PRACTICA Nº 2

ESPECTROFOTOMETRIA

RELACIÓN DE EXPERIMENTOS:

1. Cáculo del factor de calibración y construcción de una curva de calibración.

2. Determinación del espectro de absorción del anaranjado de metilo.
3. Determinación colorimétrica de colesterol en suero sanguineo

OBJETIVOS:

1. Calcular la concentración de una sustancia presente en solución aplicando la ley de

Beer-Lambert, mediante un método fotocolorimétrico.
2. Comprender los conceptos de factor de calibración y curva de calibración en el uso
de los métodos fotocolorimétricos.
3. Conocer el fundamento de los métodos fotocolorimétricos.
4. Determinar el espectro de absorción de una sustancia y reconocer su importancia.

INTRODUCCION:

Este es un método muy ampliamente usado en bioquímica y análisis de laboratorio para

determinar la concentración de una sustancia presente en solución. Se le utiliza para medir la
concentración de una sustancia presente en un líquido biológico ( sangre total, suero, plasma,
orina, etc. ) También es útil para la cuantificación de una sustancia presente en un tejido, sea
por examen en el tejido de una actividad enzimática por ejemplo o por previa extracción de
la sustancia a partir del tejido y su posterior determinación. También pueden ser empleados
estos métodos para la identificación de una sustancia o examinar algunas propiedades de ella
a través de la modificación de su espectro de absorción por ejemplo. Así, hay otros usos que
los iremos viendo conforme avancemos en desarrollo del curso.

Como se ha visto en la parte teórica, estos métodos hacen uso del espectro
electromagnético como fuente de radiación para hacer las mediciones.
 La espectrofotometría utiliza como fuente, luz visible o del espectro ultravioleta (UV)
empleando los aparatos llamados Espectrofotómetros; en tanto que la fotocolorimetría que
vendría a ser una parte de la espectrofotometría, solamente utiliza luz del espectro visible
(400 a 800 nm), para hacer las determinaciones, empleando el aparato llamado
fotocolorímetro el cual emplea filtros de color para seleccionar un intervalo de longitud de
onda correspondiente al filtro usado. Tanto a la espectrofotometría como a la
fotocolorimetría, en conjunto, se les da el nombre de fotometría, pero en la actualidad este
término ya casi no se usa.
En la presente práctica sólo usaremos el fotocolorímetro

Fuente de Filtro Muestra Fotocelda Registro

luz

Figura Nº 1. 1.- Componentes de un fotocolorímetro

Los métodos espectrofotométricos y fotocolorimétricos se aplican para medir la fuerza

transmisora de luz de una solución, con el objeto de determinar la concentración de una
sustancia presente en dicha solución, que es la que absorbe la luz. Si la solución de por sí ya
tiene color, lo cual no sucede frecuentemente, se puede comparar la absorbancia mostrada
por la sustancia presente en solución, con la que producen soluciones de la misma sustancia;
pero, de concentración conocida, para así poder determinar la concentración de esta sustancia
en aquella solución en donde no se le conocía.

Si la sustancia presente en solución no tiene color, que es lo que sucede más

frecuentemente, habrá que hacerla reaccionar con ciertos reactivos a fin de que se produzca
un determinado color, cuya absorbancia pueda ser medida en el fotocolorímetro, comparando
su absorbancia con aquellos que producen otras soluciones de la misma sustancia pero de
concentración conocida ( soluciones estándar ), mediante la aplicación de la ley de Beer-
Lambert.

Los espectrofotómetros y los fotocolorímetros miden pues kla absorbancia de las

soluciones que tiene una sustancia cuya concentración se desea medir. Pero, como ya se ha
dicho antes, los fotocolorímetros solamente usan luz visible y se emplea filtros para
seleccionar haces de longitud de onda, correspondientes al filtro que se se usa, ( así, el filtro
azul deja pasar haces de longitud de onda entre 400 a 465 nm; el filtro verde entre 500 a 570
nm; y el filtro rojo entre 640 a 700 nm). En tanto que los espectrofotómetros emplean como
fuente de luz tanto la visible como la UV, y se puede seleccionar una determinada longitud
de onda mediante el uso de un prisma y colimador; por lo tanto, en las mediciones de
absorbancia se emplea un haz de longitud de onda deseada. Los fotocolorímetros se usarán
para sustancias que absorben luz visible o UV.

En el curso de Bioquímica, en la mayor parte de los casos utilizaremos la expresión

práctica de la ley de Beer-Lambert, que como ya se ha visto en la parte teórica, es:

Abst Cst
----------- = ----------- (Ecuación 1)
Abx Cx

Es decir las absorbancias son directamente proporcionales a las concentraciones. Resulta

entonces que en cualquier método fotocolorimétrico, en la mayor parte de los casos, se
trabajará con tres tipos de soluciones. La muestra que contiene la sustancia cuya
concentración se desea medir (Cx) y cuya absorbancia se mide en el fotocolorímetro (Abx);
la solución estándar, cuya concentración de la sustancia es conocida (Cst, y cuya
absorbancia tambien se conocerá ya que se la medirá en el fotocolorímetro (Abst); finalmente
tenemos la solución blanco, que generalmente tiene el disolvente puro y/o los reactivos, pero,
sin la sustancia que se desea medir, su absorbancia tambien la medimos en el fotocolorímetro.
Estos tres tipos de soluciones, se tratan siempre de igual manera y con los mismos reactivos.
Antes de aplicar la ecuación 1, hay que de restar la lectura del blanco a Abx y a Abst
(Absorbancias netas) y con estos datos recien podemos proceder a calcular la concentración
Cx, según la ecuación 1:
 Cst x Abx
---------------------- = Cx (Ecuación 2)
Abst

El valor Cst / Abst, se llama factor de calibración ( Fc ); así, la ecuación 2 quedaría

como:
Cx = Fc x Abx (Ecuación 3)

En una buena parte de los métodos fotocolorimétricos que se usan para determinar una
sustancia, se emplea, no una solución estándar sino varias, esto con el objeto de dar mayor
precisión a la medida; por lo tanto antes de emplear la ecuación 3, se deberá obtener un factor
de calibración para cada solución estándar, luego sacar el promedio y recien emplearlo en la
ecuación 3.
Otro método que con frecuencia se usa para obtener Cx , es mediante la curva de
calibración. Esto consiste en hacer un ploteo de las concentraciones de los estándar en el eje
“X” , frente a sus absorbancias ( usar siempre absorbancias netas ) en el eje “Y”. Con esta
gráfica se puede extrapolar, usando la absorbancia neta de la muestra X, para ver cual será
su concentración.

Con frecuencia, para hallar la concentración de la sustancia en g % o mg % debemos

hacer operaciones adicionales. Generalmente se usa una muy pequeña cantidad de muestra
para hacer la reacción de coloración y determinar su absorbancia; luego, la concentración
encontrada según los métodos indicados, corresponde a la cantidad de muestra empleada,
para hacer la reacción de coloración, por lo que, para encontra la concentración de la
sustancia en g o mg %, que son las concentraciones como normalmente se expresan,
deberemos hacer una regla de tres simple para encontra dicha concentración en 100 ml de
solución o muestra. Esto se comprenderá mejor cuando hagamos un ejemplo de la utilización
de un método fotocolorimétrico para la determinación de una sustancia, como lo proponemos
en uno de los experimentos que se indican más abajo.

Alternativamente, es posible hallar resultados directamente en porcentaje (g ó mg %), si

se calcula un factor de calibración porcentual; es decir , que el Fc simple encontrado
previamente, se lo corrige para hacer la reacción de coloración; luego, al multiplicar este
factor porcentual por la absorbancia neta de la muestra X, tendremos el resultado
directamente en g % ó mg %. Para el caso de la curva de calibración, podemos calcular las
concentraciones de los estándares en g % ó mg %, así que se plotea absorbancias frente a
concentraciones de los estánda en g % ó mg %, luego la absorbancia neta de la muestra X se
extrapolará en la gráfica, dandonos el resultado directamente en g % ó mg %, con lo que los
cáculos se simplifican.

EXPERIMENTO 1 .

FACTOR DE CALIBRACION Y CONSTRUCCION DE LA CURVA DE

CALIBRACION.

Reactivos:

- Solución de anaranjado de metilo a 1 mg %.

- Solución de anaranjado de metilo de concentración desconocida ( Muestra X ).
En este experimento se trata de hallar la concentración de una solución de Anaranjado de
Metilo (Muestra X). Se tendrá cinco concentraciones diferentes de Anaranjado de Metilo
(soluciones Estándar).

Procedimiento. Por el método del Factor de calibración.

En siete tubos de ensayo medir lo siguiente ( en ml ):

Tubo Nº
REACTIVOS
1 2 3 4 5 Muestra Blanco
Anaranjado de Metilo 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 ----- -----
1 mg %
Agua destilada 8.0 6.0 4.0 2.0 ----- ----- 10.0
Sol. de A. Metilo de ----- ----- ----- ----- ----- 10.0 -----
concentr. desconoc.

Mezclar bien y leer en el fotocolorímetro con filtro azul.

Completar el siguiente cuadro:
1 2 3 4 5 Muestra Blanco

Absorbancia o D.O 0.233 0.46 0.698 0.920 1.184 0.551 0.002

Absorbancia Neta 0.231 0.458 0.696 0.918 1.182 0.549 ------
Concentración en mg % 0.2 0.4 0.6 0.8 1 ------ ------
de los estándar de A. M.
Factor de Cali 0.865 0.873 0.862 0.871 0.846 ------ ------
bración
Concentr. de la muestra ------ ------ ------ ------ ------ 0.475 ------

D. O : Densidad Optica, A. M. : Anaranjado de Metilo

Por lo tanto el factor de calibración será de: 0.863

La concentración de la muestra X de Anaranjado de Metilo será de: 0.475 mg %

Procedimiento: Por el método de la Curva de Calibración.

Con los datos de las absorbancias netas de los tubos del 1 al 5 y sus respectivas
concentraciones, construir la curva de calibración para el anaranjado de metilo. Usar papel
milimetrado haciendo en cada eje las escalas adecuadas, en el eje X colocar concentraciones
de Anaranjado de Metilo y en el eje Y las absorbancias o Densidades Ópticas netas. Trazar
la línea tomando los puntos medios. Colocar o pegar la gráfica en el siguiente espacio:
 Figura Nº 1.2 .- Curva de calibración para el anaranjado de metilo

La concentración de la muestra”x” de anaranjado de Metilo, según la curva de calibración

será de: 0.475 mg %

Nota (1): Hay fotocolorímetros que nos dan la absorbancia o densidad óptica (D.O)
directamente. Otros aparatos como los fotocolorímetros Klett dan en unidades Klett
(UK), que son unidades proporcionales a la densidad óptica. Para convertir D.O.
en U.K., multiplicar la D.O. por 500; en tanto que para convertir U.K. en D.O.,
multiplicar U.K. por 0.002 ó dividir la U.K. entre 500.

Nota (2): Si por alguna razón no está operativo el fotocolorímetro del laboratorio se puede
trabajar con las siguientes D.O. : Tubo 1: 0.320; tubo 2: 0.460; Tubo 3: 0.650;
Tubo 4: 0.840; Tubo 5: 0.950; Tubo 6 (Muestra x): 0.720 y tubo 7 (blanco): 0.00

Nota (3): En el caso de no disponerse de soluciones de Anaranjado de Metilo, se puede

trabajar con una de Bicromato de Potasio a 0.1 g %. Procediéndose en forma
semejante a lo señalado en la tabla ya indicada para el Anaranjado de Metilo.

EXPERIMENTO 2.
DETERMINACION DEL ESPECTRO DE ABSORCION DEL ANARANJADO DE
METILO.
La determinación de un espectro de absorción siempre debe hacerse usando un aparato
que pueda seleccionar una longitud de onda determinada. Como se sabe, para determinar un
espectro de absorción de una sustancia, hay que medir la D.O. en varias longitudes de onda
determinadas, una por una, y luego hacer un gráfico donde se plotea las D.O. ( en el eje Y)
frente a las longitudes de onda ( en el eje X ). Cada sustancia en solución tiene su espectro
de absorción característico y así podemos identificar de que sustancia se trata.

Procedimiento:

De la solución de Anaranjado de Metilo del experimento 1, que tiene una concentración

de 1 mg %, hacer una dilución 1: 2.5 con agua destilada.
 Tomar un fotocolorímetro o espectrofotómetro que seleccione longitudes de onda
determinadas, ajustar a 100 % de transmisión usando un tubo con agua destilada, y luego
medir la absorbancia de la solución diluida de A. de Metilo a las longitudes de onda de 400,
420, 440, 460, 480, 500, 520, 550 nm. En el caso de no disponer del aparato indicado, usar
las siguientes lecturas:

Longitud de Absorbancia
onda (nm) (D.O)
400 0.290
420 0.320
440 0.380
460 0.420
480 0.375
500 0.200
520 0.180
550 0.090

Construir el espectro de absorción de Anaranjado de Metilo en una hoja de papel

milimetrado, colocando en el eje X las longitudes de onda y en el eje Y las absorbancias
Usar el espacio siguiente para pegar su gráfico
 Figura Nº 1.3.- Espectro de absorción de luz del Anaranjado de Metilo

Cuál es la longitud de onda con la que se obtiene mayor absorbancia para el Anaranjado de
Metilo? 460
INTERROGANTES BIOQUIMICAS.
1. ¿Que es transmitancia y que es Absorbancia? ¿Qué relación existe entre estos
términos?
ABSORBANCIA: Luz absorbida por la solución, el haz de luz restante atraviesa el cuerpo
traslúcido en una determinada luz de onda
TRANSMITANCIA: Cantidad de luz que atraviesa un cuerpo en una determinada
longitud de
onda
RELACIÓN: La absorbancia es el algoritmo negativo de la transmitancia

2. Que entiende Ud. Por espectro de absorción de una sustancia?

Representación gráfica que muestra la intensidad de la energía absorbida por una
molécula, a partir de diferentes longitudes de onda. Al realizar espectro de absorción de
una sustancia determinamos su longitud de onda máxima y comprobamos un cambio en
la estructura de la molécula, por ejemplo, su reducción, supone una modificación en su
espectro.

4. Que es una curva de calibración y que es Factor de calibración. ¿Como se las

obtiene?
CURVA DE CALIBRACIÓN: Evaluación de las absorbancias de estándares a
diferentes
concentraciones
FACTOR DE CALIBRACIÓN: Concentración de una sustancia que corresponde a una
unidad
de medida (absorbancia)
OBTENCIÓN:
Curva de calibración
Factor de calibración

4. Si una sustancia en solución tiene una transmitancia de 48 cuál será su absorbancia?

Respuesta: -1.68