En los casos de 6,2,3 + £8 expresan eo $100 UFC/ 9 6 mi, SIO UFC/g 6 ml. 6 Powered by @ CamScanner 13 PRACTICA No,3 RECUENTO DE ANAEROBIOS INTRODUCCION Este recuento no se tenfa como una medida de los microorganismos indicadores, Pero el desarrollo y adecuacién de técnicas para ef cultivo de microorganismos anaerobios han permitido introducirlos como parémetro indicative de contamina= Los recuentos de anaerobios agrupan tanto a los anaerobios obligados como a los facultativos de las Enterobacteriaceae , estreptococos fecales y estafilococos cuando se utilizan medios generales. Sin embargo el recuenio de anaerobios no podri sustituira los\récuentos de aero~ bios en el anélisis diario de los alimentos. El recuento de anaerobios meséfilos es préctico como indicador de la presencia de condiciones fayorables para la multiplicacién de organismos anaerobios produc tores de intoxicaciones, por ejemplo Clostridium perfringens. OBJETIVO: - Adquitir destreza en Ia técnica de recuento de angerobios. Interpretar los resultados obtenidos en el recuento de anaerobios, Powered by @ CamScanner sy EQUIPOS go ba indicado on la prc MATERIALE luciones como as di Los necesarios PT preparar lo toa No.l Cojas de Petri (2 por cada diludén)- 3, Pipetas de 1 ml. graduacas on décimas de mililitros. 0; rel medio fundido a 44 ~ 46°C. Botte de agua para mantene! 5, Incubadora 6. Agar para recuento de anaerobios EXPERIMENTO: | una de las diluctones en agar para 1. Colocar por duplicado 1 ml, de cada recuento, Agregar a cada caja de Petri aproximaca ido fundido a 44 46°C (controlar adecuadam y la adici6n mente 15 ml, de agar para recuen” to el cual se ha manteni jente Ia peratura), El tiempo entre la realizacién de las diluciones del medio de cultivo no debe ser superior a los 20 minutos, preferiblemente tem inferior a 10 minutos. Proceda como en el numeral 3 de la préctica No.2. Proceda como en el numeral 5 de la prictica No.2, pero cvente las colonies Powered by @ CamScanner 15. aparecidas al cabo de 1, 2 y 3 dias, habiendo incubado en edimaras de anaerobiosis, (Instrucciones le serin dadas por ol docente). 5, Haga les céilculos del némero de U.F.C/g6 ml. EXPERIMENTO: 2 Para enumerar esporas de Bacillaceae, anaerobies estrictas y facultativas. ° 1. Caliente los tubos de los diluciones preparadas para el experimento 1a80C. durante 1 minuto. 2, Proceda can su experiment siguiendo las indieaciones de fos nurerales 1 a5 del experimento 1 de esta misma prictica . Powered by 8 CamScanner PRACTICA No.4 RECWENTO DE COLIFORMES: TECNICA DEL NUMERO MAS PROBABLE, (N.M.P.) INTRODUCCION La contaminacién directa o indirecta de origen fecal de un alimento se puede conocer por la determinacién de Escherichia coli, microorganismo cuyo habitat natural es el tracto entérico del hombre y de los animales. El indicador universal y clisico asociado a Ia presencia de microorganisms ‘entéricos en alimentos es E, coli, sin embargo la presencia de E. coli_en un alimento no significa necesariamente Ia presencia de un patégeno, inicamente indica un cferto riesgo de que pudiera estar presente. Valores significativos de E, coli , en un alimento son fhdice de una falta general de limpieza en el manejo del mismo y un almacenamiento inadecuado, El término Coliformes comprende E, coli_ y diversas especies pertenecientes fl a otros géneros de la familia Enterobacteriaceae, En términos experimentales Coliformes son aquellos microorganismos detectados por pruebas para Coli formes La tabla 1. presenta una relacién de microorganismos detectades y no detectados en los pruebas para Coliformes, Powered by @ CamScanner 7. seworgott008 geleccionados por mn de los indculos procedentes sr agrupa a out sa los nonmaless Los #Coliformes fecale peraturas superiors incubacién, tem miento de Colifor mess de un caldo de enriqueci «a fanilia completa de las Enterobac- pruebas para determina! han sido sometidos a frata~ sa ~ ) en alimentos que ones de esta: prueba sont se han establecido teriaceae (Lactosa + ¥ lacto: rientos para asegurar su inocuidad. Las r= grupo taxénomicamente mal defi- Las bacterias "Coli formes" representan un rupo de bacterias diferentes qu incubacién y los eriterios a, nido. Pueden‘neluir un gi e dependen de Ia muestra, medio de cultivo, la temperatura de utilizados en la lectura de los resultados. La deteccién de microorganismos lactosa positivay puede.conducir a resultados falsos-seguros cuando hay un predomrinto dp lactosa-negativos. Ciertas condiciones desfavorables para E. coll y otros Coliformes son sopor tadas hasta ciertos Ifmites por Salmonella, Varios tipos de Enterobacteriaceae permanecen més tiempo que E, coli en los ali + coli en los ali montos naturales y en las superficies de los utensilios y equipos, Es el caso di « Es el caso de especies de los géneros Erwinia y Serratia (contadas como E; teroba eae ¥ ° nterobacteriac coliformes) que por estar asocia ve nore ) que Por estar asoctadas con los egetales, no j mi 20 implica contami cién fecal; lo que ha: ee que E. coll sea el nico microorgani ismos indicador valido en el andlisis de los alimentos vegetales fre: scos, Powered by @ CamScanner 18, La mayor parte de las Enterobacteriaceae que se encuentran en los alimentos de de origen animal naturales o frescos son originados de una contaminac ién fecal. Un némero elevado puede indicar una mani pulacién no higiénica y/o un almace- namiento inadecuado, OBJETIVO: - Adquirir destreza en la técnica del recuento de coliformes por el método NMP, : Interpretar los resultados y decidir sobre la calidad de un alimento. EQUIPOS Y MATERIALES 1, Todos los necesarios para la preparactén de las diluciones, como se indicé ‘en Ia practica No.1. 2, Incubadora 3, Pipetas graduadas de 1 ml. 4, Asa bacteriolégica 5. Tubos con 10 ml, de caldo lactosado bilis verde brillante, con tubos de Durham, i 6. Tubos con 10 ml. de caldo lauril sulfatotriptosa, con tubos de Durham. 7. Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) 0 agar Endo en placas. Powered by @ CamScanner EXPERIMENTO: | a «9 xe ha indicado en la prictica No.1. Preparar las diluciones com Agielonar | ml, da code una de les atluctones 2 os tubos con caldo lauril sulfate tiptosa. Se deben utilizar tres tubos por cada allusion Incubar todes los tubes durante 24 y 48 horas ¢ 35,- 37°C. Después de 24 horas se observa en que tubos se har producide gas Los que no, se incuban por 24 horas més. Después de las 48 horas se registran todos los tubos ve han producido gas. Observar cual fue la dilucién més alta cuyos tres tubos mostraron todos produccién de gas y observar los tubos de Jas dés diluctones préximas siguientes que dieron produccién de ges. Por ejemplo # la dilucién pox terior fue la 121000 y en la de 1:10000 hay 2 tubos y en la de 1: 100000 hay 1; el resultado se anota ast ato"), 2(10°4) y 1(10°9), Se busca en la tabla de NMP (adjunta a esta préctica), el valor que corresponde 3,2,1, que es 150, que multiplicade por 100 equivale a 15000 NMP por gramo 0 mililitro de alimento, En el caso de que ninguna dilucién diese los tres tubos positives, escoger aquellas diluciones més altas que den algin tubo positive , per ejemplo sien las diluctones 10°3, 10°4, 10° y 1076 se presentaran 2, 2, 1 y 1 2, respectivamente, se registran los resultados asf 2(1074}; 1(10°5) y 1(10°§), se busca enb Tabla de NMP el valor que corresponda a 2,1,1 que es 20, Powered by @ CamScanner -20, ve multiplicado por 1000 equivale « 20000 NMP por gramo o mi En aquellos casos en los cuales no haya dilucién més alta que presente los tres tubos positives, escoger las tres Gltimas diluciones realizadas. Por ejemplo si las tres Gltimas diluciones realizadas fueran 10°4, 10°5 y ré 10°” y los tubos positivos fueran, 3, 3 y 2.respectivamente, los resultados se anotan asi 3(10°4), 3(10°5) y 2(10°%), se busca el resultado en la tabla de NMP que corresponde 3,3, 2 que es de 1100, que multiplicado por 1000 equivale a 1100000 NMP por gramo o mililitro. ‘Aquelos tubos de las diluciones seleccionadas que dieron positives 3¢ con= firman como organismos coliformes ast’ a. Inocular una asada de cada uno de los tubos de caldo lauril sulfato trip tosa positives a caldo lactosado bilis verde brillante (2%). b, Sembrar con un asa de cada uno de los tubos de caldo lauril sulfato positivos en cajas con agar EMB. ‘ c. Sembrar con un asa de cada uno de los tubos de caldo lauril sulfato positive en cajas con agar Endo. d. ‘Incubar tanto: fubos como cajas durante 24 y 48 horas a 35-37°C, e. Registrar el némero de tubos de cada dilucién que en el caldo lacto~ sado bilis verde brillante produjeron gas y observar. en el medio EMB si hay colonias negras, o con el centro negro, o colonias mucoides color rosa = naranja que indica la presencia de organismos coli formes y en el Agar Endo las colonias coliformes estén rodeadas de halos rojos y son rojas. d by 8 camScanner wh Gn el némero de Buscar en la tabla de NMP el valor que corresponde S26 j e feron confirr tubos de cada una de las tres diluciones seleccionadas qu‘ ma= 198 das como organfsmes coliformes, por ejemplo, los resultados fueron Coe) 3, (10-4) 2, (1075) 1, ef valor es 150 multiplicado por 100 igual a 15000 NMP/gramo o mililitro de organfsmos coliformes. EXPERIMENTO 2 1, Inocular a partir de los tubos de caldo lauril sulfato triptosa pos! tubos con caldo E. coli © su equivalente, Incubar todos los tubes anterionnente inoculades durante 24 y 48 horas @ 44,5 0,2°C, Observar después de la incubacién si los tubos con caldo E.C o su equiva- lente producen gas. : \ Cuando los tubos con E.Co su equivalente muestran produccién de gas \25 Porque hay organfsmos Coliformes fecales, Powered by @ CamScanner TABLA I Diferencis entre los géneros de la familia kn terabacteriaceae? en relacién con su origen fecal o no fecal, w astecet fy SU enteropatogenicidad por ai hombre mente de origen Género fecal l Escherichia si n Edwardsiella si ut Citrobacter Nob IV Satmonella Si v Shigets Si vl Klebsiella Nob VU Enterobacter Nob VU Hafnia No? IX. Serratia No x, Proteus Nob XL Yersinia Si XIE Erwinia No Predominante- del rere ee ot a saan Basado en el Zerge 1974; ver tambien manual of determinative bact2 Moviel, 1973). Generalmente ctado en las “pruchas para coiiformes” Tipkamente enteropatégeno para el hombre Nof Nol No logy, 8th ed. (Buchanan ard Gibbons, Algunas cepas havitan en el tracto intestinal, pero proliferan también en otros anibientes natu- rales. Excepto cepas fermentadaras lentas de la lactosa, Excepto cepis ucasionales, cepto cepus que se han adaptado aun crecimiento ripidu a teinperatutas ordsimas 037°C Alguzos'serotipos coniienen cepas onteropatdgenas. Powered by @ CamScanner TABLA cats ditueién® a i. - Nimera de tubos pos- ; tivos en cada dilucién kimi —————— 95% ites de confianza 1 <1 (23 o- 1 0 a

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