Ajm Tesis

Desarrollo de métodos de determinación e
identificación de antibióticos y sus metabolitos

en alimentos de origen animal por LC-MS
y LC-MS/MS
Alexandra Junza Martínez
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DEPARTAMENTO DE QUÍMICA ANALÍTICA
Programa de Doctorado
Química Analítica del Medi Ambient i de la Pol·lució
DESARROLLO DE MÉTODOS DE DETERMINACIÓN E IDENTIFICACIÓN
DE ANTIBIÓTICOS Y SUS METABOLITOS EN ALIMENTOS DE
ORIGEN ANIMAL POR LC-MS Y LC-MS/MS
Memoria presentada por Alexandra Junza Martínez para optar al grado de Doctora por
la Universidad de Barcelona
Directores: Dr. José Barbosa Torralbo y Dra. Dolores Barrón Bueno
Barcelona, julio 2015

El Dr. José Barbosa Torralbo, catedrático del Departamento de Química Analítica de la
Universidad de Barcelona, y la Dra. Dolores Barrón Bueno, profesora titular del mismo
departamento,
HACEN CONSTAR
Que el presente trabajo de investigación titulado “Desarrollo de métodos de

determinación e identificación de antibióticos y sus metabolitos en alimentos de
origen animal por LC-MS y LC-MS/MS”, ha sido realizado bajo nuestra dirección
por la Sra. Alexandra Junza Martínez en los laboratorios del Departamento de Química
Analítica de la Facultad de Química y del Campus de la Alimentación de Torribera de la
Universidad de Barcelona y que todos los resultados presentados son fruto de las
experiencias realizadas por la citada doctoranda.
Y para que conste, expedimos y firmamos el presente certificado.
Barcelona, julio 2015
Dr. José Barbosa Torralbo Dra. Dolores Barrón Bueno

Als meus pares
Al Xavier
AGRADECIMIENTOS
Semblava que no arribaria el final, i ara des de la meva taula de Torribera miro enrere i
em venen a la memòria infinitat de records i moments viscuts, bons i d’altres no tant,
però que m’han servit per créixer com a investigadora i com a persona. Més de set anys
al grup han donat per molt i en aquestes línies m’agradaria agrair a la gent que en algun
moment em va ajudar a continuar i que avui aquesta tesis sigui una realitat.
En primer lloc vull agrair als meus directors de tesis, el Dr. José Barbosa catedràtic del
departament de Química Analítica i a la Dra. Dolores Barrón professora titular del
mateix departament per haver-me acollit al grup d’antibiòtics.
Gràcies a l’Anna Jubert i la Rosa Codony del Laboratori Interprofessional Lleter de

Catalunya (ALLIC) i al Roger Sarret de la Granja La Saireta per les mostres de llet
subministrades que han permès la realització i obtenció de tots els resultats de la tesis.
Al Dr. Xavier Saurina, per la seva ajuda en el tractament de dades amb eines
quimiomètriques. A la Dra. Encarna Moyano, gracias, tú ya sabes el porqué.
A tota la gent del Parc Científic, als doctors i tècnics dels serveis d’Espectrometria de
Masses, Isidre Casals, Olga Jáuregui, Irene Fernández, Laura Ortiz, Alberto Adeva i
David Bellido, gràcies per la vostra ajuda amb els equips, per la paciència i tot el que he
après de vosaltres.
L’agraïment més gran i sincer és per tu Dolors, has passat de ser la meva directora a
molt més que això, sempre has estat allà recolzant-me, confiant en mi i guiant-me, al
peu del canó, en el bons i mals moments. Ha sigut un plaer compartir tots aquests anys i
lluitar perquè l’aventura de Torribera tirés endavant.
També vull agrair a la Dra. Cristina Minguillón perquè ets una crack, perquè he après
molt treballant amb tu, perquè formem un bon equip i perquè ets de les millors coses
que ens ha passat, tan a mi com al grup, des que estem a Torribera.
Durant tots aquests anys he compartit espai i temps amb molts companys de laboratori,
gràcies a l’Albert, la Laura, la Lorena, la Marta, la Raquel i la Sílvia pel bons moments
del passat. Gracias Pili por enseñarme lo que sabes de masas y darme tu apoyo. Gràcies
a les meves estudiants, Rami i Anna, perquè vosaltres també m’heu ensenyat molt. No
podía olvidarme de mis tres chicos, Pedro, Rafa y Sergio, que hubiera hecho sin
vii
vosotros? Me lo pasé genial, me ayudasteis cuando más lo necesitaba y para mi sois
amigos de verdad. Aquest últim any d’escriptura i estrès no hagués sigut igual sense les
meves nenes, els seus riures i les seves converses. L’Arena, la meva baby, et desitjo el
millor del món perquè t’ho mereixes, no perdis mai aquest somriure. L’Arantxa, la
meva ànega friki preferida, he rigut i he après tantes coses, útils i no tant, amb tu que no
puc imaginar-me aquest últim any sense tu. La Barbara, la meva italiana, eres muy
especial, no lo olvides nunca, conseguirás todo lo que te propongas. Prepara las cosas
que en Agosto estamos allí!! Lara, mi payasita deportista, como me has hecho reír y
como me has ayudado a entenderme a mi misma. A les quatre només em queda dir-vos
amigues per sempre.
A la gent de Torribera, Roberta, Marta, Paola, Arnau, Oriol, Manolo, Maribel, Felipe...i
resta de professors per fer les cosses tant fàcils i crear un bon ambient de treball.
Gracias a la gente del grupo de Ciencias de la vida del departamento de Química

Analítica de la Universidad de Granada por hacer que mi estancia allí se convirtiera en
una gran experiencia. Gracias a la Dra. Noemí Dorival, y especialmente, al Dr. Alberto
Zafra por todo el esfuerzo para que los trabajos de la tesis salieran adelante.
Tampoc no cap dins del meu codi d’ètica no agrair-te tot el que vas fer per mi. Carlos,
part d’aquesta tesis també és teva, pel teu suport, per escoltar-me, per animar-me i tot i
que els nostres camins s’hagin separat, sempre estaràs present.
No es pot arribar al final d’un camí tant llarg sense el suport del amics. A mi maestra y
amiga Miriam, gracias por enseñarme al principio de mi tesis y fuera del grupo, ser una
de las personas más importantes de mi vida. Al resto de las supernenas, Esther y Nuri,
gracias por ser mis amigas y estar ahí. Montse, ets un cel, infinites gràcies pel suport.
Jordi, et veig poc, però sé que sempre estàs allà. Al David, el compi d’anglès, pel format
de la tesis i el suport incondicional.
Per acabar, la família. Gràcies als avis, cosins, tiets i veïns per animar-me. Sílvia, la
meva tieta preferida, infinites gràcies per el teu suport i ajuda i no només en la tesis. Als
pitufos, per haver portat l’alegria. Al Xavier, sempre rient, enfotent-te de mi, però
sempre sempre amb mi, t’estimo Tete. Gràcies als papes perquè confieu en mi, més que
jo mateixa, perquè m’ajudeu cada dia i perquè m’estimeu tant.
viii
Abreviaturas y acrónimos
ABREVIATURAS Y ACRÓNIMOS
AA Aminoácido
AMOX Amoxicilina
AMPI Ampicilina
APCI Ionización química a presión atmosférica
Arg Arginina
CAD Collisionally activated dissociation
CCα Límite de decisión
CCβ Capacidad de detección
CE Collision energy
CI Ionización química
CIN Cinoxacina
CIP Ciprofloxacina
CLOX Cloxacilina
CUR Curtain gas
DAN Danofloxacina
DICL Dicloxacina
DLLME Microextracción líquido-líquido dispersiva
DP Declustering potential
d-SPE Extracción en fase sólida dispersiva
DT Durante el tratamiento
EIC Extracted ion chromatogram
EMA European medicines agency
ENO Enoxacilina
ENR Enrofloxacina
EP Entrance potential
ix
ESI Ionización por electroespray
FD Detección por fluorescencia
FDA Food and drug administration
FLU Flumequina
FP Focusing potential
FWHM Full width at half maximum
Gln Glutamina
Glu Ácido glutámico
Gly Glicina
HAc Ácido acético
HCD Higher Energy Collision Dissociation
HFo Ácido fórmico
HRMS Espectrometría de masas de alta resolución
HRMS Espectrometría de masas de alta resolución
IS Ionspray
IT Analizador de trampa de iones
LC Cromatografía de líquidos
LC-LTQ-Orbitrap Cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas

con analizador trampa de iones lineal y orbitrap
LC-MS/MS Cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas

en tándem
LC-MSn Cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas

en tándem de orden n
LC-QqQ Cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas

con analizador de triple cuadrupolo
LC-ToF Cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría de masas

con analizador de tiempo de vuelo
LC-UV Cromatografía de líquidos acoplada a detección ultravioleta
x
LEX Cefalexina
LLE Extracción líquido-líquido
LOD Límite de detección
LOM Lomefloxacina
LON Cefalonio
LOQ Límite de cuantificación
Lys Lisina
m/z Relación masa carga
MAE Extracción por microondas
MAR Marbofloxacina
MeCN Acetonitrilo
MeOH Metanol
MISPE Molecularly imprinted solid phase extraction
MMIPs Magnetic molecularly imprinted polymer
MOX Moxifloxacina
MRL Límite máximo de residuos
MRM Multiple reaction monitoring
MS Espectrometría de masas
MSPD Matrix solid phase dispersive
NAFC Nafcilina
NEB Gas nebulizador
NOR Norfloxacina
Oasis HLB Adsorbente de fase polimérica con grupos nitrogenados
OFL Ofloxacina
OXAC Oxacilina
OXO Ácido oxolínico
PCA Análisis por componentes principales
xi
PENG Penicilina G (Bencilpenicilina)
PER Cefoperazona
Phe Fenilalanina
PI Patrón interno
PIP Ácido pipemídico
PIPE Piperacilina
PIR Cefapirina
PIRO Ácido piromídico
PLE Extracción por líquidos presurizados
PP Precipitación de proteínas
Pro Prolina
PSA Aminas primarias y secundarias
PT Post-tratamiento
QqQ Analizador de masas de triple cuadrupolo
QuEChERS Quick, Easy, Cheap, Effective, Robust, Simple
QUI Cefquinoma
R2 Coeficiente de determinación
RSD Desviación estándar relativa
S/N Relación señal ruido
SBSE Stir bar sorptive extraction
Ser Serina
SIM Single ion monitoring
SPE Extracción en fase sólida
TIC Total ion chromatogram
TIO Ceftiofur
ToF Analizador de masas de tiempo de vuelo
TPs Productos de transformación
xii
Tyr Tirosina
UCP Unidad de corrección de población
UE Unión europea
UHPLC Cromatografía de líquidos de alta presión
UHPLC-MS/MS Cromatografía de líquidos de alta presión acoplada a la

espectrometría de masas en tándem
UHT Ultra High Temperature
USE Extracción por ultrasonidos
UV Detección ultravioleta
ZOL Cefazolina
xiii
Índice
Índice
ÍNDICE
CAPÍTULO 1: Introducción 1
1.1. Antibióticos: Definición y clasificación 3
1.1.1. β-lactamas: penicilinas y cefalosporinas 5
1.1.2. Quinolonas 8
1.2. Uso y legislación de antibióticos en veterinaria 11
1.3. La leche 19
1.4. Determinación de β-lactamas y quinolonas en leche 20
1.5. Espectrometría de masas 28
1.6. Diseño experimental 34
CAPÍTULO 2: Objetivos 41
CAPÍTULO 3: Desarrollo y validación de métodos para la

determinación de antibióticos en leche de vaca por LC-
MS/MS 45
3.1. Comparative study of the LC–MS/MS and UPLC–MS/MS for the

multi-residue analysis of quinolones, penicillins and cephalosporins in
cow milk, and validation according to the regulation 2002/657/EC. 51
3.2. Multiclass method for the determination of quinolones and β-lactams, in

raw cow milk using dispersive liquid–liquid microextraction and ultra
high performance liquid chromatography–tandem mass spectrometry. 61
3.3. Simultaneous determination of quinolone and β-lactam residues in raw

cow milk samples using ultrasound-assisted extraction prior to
UHPLC−MS/MS analysis. 77
xvii
Índice
CAPÍTULO 4: Determinación y caracterización de productos de

transformación y metabolitos de antibióticos en leche
por espectrometría de masas de alta resolución (HRMS) 105
4.1. Identification of Metabolites and Thermal Transformation Products of

Quinolones in Raw Cow’s Milk by Liquid Chromatography Coupled to
High-Resolution Mass Spectrometry. 109
4.2. High resolution mass spectrometry in the identification of

transformation products and metabolites from β-lactam antibiotics in
thermally treated milk. 127
4.3. Study of metabolome modification in cow milk after enrofloxacin

administration by liquid chromatography coupled with high resolution
mass spectrometry 153
CAPÍTULO 5: Resultados y discusión 177
5.1. Tratamiento de muestra 179
5.2. Separación cromatográfica 183
5.3. Optimización de los parámetros del QqQ 185
5.4. Parámetros de calidad de los métodos validados 187
5.5. Análisis de muestras de leche 190
5.6. Optimización de los parámetros del ToF y Orbitrap 192
5.7. Búsqueda de TPs y metabolitos 193
5.7.1. Quinolonas 194
5.7.2. β-lactamas 203
5.8. Análisis por componentes principales (PCA) 206
CAPÍTULO 6: Conclusiones 209
CAPÍTULO 7: Bibliografía 217
xviii
CAPÍTULO 1
Introducción
Capítulo 1
1. INTRODUCCIÓN
1.1. ANTIBIÓTICOS: DEFINICIÓN Y CLASIFICACIÓN
Tradicionalmente, un antibiótico es cualquier sustancia de origen natural que a bajas

concentraciones es capaz de matar o inhibir el crecimiento de los microorganismos,
generalmente bacterias, que pueden dañar al organismo huésped. A diferencia de los
antibióticos, el término antimicrobial hace referencia a una sustancia de origen natural,
sintético o semisíntetico. En la actualidad, ambos términos se usan indistintamente.
Los antibióticos se pueden clasificar según su actividad y espectro, su mecanismo de

acción y por su estructura, siendo esta última la más utilizada. Por su actividad, los
antimicrobiales, se pueden dividir en bactericidas, que matan a los microorganismos, o
bacteriostáticos, que inhiben el crecimiento de las bacterias [1].
Las bacterias se dividen en dos grandes grupos, dependiendo de la composición de su

pared celular. Estas pueden ser distinguidas usando el procedimiento de tinción de
Gram, que consiste en diferenciar las bacterias según la capacidad o no de retener un
determinado tinte y mantenerlo después de limpiarlo con alcohol. Como puede
observarse en la Figura 1.1, las bacterias Gram-positivas (Gram (+)) constan de
membrana citoplasmática recubierta de una pared celular formada por una gruesa capa
de peptidoglicanos que les confiere una gran resistencia y es la responsable de retener el
tinte durante la tinción de Gram. En cambio, las Gram-negativas (Gram (-)) tienen una
segunda capa lipídica que impide la tinción de las bacterias. Esta diferencia entre
bacterias Gram (+) y Gram (-) permite la clasificación de los antibioticos según su
espectro de actividad, como de amplio espectro si actúan sobre bacterias Gram (+) y
Gram (-), o de espectro reducido si solamente actúan sobre un único tipo de bacterias
[1].
3
Introducción
Pared de Gram (-) Pared de Gram (+)
Figura 1.1. Esquema de la estructura de la pared celular de bacterias Gram (-) y Gram (+) [2].
Los antibióticos se clasifican también según sus estructuras químicas debido a que
suelen presentar patrones similares de efectividad, modo de acción, toxicidad y alergias.
Las familias de antibióticos se citan a continuación en orden alfabético:
aminoglucósidos, β-lactamas, fenicoles, fosfoglicolípidos, ionóforos, lincosamidas,
macrólidos, nitrofuranos, nitroimidazoles, polipéptidos y glicopéptidos, quinolonas,
quinoxalinas, sulfonamidas y tetraciclinas. En apartados posteriores, se trataran con
detalle las familias de antibióticos que han sido objeto de estudio durante la presente
tesis doctoral, β-Lactamas y quinolonas.
Los antibióticos también se agrupan en función del mecanismo de acción, es decir,

dependiendo de los procesos de metabolismo de la bacteria contra la que actúan como
se puede observar en la Figura 1.2. En primer lugar, estos fármacos pueden interferir
inhibiendo la enzima responsable de la síntesis de la capa de peptidoglicanos de la pared
celular bacteriana, causando la muerte de la célula (β-Lactamas y fosfoglicolípidos).
Otros antibióticos inhiben la síntesis proteica de las bacterias actuando sobre las dos
subunidades que forman los ribosomas (30S y 50S). La unión con la subunidad 30S
provoca lecturas erróneas del ARN mensajero (mARN) y la producción de polipéptidos
anormales que actúan como bactericidas (Fenicoles, glicopéptidos, glicosamidas y
macrólidos). Cuando se unen a la subunidad 50S se inhibe la síntesis y elongación de
nuevas proteínas (Aminoglucósidos y tetraciclinas). La membrana citoplasmática es
fundamental para la regulación del medio intercelular de la bacteria. Algunos
4
Capítulo 1
antibacterianos modifican ciertas proteínas responsables del transporte de nutrientes y la

eliminación de tóxicos modificando el metabolismo bacteriano y distorsionando la
permeabilidad de la membrana (Polipéptidos). Ciertos compuestos actúan sobre la
síntesis de ácidos nuclicos, ya que inhiben enzimas, como las topoisomerasas (ADN
girasa) y las ARN polimerasas, impidiendo la replicación y transcripción del ADN
respectivamente (Nitroimidazoles, quinolonas y quinoxalinas). Por último, la síntesis de
los ácidos fólico y folínico necesarios para la formación de proteínas estructurales y la
hemoglobina también puede verse inhibida por acción de los antibióticos
(Sulfonamidas) [1,3,4].
PABA
Inhibición metabolismo
del ácido fólico
Inhibición síntesis DHF A
de proteínas
THF A Inhibición ADN girasa
(Replicación ADN)
Ribosomas
ADN
mARN
Membrana celular
Inhibición ARN polimerasa

Inhibición síntesis
pared bacteriana
Figura 1.2. Mecanismos de acción de los antibióticos sobre las bacterias.
1.1.1 β-LACTAMAS: PENICILINAS Y CEFALOSPORINAS
Las β-lactamas son la familia de antibióticos más antigua y más usada tanto en medicina
humana como veterinaria. Su nombre procede del anillo β-lactámico de cuatro
miembros presente en todas las moléculas de la familia que le confieren la acción
antimicrobiana. Dependiendo de las cadenas laterales del núcleo de los β-lactámicos y
de sus efectos, se pueden encontrar distintos subgrupos: penicilinas, cefalosporinas,
carbapenémicos y monobactamas. Penicilinas y cefalosporinas son con diferencia los
5
Introducción
grupos de β-lactamas más usadas y serán las que se estudiarán en la presente tesis
doctoral.
La estructura básica de las penicilinas y cefalosporinas está formada por la unión del
anillo β-lactámico fusionado a un anillo tiazolidínico de 5 miembros en el caso de las
penicilinas y a un anillo de dihidrotiazina de seis miembros en las cefalosporinas, como
se observa en la Figura 1.3.
O O O
O R3
(A) (B)
O R3 O 4
3
7 4 8 5 3
X
N 2 N R2
O O
2
6 5 7 6
S1 S1
N N
R1 H R1 H
Figura 1.3: Estructura básica de penicilinas (A) y cefalosporinas (B).
Los antibióticos β-lactámicos son bactericidas que como se ha comentado

anteriormente, actúan bloqueando los procesos de síntesis y reparación de la pared
bacteriana, al unirse a las enzimas encargadas de catalizar la formación de los
peptidoglicanos (transpeptidasa) de la pared bacteriana. Como resultado, se forma una
pared defectuosa que no puede mantener el equilibrio osmótico, lo que produce la
entrada de agua del exterior y la lisis de la célula. Debido a que estos antibióticos actúan
durante la fase de reproducción celular, etapa en la que tiene lugar la síntesis de la pared
bacteriana, no son efectivos contra formas latentes, ni contra gérmenes que no tengan
pared bacteriana (por ejemplo, micoplasmas) [5,6].
En 1928, Alexander Fleming observó que una de sus placas de cultivo había sido
contaminada por una colonia de hongos y que las bacterias que rodeaban la colonia
habían inhibido su crecimiento. Aisló el hongo, del género Penicillium, y demostró que
había producido una sustancia antibacteriana que denominó penicilina. Entre 1938-
1941, Florey y Chain aislaron la penicilina producida por el hongo y llevaron a cabo los
primeros ensayos clínicos que demostraron su eficacia y baja toxicidad [6,7].
6
Capítulo 1
La primera penicilina natural fue la bencilpenicilina (PENG). Aunque es activa frente a

un amplio espectro de microorganismos, su escasa absorción en el tubo digestivo y la
sensibilidad a las β-lactamasas bacterianas hicieron necesario la preparación de nuevas
penicilinas sintéticas, mediante la modificación de su cadena lateral. De este modo, en
la actualidad se dispone de penicilinas que se pueden administrar vía oral, ya que
resisten la hidrólisis ácida del estómago, con un espectro de acción más amplio y
resistentes a la acción de las β-lactamasas producidas por las bacterias.
El segundo grupo más importante de β-lactamas, las cefalosporinas, fueron descubiertas

en los años 40 por el científico italiano Giuseppe Brotzu. Brotzu observó el bajo nivel
de microorganismos en las aguas cercanas a la emisión de aguas residuales y lo
relacionó con la presencia de un organismo que producía una sustancia antibacteriana.
Dicho organismo era el hongo llamado Cephalosporiun acremonium que sintetizaba la
cefalosporina C [7]. Esta nueva familia de antibióticos, a diferencia de las penicilinas
son más resistentes a la hidrólisis ácida y a la acción de las enzimas β-lactamasas.
Las cefalosporinas se clasifican en 4 generaciones en función de sus características

antimicrobianas. Las cefalosporinas de primera generación tienen menor actividad que
las penicilinas. Son muy activas sobre cocos Gram (+) y debido a su baja absorción por
la pared intestinal son administradas por vía parenteral. Algunas cefalosporinas
pertenecientes a esta primera generación son cefapirina, cefalotina, cefalonio, cefalexina
y cefazolina [7].
Las cefalosporinas de segunda generación tienen un sustituyente metoxi en la posición

7, que les confiere más estabilidad frente a las β-lactamasas. En general, los antibióticos
de esta generación pierden cierta eficacia sobre Gram (+), pero la ganan sobre las
bacterias Gram (-), en comparación con las cefalosporinas de la generación anterior.
Ejemplos de cefalosporinas de segunda generación son cefaclor, cefamandol y
cefuroxina [7].
La tercera generación de cefalosporinas son resultado de la adición de un anillo

aminotiazol como sustituyente, con el fin de aumentar la penetración de dichos
antibióticos en la membrana de las bacterias Gram (-). En consecuencia, esta generación
tienen una elevada actividad contra este tipo de bacterias y actividad variable respecto a
7
Introducción
las Gram (+). Cefotaxima, cefixima, cefoperazona y ceftiofur son algunas

cefalosporinas de esta generación [7].
La última generación de cefalosporinas se caracteriza por tener formas zwitteriónicas,

que facilitan la penetración en la membrana externa de las bacteria Gram (-). De esta
forma, la cefalosporinas de cuarta generación son las más activas frente las bacterias
Gram (-) y las Gram (+). Forman parte de dicha generación cefquinoma, ceftecol y
cefazopran entre otras [7].
Las bacterias pueden desarrollar resistencia a los β-lactámicos mediante tres

mecanismos distintos. El primero de ellos y más común, especialmente en Gram (-)
aunque también se puede observar en Gram (+) y anaerobios, es la producción de β-
lactamasas que son enzimas que hidrolizan el anillo β-lactámico y en consecuencia
inactivan el antibiótico antes de su unión a la enzima transpeptidasa que interviene en la
síntesis de la pared celular. Ciertas bacterias producen las enzimas β-lactamasas de
forma natural y aumentan su producción por inducción, es decir, que ésta aumenta tras
la exposición a β-lactámicos. Otras en cambio, sufren mutaciones que generan bacterias
capaces de generar β-lactamasas. Esta mutación es transferida a través de plásmidos, es
decir, pequeñas fracciones circulares de ADN bacteriano. El siguiente mecanismo de
resistencia usado por las bacterias, es la modificación de determinadas partes de la
enzima transpeptidasa que disminuye su afinidad a las β-lactamas y en consecuencia la
síntesis de la pared celular no se ve alterada. Por último, se pueden modificar la
permeabilidad de la membrana celular y las bombas de expulsión en bacterias Gram (-).
Las sustancias poco lipofílicas como los β-lactámicos, necesitan poros que les faciliten
la entrada al espacio periplasmático a través de la membrana para poderse unirse a las
transpeptidasas, pero algunas alteraciones de la permeabilidad pueden modificar la
resistencia a la entrada de las β-lactamas [5,7].
1.1.2. QUINOLONAS
Las quinolonas son antibióticos sintéticos cuya estructura está constituida por un núcleo
piridona-β-ácido carboxílico fusionado a un anillo aromático (Figura 1.4).
8
Capítulo 1
O O
5 4
R2
6 3
OH
2
7
R3 8
N1
R1
Figura 1.4: Estructura básica de las quinolonas.
Las quinolonas tienen un grupo carboxílico en la posición C3 y otro grupo ceto en C4,
que son fundamentales para la unión de la molécula con las topoisomerasas de las
bacterias.
La unión con las enzimas topoisomerasas es esencial para la duplicación del ADN. La
inhibición de la topoisomerasa II, también llamada ADN-girasa, responsable del
enrollamiento del ADN y de la topoisomerasa IV, encargada de separar la parte
replicada del ADN, interrumpe la replicación y la transcripción del ADN-bacteriano,
provocando la muerte de la célula [8,9].
A principios de los años 60, al realizar la síntesis de la cloroquina, agente antimalárico,

Lescher et al. descubrieron la actividad antibacteriana de uno de los subproductos
llamado ácido nalidíxico. Esta primera quinolona presentaba una baja penetración
intracelular y un reducido espectro de actividad y en consecuencia su uso se limitó al
tratamiento de infecciones urinarias provocadas por bacterias Gram (-) [10].
Con el fin de mejorar su eficacia y aumentar su espectro de acción, se realizaron

modificaciones en determinadas posiciones de la estructura básica de las quinolonas. La
modificación más importante que se llevó a cabo, fue la incorporación de un átomo de
flúor en la posición 6 que dio lugar a la familia de las fluoroquinolonas. Este grupo de
quinolonas supuso un aumento muy significativo a nivel de actividad antibacteriana y
penetración intracelular. Tanto fue así que actualmente, prácticamente la totalidad de
quinolonas usadas para usos terapéuticos son 6-fluoroquinolonas [10,11].
Otras posiciones modificadas que repercutieron en la mejora de las quinolonas fueron

N1, C5 y C7. Los sustituyentes de la posición N1 aumentan la actividad in vitro contra
patógenos intracelulares y simultáneamente favorecen las propiedades farmacocinéticas
9
Introducción
de la molécula. El sustituyente más importante en dicha posición corresponde al grupo

ciclopropil, aunque el anillo bencénico mono o difluorado ofrece también buenos
resultados. Respecto a la posición C5, los sustituyentes amino y metilo muestran un
incremento en la actividad sobre las bacterias Gram (+). Los sustituyentes del C7 están
asociados al espectro de acción, biodisponibilidad y efectos secundarios. En general, las
quinolonas con grupos lineales o pequeños suelen tener menor eficacia en comparación
con las quinolonas que poseen anillos heterocíclicos de cinco o seis eslabones
(Piperazina, pirrolidina…) [10,11].
Las quinolonas se clasifican en cuatro generaciones. Las quinolonas de una misma

generación tienen estructuras y espectro de acción similares, que irán aumentando a
medida que tienen nuevas generaciones [9-11]. Las quinolonas de primera generación
son las más antiguas y su estructura básica se caracteriza por la ausencia del átomo de
flúor en la posición C6. Presentan un reducido espectro antibacteriano (bacterias Gram
(-)) y son usadas básicamente en infecciones urinarias. Además del ácido nalidíxico, la
flumequina, la cinoxacina, los ácidos oxolínico, piromídico y pipemídico forman parte
de esta primera generación.
Las quinolonas de segunda generación se caracterizan por la presencia del átomo de

flúor en la posición 6 y de un grupo piperazina o metil-piperazina como sustituyente en
la posición 7. Su espectro antibacteriano se amplía respecto a las quinolonas de primera
generación, siendo eficaces sobre otras bacterias Gram (-), gérmenes multiresistentes a
cefalosporinas, penicilinas y aminoglucósidos, microbacterias y algunos patógenos
atípicos. En esta generación encontramos quinolonas como ciprofloxacina,
norfloxacina, lomefloxacina, ofloxacina, enoxacina y otras usadas únicamente en
veterinaria como enrofloxacina, difloxacina y sarafloxacina.
La tercera generación recoge quinolonas que se caracterizan por la presencia de grupos

cíclicos aminados en C7, típicamente aminopirrolidinas y grupos azabiciclo, además de
sustituciones en las posiciones C5 y C8. Su espectro de actividad cubre las Gram (-),
como las quinolonas de segunda generación y se expande a bacterias Gram (+) y
atípicas. Forman parte de esta generación quinolonas como grepafloxacina,
sparfloxacin, levofloxacina, tosufloxacina, danofloxacina y marbofloxacina.
10
Capítulo 1
Las quinolonas de cuarta y última generación se diferencian de las de la tercera porque

actúan además sobre bacterias anaerobias. En este grupo están la moxifloxacina,
gatifloxacina y trovafloxacin entre otras.
El mecanismo de resistencia más común de las quinolonas es la mutación del ADN

girasa (topoisomerasa II) en bacterias Gram (-) y la topoisomerasa IV en Gram (+), que
causa la reducción de la afinidad con las quinolonas disminuyendo su actividad
antibacteriana. El segundo mecanismo consiste en el aumento de actividad de las
bombas de la membrana, que expulsan los antibióticos de la célula reduciendo la
concentración de las quinolonas y en consecuencia su actividad [1].
1.2. USO Y LEGISLACIÓN DE ANTIBIÓTICOS EN VETERINARIA
Los antibióticos se usan en medicina veterinaria en dosis terapéuticas para curar

infecciones y a concentraciones mucho más bajas para prevenirlas, uso profiláctico, o
como promotores del crecimiento, aunque este último uso está prohibido en la Unión
Europea (UE) desde 2006 [12]. En el año 2012 se vendieron más de 8.000 toneladas
(Tm) de antibióticos usados para el tratamiento de animales destinados al consumo
humano como alimentos, en los 26 estados de la UE. Entre ellos, casi 1.700 Tm de
ingredientes activos fueron vendidos en España. El principal indicador aplicado en el
informe de la Agencia Europea del Medicamento (EMA), para expresar el consumo de
antimicrobianos veterinarios, es el ingrediente activo en mg normalizado por la unidad
de corrección de población (mg / UCP). La UCP se calcula multiplicando el número de
animales de cada especie con el peso normalizado para cada una de ellas. Usando este
indicador se observan grandes diferencias entre los distintos estados de la UE, siendo
Noruega el país que menos antibióticos consume con 3.8 mg / UCP y Chipre el que más
con 396.5 mg / UCP. A España le correspondería una cuarta posición con 242.0 mg /
UCP, después de Chipre, Italia y Hungría. Las tetraciclinas, penicilinas y sulfonamidas
representaron el 70% de las ventas de antibióticos en la UE en 2012 expresadas en mg /
UCP [13]
Los residuos de cualquier medicamento veterinario, en general, son sustancias

farmacológicamente activas (ya sean principios activos, excipientes, productos de
degradación o metabolitos), que permanecen en los alimentos provenientes de animales
11
Introducción
que han sido medicados. La presencia de residuos de antibióticos en muestras

alimentarias de origen animal supone un riesgo para la salud de los consumidores. Estos
residuos pueden provocar problemas de alergias y toxicidad en individuos sensibles.
Otro gran problema de salud pública, referente a los antibióticos, es la generación de
resistencia bacteriana en el animal, que puede ser transmitida por ingestión al ser
humano.
Con el fin de proteger la seguridad alimentaria del consumidor, la UE estableció en la

Regulación 2377/90/EC [14], unos límites máximos de residuos (MRL), es decir,
concentraciones máximas de fármaco que pueden estar presentes en los alimentos de
origen animal, para que sean seguros para el consumo humano. Los MRLs varían en
función de los distintos tejidos y tipo de ganado. Inicialmente, en la regulación se
clasificaban las sustancias farmacológicamente activas en cuatro anexos
correspondientes a: I) Sustancias con MRL fijados; II) Sustancias no sometidas a MRL;
III) Sustancias con MRL provisional; y IV) Sustancias que no tienen ningún MRL
fijado, ya que a cualquier concentración suponen un peligro para la salud del
consumidor. Esta Directiva ha sido modificada varias veces y la última actualización
corresponde a la Regulación 37/2010/EU [15]. En esta última versión, los fármacos su
organizan en dos grupos distintos, los permitidos y los prohibidos. En el caso de las
sustancias permitidas, pueden estar presentes en las muestras alimentarias siempre y
cuando su concentración sea inferior al MRL fijado por la legislación. Para las
sustancias prohibidas, la UE establece un principio de tolerancia cero [1]. Los MRL
fijados para las β-lactamas y las quinolonas reguladas se recogen en la siguiente Tabla
1.1.
12
Capítulo 1
Tabla 1.1: Valores de MRL de β-lactamas y las quinolonas regulados por la Unión
Europea.
Nombre y estructura química Especie MRL Matriz

animal
PENICILINAS
Amoxicilina (AMOX)
O Todas las 50 μg/kg Músculo
O
OH
especies 50 μg/kg Grasa
N
destinadas a 50 μg/kg Hígado
50 μg/kg
O
HO la producción Riñón
NH S de alimentos 4 μg/kg Leche
NH2
Ampicilina (AMPI)
O
OH
N
50 μg/kg
O
la producción Riñón
NH S de alimentos 4 μg/kg Leche
NH2
Bencipenicilina (PENG)
Todas las 50 μg/kg Músculo
50 μg/kg
O
OH
especies Grasa
O destinadas a 50 μg/kg Hígado
O
N
la producción 50 μg/kg Riñón
S
de alimentos 4 μg/kg Leche
NH
Cloxacilina (CLOX)
300 μg/kg
OH
O especies Grasa
O
N destinadas a 300 μg/kg Hígado
NH S
Cl
N
O
13
Introducción

animal
Dicloxacilina (DICL)
300 μg/kg
OH
O especies Grasa
Cl
O
NH S
Cl
N
O
Fenoximetilpenicilina (PENV) 25 μg/kg Músculo

O Porcinos 25 μg/kg Hígado
OH 25 μg/kg Riñón
O
N
O
S
25 μg/kg Músculo
O N
H Aves de 25 μg/kg Piel / grasa
corral 25 μg/kg Hígado
25 μg/kg Riñón
Nafcilina (NAFC)
O
300 μg/kg Músculo
300 μg/kg
OH
O Grasa
Todos los
N 300 μg/kg Hígado
O rumiantes
300 μg/kg Riñón
NH S
30 μg/kg Leche
Oxacilina (OXAC)
300 μg/kg
OH
O especies Grasa
O
NH S
N
O
14
Capítulo 1

animal
CEFALOSPORINAS
Cefalexina (LEX)
O OH 200 μg/kg Músculo
O
200 μg/kg Grasa
N Bovinos 200 μg/kg Hígado
O
1000 μg/kg Riñón
NH S 100 μg/kg Leche
NH2
Cefalonio (LON)
O OH
O
N N
Bovinos 20 μg/kg Leche
O
NH S
S NH2
Cefapirina (PIR)
O OH
O
O 50 μg/kg Músculo
O
N O
50 μg/kg Grasa
Bovinos
S
100 μg/kg Riñón
60 μg/kg
S NH
Leche
Cefazolina (ZOL)
O OH
N
N
O Bovinos,
O
N S S ovinos y 50 μg/kg Leche
N N caprinos
NH S
N N
15
Introducción

animal
Cefoperazone (PER)
O OH
N
N
O N
O N S N
O O
H S
N N NH
N
OH
Cefquinoma (QUI)
50 μg/kg
O OH
Bovinos, Músculo
O porcinos y 50 μg/kg Grasa
O
N N
Équidos 100 μg/kg Hígado
S
S
200 μg/kg Riñón
20 μg/kg
NH
H2N N
Bovino Leche
N
O
Ceftifur (TIO)
Todas las
O OH
1000 μg/kg Músculo
O especies
O 2000 μg/kg Grasa
mamíferas
N S 2000 μg/kg Hígado
O destinadas a
S O 6000 μg/kg Riñón
la producción
100 μg/kg
NH S
Leche
H 2N N de alimentos
N
O
QUINOLONAS
Ácido oxolínico (OXO)

O O
Todas las 100 μg/kg Músculo
O
OH
O N la producción 150 μg/kg Riñón
de alimentos
16
Capítulo 1

animal
Bovinos,
200 μg/kg Músculo
Danofloxacina (DAN) ovinos,
100 μg/kg Grasa
caprinos y
O O
400 μg/kg Hígado
aves de
F 400 μg/kg Riñón
OH corral
N N Bovinos,
N ovinos y 30 μg/kg Leche
caprinos
100 μg/kg Músculo
Suma de: Bovinos, 100 μg/kg Grasa
ovinos y 300 μg/kg Hígado
Enrofloxacina (ENR)
caprinos 200 μg/kg Riñón
O O
100 μg/kg Leche
F
OH
100 μg/kg Músculo
Porcinos y 100 μg/kg Grasa
N N conejos 200 μg/kg Hígado
N 300 μg/kg Riñón
100 μg/kg Músculo
Aves de 100 μg/kg Piel y grasa
Ciprofloxacina (CIP) 300 μg/kg Riñón
O O
Todas las
F
OH
demás 100 μg/kg Músculo
N N destinadas a 200 μg/kg Hígado
HN la producción 200 μg/kg Riñón
de alimentos
400 μg/kg Músculo
Bovinos,
100 μg/kg Grasa
ovinos y
1400 μg/kg Hígado
caprinos
800 μg/kg Riñón
Difloxacina (DIF) 400 μg/kg Músculo
O O 100 μg/kg Piel y grasa
Porcinos
F 800 μg/kg Hígado
OH
800 μg/kg Riñón
N N
300 μg/kg Músculo
N
Aves de 400 μg/kg Piel y grasa
600 μg/kg Riñón
Todas las
F
demás 300 μg/kg Músculo
de alimentos
17
Introducción

animal
Flumequina (FLU)
200 μg/kg Músculo
O O Bovinos,
300 μg/kg Grasa
ovinos,
500 μg/kg
F
OH Hígado
caprinos y
1500 μg/kg Riñón
porcinos
N
50 μg/kg Leche
150 μg/kg Músculo

Marbofloxacina (MAR) Bovinos y 50 μg/kg Grasa
O O porcinos 150 μg/kg Hígado
F
150 μg/kg Riñón
OH
N N
N O N
10 μg/kg Piel y grasa

Pollos
100 μg/kg Hígado
Sarafloxacina (SAR)
O O
F
OH
Músculo y
piel en
30 μg/kg
N N
Salmónidos
HN proporción
normal
Tal y como se observa en la Tabla 1.1, los MRL permitidos de β-lactamas y de

quinolonas se encuentran entre 4 – 6000 μg/kg en el caso de las β-lactamas y entre 30 –
1900 μg/kg para las quinolonas. Los MRL fijados en leche son inferiores a los
regulados en otros tejidos animales. Con el fin de determinar los antibióticos en
alimentos de origen animal, es necesario disponer de métodos suficientemente sensibles
para llegar a cuantificar las bajas concentraciones a las que se encuentran los residuos
de estos fármacos. Para garantizar la calidad y comparación de los resultados analíticos
de los laboratorios para el control oficial de residuos, la UE, establece unos criterios
mínimos que deben cumplir los métodos usados para dicha determinación. Estos
criterios para la validación de un método analítico se recogen en la normativa
2002/657/CE [16]. En la normativa se indica que los métodos cromatográficos sin el
18
Capítulo 1
uso de la espectrometría de masas como detección no son adecuados como métodos

confirmatorios y que estos deben incluir al menos 4 de puntos de identificación. Los
parámetros de calidad que deben ser determinados son: la veracidad, la precisión entre
muestras preparadas un mismo día (Intra-day) y días distintos (Inter-day), el límite de
decisión (CC α ) y la capacidad de detección (CC β ). La Food Drug Administration (FDA)
sugiere otros parámetros en la validación de métodos bioanalíticos, como son los límites
de detección (LOD) y los de cuantificación (LOQ) [17].
1.3. LA LECHE
La leche es un alimento del que se producen más de 750 millones de toneladas anuales y
es consumido por más de 6.000 millones de personas en el mundo [18]. La leche de
vacuno representa la mayor parte del total de la producción lechera mundial, siendo de
un 83%, seguido por la leche de búfala (13%), cabra (2%), oveja (1%) y camello
(0.3%). A nivel europeo la producción de leche de vaca aumenta hasta el 97 % del total.
La leche es una fuente importante de energía y nutrientes esenciales. La composición

de la leche puede variar en función de la especie del animal lechero, su raza, edad y
dieta, junto con el estado de lactancia, el número de partos, el sistema agrícola, el
entorno físico y la estación del año [18]. La composición promedio de la leche de vaca
consiste en un 88 % de agua, 3.4 % de proteínas, 3.6 % de lípidos, 4.6 % de hidratos de
carbono (principalmente lactosa) y 0.7 % de minerales (calcio, fósforo, magnesio, cloro,
azufre, hierro, zinc, cobre) [19]. Además contiene vitaminas (Vitamina A, Carotenos,
Vitaminas del complejo B, Vitaminas D, E y C en menor cantidad) de muy alta
disponibilidad necesarios para la nutrición humana. La suma de todos estos nutrientes
hacen de la leche en un alimento especialmente importante en periodos de crecimiento y
desarrollo (infancia y adolescencia) y en situaciones fisiológicas concretas (embarazo y
lactancia). Su consumo también contribuye al buen mantenimiento de la masa ósea en el
adulto y en el anciano.
La leche puede ser consumida como leche líquida o en forma de derivados, tanto sin
fermentar como fermentados. Dentro de los productos sin fermentar, además de la leche
líquida, podemos encontrar la mantequilla y la crema de leche. En cambio, entre los
derivados fermentados más populares están los yogures y los quesos.
19
Introducción
La leche antes de ser consumida debe ser sometida a un tratamiento térmico con el fin
de eliminar los microorganismos patógenos. Distintos tratamientos térmicos pueden ser
aplicados, como son la pasteurización y la esterilización. Dentro de la pasteurización
podemos diferenciar dos condiciones térmicas que pueden ser aplicadas. La primera
consiste en calentar la leche a temperaturas de 72 a 75 ºC por espacio de 15 a 20 s, para
luego ser enfriada a temperaturas de refrigeración (4 a 5 ºC). Durante este proceso
térmico se eliminan todas las bacterias patógenas. El segundo tratamiento es conocido
como UHT que es la abreviatura en inglés de Ultra High Temperature y consiste en un
proceso térmico de flujo continuo, en el que la leche se somete a temperaturas de 135 a
140 ºC durante 2-4 s, para luego enfriarla a temperatura ambiente, lográndose así la
destrucción de todos los microorganismos vivos, incluyendo esporas. Este proceso
mantiene intactas las propiedades organolépticas de la leche y sobre todo su calidad
nutritiva.
Durante el proceso de esterilización, la leche se calienta temperaturas de
aproximadamente 120 ºC, por espacio de 10 a 20 min, proceso que se realiza en
autoclave, una vez que la leche es envasada. Este tratamiento elimina todos los
microorganismos patógenos, incluyendo las esporas. Sin embargo, por el tiempo de
exposición al calor y a temperaturas altas, se alteran algunas propiedades
organolépticas, como el color y sabor y también puede haber alteración en su valor
nutritivo [20].
1.4. DETERMINACIÓN DE β-LACTAMAS Y QUINOLONAS EN LECHE
Como se ha comentado en el apartado anterior 1.2, para garantizar la seguridad de los

consumidores, la UE estableció los MRL de residuos antibióticos en alimentos de
origen animal, como es el caso de la leche. La leche es una matriz biológica compleja,
muy rica en proteínas, lípidos y glúcidos, que pueden interferir a la hora de determinar
los residuos de antibióticos. Debido a que las cantidades máximas de residuos reguladas
en leche son muy pequeñas, entre 4-100 µg L-1 en el caso de las β-lactamas y entre 30-
100 µg L-1 para las quinolonas, es necesario hacer un tratamiento de muestra previo al
análisis, con el fin de limpiar la matriz de interferentes y en ciertos casos pre-concentrar
los analitos para que puedan ser detectados.
20
Capítulo 1
En la bibliografía se pueden encontrar un considerable número de artículos donde se

describen distintos métodos para determinar antibióticos en leche. En la Tabla 1.2, se
muestran solamente las publicaciones más relevantes encontradas sobre el análisis target
de β-lactamas y quinolonas en leche. Los artículos están ordenados en orden
cronológico desde 2004. En la tabla se recogen los analitos determinados, la matriz
donde se han estudiado, el tratamiento de muestra aplicado y la técnica de análisis
utilizada en la determinación de los antibióticos.
Tabla 1.2: Revisión de los artículos de análisis de β-lactamas y quinolonas en leche.
Tratamiento de
Compuestos Matriz Determinación Ref.
muestra
AMOX, AMPI, PENG, Leche cruda de
PENV, OXAC, CLOX, vaca
LC-MS/MS
NAFC, DICL, PIR, PP + SPE [22]
(QqQ)
DAPIR, LEX, LON, QUI, Músculo y riñón
ZOL, PER bovino
Leche de vaca
ENR, CIP, SAR, DAN,
SPE LC-MS/MS (IT) [48]
OXO, FLU, DIF, MAR
Músculo bovino
Leche cruda de
ENR, CIP, SAR, DAN,
vaca SPE + SPE CE-MS/MS (IT) [49]
OXO, FLU, DIF, MAR
ENO, OFL, NOR, CIP,

Leche de vaca
DAN, ENR, SAR, OXO, PP + SPE LC-UV [23]
comercial
NAL, FLU
PENV, AMPI, OXAC,
NAFC, CLOX, DICL,
NAL, OXO, FLU, NOR,
CIP, LOM, ENR, MAR, Leche cruda de UHPLC-MS [24]
PP + SPE
DIF, DAN, SAR, 10 vaca (ToF)
Macrólidos, 16
Sulfonamidas, 4
Tetraciclinas, 48 Otros
LC-UV
LC-FD
MAR, CIP, DAN, ENR, Leche de vaca
SPE LC-MS (QqQ) [50]
FLU comercial
LC-MS/MS
(QqQ)
MAR, CIP, DAN, ENR, Leche de vaca
PP + LLE LC-MS (Q) [25]
SAR, DIF, OXO, FLU comercial
MAR, DAN, ENR, DIF,
2 Sulfonamidas, 3
Leche de vaca UHPLC-MS/MS
Macrólidos, 1 QuEChERS [60]
comercial (QqQ)
Tetraciclina,
8 Otros
21
Introducción
Tratamiento de
muestra
AMPI, PIR, CLOX,
PENG, ENR, SAR, 2
Leche cruda de LC-MS/MS
Macrólidos, 4 PP + SPE [26]
vaca (QqQ)
Tetraciclinas, 8
Sulfonamidas, 5 Otros
AMOX, AMPI, CLOX,
Leche cruda de LC-MS/MS
DICL, OXAC, PENG, Online SPE [51]
vaca (QqQ)
ZOL, TIO, PER, LEX
AMOX, AMPI, PENG,
PENV, OXAC, CLOX,
NAFC, DICL, PIR, TIO,
DCCD, QUI, LON, ZOL,
LEX, PER, MAR, NOR, Leche cruda de LC-MS/MS
PP [27]
CIP, DAN, ENR, SAR, vaca (QqQ)
DIF, OXO, NAL, FLU,
9 Sulfonamides, 10
Macrólidos, 4
NOR, CIP, OFL, ENR, Leche de vaca LC-MS/MS
PP + SPE [28]
RUF comercial (QqQ)
Leche de vaca
AMOX, AMPI, PENG, comercial
nano-LC-MS/MS
PENV, OXAC, CLOX, PP + SPE [29]
(IT)
NAFC, DICL Hígado y riñón de
cerdo
MAR, CIP, DAN, ENR,
DIF, OXO, FLU, NAL,
ENO, OFL, LOM, NOR,
SAR, CIN, 7
Leche de vaca LC-MS/MS
Tetraciclinas, 12 PP + SPE [30]
comercial (QqQ)
Sulfonamidas, 10
Macrólidos, 3 Otros
25 β-lactamas, 14
Quinolonas, 25
Leche cruda de PP + UHPLC-MS
Sulfonamidas, 10 [31]
vaca Ultrafiltración (ToF)
Macrólidos, 6
LC-UV
AMOX, AMPI, CLOX,
Leche de vaca LC-MS (QqQ)
DICL, NAFC, PENG, PP + SPE [32]
comercial LC-MS/MS
PENV, OXAC
(QqQ)
PIP, MAR, FLE, ENO,
PAZ, OFL, PEF, NOR,
CIP, DAN, LOM, ENR, UHPLC-MS/MS
Leche de vaca PP + SPE [33]
DIF, SAR, GAT, SPAR, (QqQ)
MOX, CIN, OXO, NAL,
FLU, NAD
22
Capítulo 1
Tratamiento de
muestra
MAR, ENR, DAN, DIF,
1 Tetraciclina, 4 Leche de vaca UHPLC-MS/MS
QuEChERS [61]
Sulfonamidas, 4 comercial (QqQ)
Leche de vaca LC-MS/MS (Q-
PENV, AMOX, OXAC MMIPs [53]
comercial Trap)
CIP, SAR, PENG, AMPI,
LC-MS (Q-ToF)
CLOX, PIR, 8 Leche de vaca PP +
LC-MS/MS [34]
Sulfonamidas, 4 comercial Ultrafiltración
(Q-ToF)
ENO, PER, NOR, ENR, Leche de vaca PP + IL-based
LC-UV [35]
2 Sulfonamidas comercial HLLME
MAR, ENO, PAZ, FLE,
OFL, NOR, CIP, LOM, Leche de vaca LC-MS/MS
PP + online SPE [36]
DAN, ENR, ORB, SAR, cruda y comercial (Q-Trap)
DIF, SPAR, OXO, FLU
PP + USE-
AMOX, AMPI, CLOX, Leche de vaca
MSPD- LC-UV [37]
OXAC, DICL, 3 Otros comercial
QuEChERS
QuEChERS
CIP, ENR, DIF, SAR, Leche de vaca
Capillary-LC-LIF [54]
DAN, OXO, FLU comercial
MISPE
Leche de vaca
FIX, TAX PP + DLLME LC-UV [38]
comercial
LEX, PIR Leche de vaca PP + MISPE LC-UV [39]
TIO, PENG, PENV, LC-MS/MS
Leche de vaca PP + LLE [40]
OXAC, CLOX, DICL (QqQ)
AMPI, PIR, PER, CLOX,
DICL, OXAC, 12 PP [41]
comercial (QqQ)
AMOX, AMPI, PIPE,
PENV, OXAC, CLOX,
NAFC, DICL, LON, PIR,
ZOL, PIP, MAR, OFL,
PEF, ENO, NOR, CIP,
Leche cruda de UHPLC-MS/MS
ENR, DAN, LOM, ORB, PP + PP [42]
vaca (QqQ)
DIF, SPAR, CIN, OXO,
NAL, FLU, 24
Sulfonamidas, 10
Tetraciclinas, 10
Leche cruda de
ENR, CIP PP + SPE CE-UV [43]
vaca
PP + 3
FLU, SAR, CIP, ENR, Leche de vaca Capillary-LC-
Extracciones con [44]
DIF, OFL comercial UV-MS (Q)
buffer
LC-UV
TIO, CIP, NOR, ENR, Leche de vaca LC-Fl
PP [45]
DAN, 6 Sulfonamidas comercial LC-MS/MS
(QqQ)
23
Introducción
Tratamiento de
muestra
Leche de vaca
AMOX, AMPI, PENG, LC-MS/MS
SBSE [66]
OXAC, CLOX, DICL (QqQ)
Miel
TIO, URO, DRO, CLO,
LEX, ZOL, OFL, CIP,
Leche de vaca USE-MSPD- LC-MS/MS
ENR, DAN, OXO, PER, [58]
comercial QuEChERS (QqQ)
NAL, FLU, ENO, NOR,
SAR
CIP, ENR, MAR, OXO,
FLU, NOR, NAL, DAN,
Leche cruda de
OFL, ENO, CIN, 4 UHPLC-MS/MS
vaca, cabra y PP [46]
Tetraciclinas, 4 (QqQ)
oveja
Macrólidos, 13
Sulfonamidas
LEX, QUI, TIO, CET,
LON, PIR, ZOL, PER, SPE [52]
comercial (QqQ)
RAD, TAX, DAPIR
17 Quinolonas, 13 β-
lactamas, 24
Leche de vaca UHPLC-MS [68]
Sulfonamidas, 6 SOSLE
comercial (Q-Orbitrap)
Tetraciclinas, 26
Microesferas
magnéticas LC-MS/MS
LEX, ZOL, PER Leche de vaca [67]
recubiertas con (Q-Trap)
C18
PENG, AMPI, AMOX,
OXAC, CLOX, DICL, UHPLC-MS/MS
Leche de vaca MISPE [55]
LEX, PIR, 1 Sulfonamida, (QqQ)
1 Tetraciclina
Leche de vaca
NOR, CIP, OFL MISPE LC-UV [56]
comercial
Leche de vaca
CIP, ENR, NOR, NAL,
cruda y comercial
SAR, DIF, FLU, OXO, LC-MS/MS
PP [47]
DAN, 12 Sulfonamidas, 4 (QqQ)
Hígado de vaca y
Tetraciclinas
de pollo
AMOX, AMPI, 2 Leche de vaca
QuEChERS LC-MS (IT-ToF) [62]
Tetraciclinas, 1 Otro cruda y comercial
CET: Cefacetrilo; DAPIR: Desacetilcefapirina; DCCD: Desfuroyl ceftiofurcysteine disulfide; DRO:

Cefadroxilo; FIX: Cefixima; Fl: Fluorescencia; FLE: Fleroxacina; GAT: Gatifloxacina; IL-based
HLLME; LIF: Laser induced fluorescence; MISPE: Molecularly imprinted solid phase extraction;
MMIPs: Magnetic molecularly imprinted polymer; MSPD: Matrix solid phase dispersive; NAD:
Nadifloxacina; ORB: Orbifloxacina; PAZ: Pazofloxacin; PEF: Pefloxacina; PP: Precipitación de
proteínas; RAD: Cefradina; RUF: Rufloxacina; SBSE: Stir bar sorptive extraction; SOSLE: Salting out
supported liquid extraction; SPAR: Sparfloxacina; TAX: Cefotaxima; URO: Cefuroxima.
24
Capítulo 1
Como se puede observar en la tabla anterior, una amplia variedad de métodos para la
extracción de quinolonas y β-lactamas han sido aplicados en leche en los últimos años.
Los tratamientos de muestra más usados coinciden con las técnicas clásicas como son la
extracción líquido-líquido (LLE) y extracción en fase sólida (SPE). Se incluyen además
una etapa de precipitación de proteínas (PP). En la PP, las proteínas se desnaturalizan
tanto con disolventes orgánicos (generalmente MeCN y MeOH) como con ácido o base
fuertes, con el fin de que no interfieran en el análisis de los antibióticos [21]. La PP ha
sido usada en más de la mitad de los artículos, tanto como única etapa de tratamiento de
muestra, o bien como etapa previa a la extracción y/o clean-up con otra técnica [22-47].
La SPE ha sido la técnica más usada durante muchos años para la extracción de
antibióticos en muestras alimentarias, ya que se dispone de un gran surtido de sorbentes
que nos permiten retener una amplia variedad de analitos con distintas propiedades
físico-químicas. La SPE presenta muchas ventajas, ya que limpia la matriz de
interferentes que no se retienen en el cartucho, a la vez que permite la pre-concentración
de los compuestos de interés, que suelen encontrarse a niveles traza. Por contra, se trata
de una técnica laboriosa y tediosa [22-24,26,28-30,32,33,36,43,48-52].
Como se puede observar en la tabla, en los últimos 5 años ha habido un aumento muy
significativo del uso de nuevas técnicas de extracción, coincidiendo con un descenso de
trabajos realizados con las técnicas más clásicas. Con el fin de aumentar la especificidad
de la extracción, algunos autores trabajan con polímeros de imprenta molecular (MIPs)
[39,53-56]. Durante la síntesis de los MIPs se emplean moléculas con estructura y
grupos funcionales parecidos a los analitos que se quieren determinar. Estas moléculas,
denominadas template, actúan de molde y una vez generado el polímero, se eliminan
dejando huecos que pueden ser ocupados por los analitos durante la etapa de extracción.
Los MIPs se pueden usar como sorbentes en la SPE, dando lugar a la técnica conocida
como extracción en fase sólida por impresión molecular (MISPE) [21,57]. Debido a la
gran especificidad que aportan estos polímeros durante la extracción, no pueden usarse
para determinar simultáneamente compuestos cuyas estructuras difieran mucho entre sí,
es decir, en métodos que analizan clases de antibióticos distintos.
Otra técnica usada para la extracción de quinolonas y β-lactamas en leche, es la

dispersión de matriz en fase sólida (MSPD). La técnica consiste en homogenizar la
muestra con un agente dispersivo con el fin de aumentar el área superficial y de esta
manera mejorar la extracción. Normalmente, la mezcla homogenizada se empaqueta
25
Introducción
dentro de un cartucho y se realiza la extracción como si se tratara de la SPE clásica

[37,57,58].
La extracción en fase sólida dispersiva (d-SPE) es otra variante de la SPE llamada

también QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, Effective, Robust, Simple). La metodología
QuEChERS se basa en una primera etapa de partición de los analitos entre una fase
orgánica y otra acuosa al añadir un exceso de sales seguido de un clean-up por d-SPE.
A diferencia de la SPE, los sorbentes utilizados en la etapa dispersiva retienen los
interferentes de la matriz, mientras que los compuestos de interés permanecen en
disolución. Aunque se trata de una técnica que inicialmente fue desarrollada para
determinar pesticidas en agua [59], debido a sus múltiples ventajas, como que es una
técnica rápida y con bajo consumo de disolvente, se está usando en la determinación de
una amplia variedad de antibióticos en muestras alimentarias [60-62].
Como puede observarse en la Tabla 1.2, y siguiendo con lo comentado anteriormente,

en los últimos años los métodos analíticos desarrollados se han dirigido hacia métodos
eficientes, más sencillos experimentalmente y miniaturizados con el fin de reducir el
consumo de muestra y disolventes para ser menos agresivos con el medio ambiente
[63,64]. Siguiendo estas premisas, actualmente se pueden encontrar métodos derivados
de la LLE clásica como son la microextracción en fase líquida (LPME). Con dicha
técnica, la extracción tiene lugar entre un volumen muy pequeño (µL) de un disolvente
orgánico inmiscible en agua y la muestra acuosa que contiene los analitos [65]. Un
importante número de variantes del método se han descrito para la determinación de
antibióticos, especialmente en muestras ambientales, como la microextracción líquido-
líquido homogénea (HLLME), microextracción en una única gota (SDME) y la
microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME) entre otras y que también han sido
probadas en matriz de leche [35,38].
La ultrafiltración, aplicada después de la PP, es el tratamiento de muestra más sencillo

que se describe en la bibliografía. Con esta técnica no se concentran los analitos ni se
eliminan muchos de los interferentes procedentes de la matriz. Por todo ello, este
procedimiento es aplicado solo en métodos de screening [31,34]. También se ha
descrito la extracción de antibióticos usando la extracción por adsorción en barrita
magnética (SBSE). La técnica se basa en la partición de los analitos entre la matriz y el
recubrimiento de la barrita magnética [21,66]. Es un método sencillo y rápido pero tiene
26
Capítulo 1
muchas limitaciones, ya que actualmente se dispone de muy pocos recubrimientos

comerciales disponibles.
Por último, también se han utilizado técnicas de extracción mucho menos frecuentes
para determinar antibióticos en leche, como es el caso del uso de microesferas
magnéticas con recubrimiento de C18 y una variante de la LLE en la que el contacto
entre el disolvente de extracción y la muestra líquida depositada sobre un soporte sólido
está facilitado por el efecto del salting out (SOSLE) [67,68].
En todos los artículos recogidos en la Tabla 1.2, se presentan métodos multiresiduos, es

decir, que se determinan más de una sustancia simultáneamente. En más de la mitad de
los trabajos recopilados, los compuestos analizados pertenecen a una única familia de
antibióticos, quinolonas o β-lactamas. Con respecto al resto de artículos, se tratan de
métodos multiclase, ya que se analizan simultáneamente antibióticos de más de una
familia (quinolonas, β-lactamas, sulfonamidas, macrólidos, tetraciclinas…) y otros tipos
de fármacos como los antiinflamatorios no esteroides, tranquilizantes…
La técnica separativa más ampliamente usada para el análisis de los antibióticos en

muestras de leche es la cromatografía de líquidos convencional (LC) [22,23,25-
28,30,32,34-40,45,47,48,50,51,53,56,58,62,66,67], aunque en los últimos años se ha
observado un aumento del uso de otras técnicas cromatográficas más rápidas que
permiten mejorar la resolución de los picos, la sensibilidad y el tiempo de análisis,
como es la cromatografía líquida de ultra alta presión (UHPLC) [24,31,33,41,42,
46,52,55,60,61,68]. En menor proporción se usan la cromatografía líquida capilar
(capillary-LC) y la nano cromatografía de líquidos (nano-LC) [29,44,54]. De todos los
trabajos recogidos en la Tabla1.2, solamente dos usan electroforesis capilar (CE) previa
a la detección de los compuestos [43,49].
Las técnicas de detección utilizadas en los artículos son principalmente la detección

ultravioleta (UV) [23,32,35,37-39,43-45,50,56] y la espectrometría de masas (MS)
[22,24-34,36,40-53,55,58,60-62,66-68]. Tradicionalmente la detección UV ha sido
ampliamente usada debido a su disponibilidad y bajo coste. Con el fin de aumentar la
sensibilidad en la detección de los antibióticos en necesaria una etapa de pre-
concentración durante el tratamiento de muestra. Las quinolonas absorben en el UV
debido a los múltiples enlaces conjugados presentes en su estructura, mientras que en el
caso de las β-lactamas la absorción es mucho menor. Cuando dichos compuestos son
27
Introducción
analizados en matrices más complejas, como puede ser el caso de la leche de vaca, la
señal de los analitos puede ser interferida por otros compuestos de la matriz, que
coeluyen cromatográficamente, dando lugar a posibles errores tanto cualitativos como
cuantitativos.
En los últimos años se ha experimentado un gran avance en el desarrollo de la MS. Más

del 80 % de los trabajos sobre determinación de antibióticos en leche recogidos en la
Tabla 1.2, usan la MS como técnica de detección, ya que nos permite tener sensibilidad
y especificidad, es decir, distinguir entre la señal debida a nuestros analitos y los
interferentes de la matriz, mejor que otras técnicas como la detección UV y la
fluorescencia. El analizador de masas más usado en los análisis target de antibióticos es
por excelencia, el triple cuadrupolo (QqQ) [22,26-28,30,32,33,40-42,45-47,50-
52,55,58,60,61,66]. El espectrómetro con analizador de QqQ puede trabajar en dos
modos SIM y MRM, aunque es con éste último con el que se obtiene la mejor
sensibilidad. La trampa de iones (IT), aunque es menos sensible, también se usa para el
análisis target de fármacos analizados en modo masas en tándem [29,48,49]. Los
espectrómetros de masas de alta resolución (HRMS), como son los ToF, Q-ToF y
Orbitrap, son equipos que empiezan a usarse con más frecuencia en este tipo de
aplicaciones, ya que se obtiene mejor selectividad de los analitos, debido a que se
obtienen las masas exactas con errores inferiores a 5 ppm [24,31,34,62,68]. Por el
contrario, la sensibilidad de dichos analizadores es inferior a la obtenida con QqQ
trabajando en modo MRM.
1.5. ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La determinación de residuos de fármacos en muestras alimentarias, como por ejemplo

leche, requiere de métodos de detección suficientemente sensibles como la
espectrometría de masas (MS). La MS es una técnica analítica basada en la separación
de iones formados en una fuente de ionización, en función de su relación masa-carga
(m/z). Para la determinación de una gran variedad de compuestos orgánicos, como los
antibióticos, en matrices complejas como la leche, se suele acoplar a técnicas
separativas como la cromatografía de líquidos (LC) o la cromatografía de líquidos
rápida (UHPLC). La fuente de ionización más usada en este tipo de análisis es la
ionización por electroespray (ESI), aunque también se usan técnicas de ionización
28
Capítulo 1
química (CI) y a presión atmosférica (APCI). En el caso del ESI, al eluyente que sale
del sistema cromatográfico se le aplica un potencial muy elevado generándose un tren
de gotas cargadas, tal como se muestra en la Figura 1.5. La posterior evaporación de las
moléculas neutras de disolvente de dichas gotas cargadas por acción de una
contracorriente de N 2 , produce la disminución del tamaño de éstas y la correspondiente
concentración de cargas. Cuando la tensión superficial de las gotas es superada por las
fuerzas de repulsión electroestática de estas cargas, se produce la denominada explosión
culómbica, dando lugar a iones en fase gas. Se trata de una técnica de ionización suave
y los iones formados suelen derivar de la protonación o desprotonación de las moléculas
y formar iones positivos mono o multicargados como [M+nH]+n. También pueden
formarse aductos con otros iones que puedan encontrarse en la fase móvil usada en el
sistema cromatográfico.
+ -
+ + +
+ +
+ + ++ + +
Explosión + + + + +
- - ++ ++ + Culómbica + + +
+ + ++ + +
+ + + +
+
++ + + +
+- + + - + + + +
+ + + +
+
+ ++ +
+
+ +
Gas
nebulizador
(N2) Analito
N2 caliente Gas cortina
Figura 1.5: Representación esquemática de ionización por electroespray (ESI).
Para abordar la determinación de residuos de antibióticos se pueden seguir diferentes

estrategias realizando análisis dirigidos (target) o no dirigidos (non-target), requiriendo
en ambos casos analizadores de MS diferentes.
El análisis target está basado en la monotorización de unas determinadas relaciones m/z

correspondientes a los compuestos de interés. Esta es la estrategia más usada para la
determinación de los residuos de antibióticos en muestras alimentarias. El analizador de
masas más ampliamente usado para el análisis target es por excelencia el triple
cuadrupolo (QqQ). El QqQ consta de tres cuadrupolos en serie y cada uno de ellos está
formado por cuatro barras alargadas en formación cuadrada, conectadas eléctricamente
29
Introducción
entre sí en pares opuestos (Figura 1.6). Los potenciales aplicados sobre las barras,
provocan fuerzas perpendiculares a la dirección del movimiento de los iones a través de
las barras y los iones responden a estas fuerzas oscilando en el plano x-y, con
frecuencias que dependen de su relación m/z y con trayectorias que dependen de la
amplitud de radiofrecuencia de los potenciales aplicados. Únicamente los iones con una
determinada m/z tienen una trayectoria que les permite llegar al detector a través de las
cuatro barras. El resto de iones con m/z mayor o menor se desvían de su camino y
colisionan o salen a través de las barras. En el QqQ, el primer y tercer cuadrupolo (Q1 y
Q3) seleccionan unos determinados iones. El cuadrupolo central (Q2) actúa como celda
de colisión donde se fragmentan los iones provenientes de Q1 [1].
Fuente de
ionización Detector
+ + +
- - - - -
-
+ + +
Q1 Q2 Q3
Figura 1.6: Diagrama del espectrómetro de masas QqQ.
El QqQ es un espectrómetro de baja resolución (resolución la unidad) que se usa en

modo de masas en tándem (MS/MS o MS2), debido a su capacidad para generar datos
cuantitativos con una gran sensibilidad, selectividad, repetitividad y un amplio intervalo
de linealidad. Con dicho espectrómetro se puede trabajar de cuatro modos distintos que
están recogidos de forma esquemática en la Figura 1.7. La primera es la técnica
conocida por Multiple Reaction Monitoring (MRM) que consiste en la monitorización
de un ión precursor seleccionado en Q1, que es posteriormente fragmentado en la celda
de colisión y un determinado ión producto se selecciona en Q3. En este modo de trabajo
se obtiene la máxima sensibilidad y es por ello el más usado para la confirmación y
cuantificación de analitos. A pesar de trabajar en baja resolución, el QqQ también puede
ser útil a la hora de obtener información estructural para la identificación o
caracterización de los compuestos. Para lograr este fin es necesario trabajar con el modo
30
Capítulo 1
Product Ion Scan, que consiste en monitorizar un ión precursor en Q1 que será
fragmentado en Q2 y en Q3 se escanean y registrarán todos los iones fragmentos
provenientes de Q2. El tercer modo es el llamado Precursor Ion Scan donde se hace un
barrido de m/z en Q1, dichos iones se fragmentan en la celda de colisión y en el Q3 se
registra una determinada relación m/z. De este modo se detectan compuestos que dan el
mismo ión producto y que en consecuencia podrían ser compuestos con estructuras
relacionadas. Por último, en el Neutral Loss Scan se puede escanear todos los iones en
el Q1, que después de fragmentarse en Q2, se vuelven a escanear en Q3 con una
determinada diferencia de masa, correspondiente a una pérdida neutra. Esta técnica se
puede usar para cribar compuestos que tienen características estructurales específicas
que pierden un ión sin carga durante la fragmentación [69].
Q1 Q2 Q3
Multiple Reaction
Monitoring (MRM)
m/z seleccionadas m/z seleccionadas
Product ion scan
m/z seleccionadas Escaneo m/z
Precursor ion scan
Escaneo m/z m/z seleccionadas
Neutral loss scan
Escaneo m/z = x Escaneo m/z = x - a
Figura 1.7: Modos de trabajo del QqQ.
El análisis non-target permite detectar cualquier compuesto presente en la muestra. Así

se puede detectar o identificar compuestos cuya presencia no se esperaba, tales como
metabolitos, productos de transformación e impurezas. En este caso los espectrómetros
31
Introducción
de masas de alta resolución (HRMS) con analizador de tiempo de vuelo (ToF) o bien
Orbitrap, suelen ser los más utilizados [70].
En un analizador de tiempo de vuelo (ToF), los iones generados en la fuente de

ionización son acelerados por medio de un pulso de potencial eléctrico, lo que
proporciona a todos los iones del paquete una misma energía cinética. Las partículas
aceleradas pasan entonces a un tubo analizador, sobre el que no actúa ningún campo,
haciendo que sus velocidades en el tubo dependan de su relación m/z. Así pues, los
iones ligeros llegarán al detector antes que los más pesados. En la Figura 1.8, se muestra
un esquema del funcionamiento del ToF. Los instrumentos más modernos contienen un
reflectron para distinguir entre las pequeñas diferencias en las velocidades de los iones
con muy semejante m/z, aumentando de este modo la resolución del equipo. Los
espectrómetros de masas con analizador ToF ofrecen un poder de resolución alto (≤
40.000 FWHM), medidas de masa exacta (< 5 ppm), gran velocidad y elevado intervalo
de m/z durante el escaneo, excelente sensibilidad al registrar en full-scan, permitiendo
obtener espectros de masas muy completos. Debido a que los datos se registran en full-
scan, las muestras pueden ser analizadas de forma retrospectiva en busca de nuevos
compuestos [1].
Reflecton
Detector
Fuente de
ionización
Pusher
Figura 1.8: Diagrama del analizador de masas ToF.
32
Capítulo 1
El analizador Orbitrap consiste en un electrodo exterior con forma de barril y un

electrodo interior coaxial, con forma de huso, que forma un campo electrostático con
distribución potencial cuadro-logarítmica. Los iones son inyectados tangencialmente en
un campo eléctrico entre los electrodos y quedan atrapados porque su atracción
electrostática hacia el electrodo interior es contrarrestada por la fuerza centrífuga. De
esta manera los iones con una específica relación m/z dan vueltas y se mueven delante y
detrás simultáneamente a través del eje del electrodo central. La frecuencia de estas
oscilaciones armónicas genera el espectro de masas usando la transformada de Fourier.
El analizador Orbitrap funciona con paquetes de iones, es decir, de forma discontinua,
mientras que la corriente de iones generados en la fuente es continua. Con el fin de
solucionar esta incompatibilidad, se dispone de una trampa de iones (IT), que almacena
los iones antes de enviarlos de forma pulsada al Orbitrap (Figura 1.9). En esta clase de
equipos pueden realizarse análisis en modo full-scan o Product Ion Scan. El aislamiento
y fragmentación de los iones precursores puede tener lugar en la IT o en la celda de
colisión cuadrupolar (HCD) presente también en el equipo y analizados en el Orbitrap
en alta resolución.
Figura 1.9: Diagrama del espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap (Thermo Scientific).
El espectrómetro de masas de Orbitrap ofrece un elevado poder de resolución (hasta

150.000 FWHM), gran sensibilidad, medidas de masa exacta (< 5 ppm) y amplios
intervalos dinámico y de m/z [71]. Dicho espectrómetro permite realizar MSn y obtener
la masa exacta de los iones productos siendo de gran utilidad para la elucidación
estructural de compuestos desconocidos.
33
Introducción
1.6. DISEÑO EXPERIMENTAL
Tradicionalmente, las mejores condiciones para la extracción de analitos en distintas

matrices se han obtenido optimizando las distintas variables o factores que influyen
individualmente, es decir, variando una de ellas y manteniendo el resto constantes.
Siguiendo este procedimiento univariante, las condiciones óptimas de la extracción no
pueden ser alcanzadas si existe interacción entre las distintas variables que se estudian.
Además de este inconveniente, la optimización univariante aumenta el número de
experimentos a llevar a cabo y en consecuencia, un aumento en el consumo de tiempo,
reactivos y disolventes [72]
Con el fin de solucionar estos problemas, el uso de técnicas estadísticas multivariantes

para la optimización de los procedimientos analíticos es de gran utilidad. Se pueden
seguir distintos caminos a la hora de abordar el problema como son el análisis
exploratorio, el cribado de factores y el estudio cuantitativo tanto de factores como de
respuesta.
El primer paso que suele realizarse es seleccionar las variables que pueden influir en la
eficacia del procedimiento analítico y el intervalo de estudio para cada una de ellas.
Cuando un proceso involucra un gran número de factores es necesario identificar
aquellos que pueden afectar significativamente en la respuesta. Con este fin se llevan a
cabo diseños de cribado o screening y se aplican en las primeras fases del proceso para
descartar factores considerados inicialmente y que tengan poco o ningún efecto sobre la
respuesta y así simplificar el diseño. Entre los diseños de cribado están los factoriales y
factoriales fraccionados. Los diseños factoriales nos permiten obtener información de
las variables más influyentes y las interacciones entre ellas, pero el número de
experimentos a realizar es mayor y el estudio de los resultados más complicado. En
cambio, los diseños factoriales fraccionados, como es el caso del diseño Plackett-
Burman (diseño fraccionado de dos niveles), nos permiten conocer qué factores son más
influyentes con un menor número de experimentos, aunque no nos ofrece información
entre las interacciones que pueden existir [73,74]. Para identificar los factores que más
influyen en la variación de los resultados experimentales se usa un método gráfico
conocido como Diagramas de Pareto (Figura 1.10).
34
Capítulo 1
B
Variables
+
D -
0 1 2 3
Efecto estandarizado
Figura 1.10: Diagrama de Pareto
En este diagrama, las variables y las interacciones posibles aparecen en el eje y,

mientras el valor del efecto estimado estandarizado es representado en el eje x. Estos
efectos, para cada variable, aparecen como una barra horizontal, cuya longitud es
proporcional al valor absoluto del efecto estimado, mientras que también se incluye una
línea vertical de referencia que corresponde al intervalo de confianza especificado
(habitualmente del 95%). El efecto se considera significativo si su valor sobrepasa esta
línea de referencia, mientras que los signos positivo y negativo revelan los casos en que
la respuesta es disminuida o incrementada, respectivamente, cuando se pasa del nivel
más bajo al más alto de una variable específica [74].
Una vez identificados los factores influyentes, las condiciones óptimas del proceso se
obtienen aplicando un diseño experimental más complejo. Entre las técnicas más usadas
se encuentra la metodología de superficie de respuesta, que consiste en buscar el ajuste
de los datos experimentales a una ecuación polinomial con el fin de describir el
comportamiento de una serie de datos para poder hacer previsiones estadísticas. Dicha
técnica es muy útil ya que permite obtener las condiciones óptimas de un procedimiento
analítico que dependa de varios factores debido a que evalúa la interacción entre ellos
[72,75]. El modelo más simple que se puede emplear en la metodología de superficie de
respuesta es la función lineal o de primer orden el cual no tiene en cuenta las
interacciones. En el caso de querer evaluar la curvatura del sistema se usa un modelo
cuadrático o de segundo orden y es necesario que cada variable se estudie al menos a
35
Introducción
tres niveles distintos. La selección de estos diseños depende de las características del
problema, pero deben cumplir, en general, ciertos requerimientos como la capacidad
para realizar estimaciones eficientes de los coeficientes del modelo y medir tanto el
error experimental como la posible falta de ajuste. Existen otras propiedades que a veces
se pueden conseguir como son la rotabilidad y ortogonalidad. Un diseño es rotable si la
desviación estándar de la respuesta predicha es constante en todos los puntos que están a
la misma distancia del centro del diseño. Debido a que generalmente se desconoce la
localización del óptimo antes de llevar a cabo los experimentos, es interesante que el
diseño proporcione estimaciones igualmente precisas en todas las direcciones. Un
diseño es ortogonal cuando los coeficientes estimados en el modelo ajustado no están
correlacionados entre sí, dicho de otro modo, cuando los factores son independientes
[76].
Distintos diseños experimentales de segundo orden pueden ser aplicados. Los más
utilizados son el diseño central compuesto, el diseño Box-Behnken y el diseño Doehlert,
siendo este último el aplicado en la presente tesis doctoral. El diseño de Doehlert
describe un dominio experimental esférico y destaca la uniformidad en el llenado del
espacio. A pesar de no ser un diseño rotable ni ortogonal, los resultados que ofrece son
de calidad para su uso efectivo. El diseño Doehlert para dos factores consiste en un
punto central y seis puntos formando un hexágono regular. En este diseño, no todos los
factores se evalúan con el mismo número de niveles. En general, es preferible evaluar el
factor más influyente con más niveles, con el fin de obtener la máxima información del
sistema [73]. Como en cualquier diseño experimental, es necesario tener puntos
centrales que sirven para examinar la presencia de la curvatura, dar información acerca
de los efectos cuadráticos y estimar la magnitud del error experimental.
Una vez realizados los experimentos del diseño, es necesario comprobar que el modelo
se ajusta, es decir, describe el comportamiento de los datos experimentales. Para ello, se
realiza un análisis de varianza (ANOVA) en el que se compara la variación debida al
tratamiento (cambio en la combinación de los niveles de las variables) con la variación
causada por los errores aleatorios inherentes a las mediciones de las respuestas. Para que
un modelo se ajuste a los datos experimentales tiene que mostrar una buena capacidad
de predicción. Un modelo es de buena calidad y se ajusta cuando no existe falta de
ajuste significativa (lack of fit) y los coeficientes estimados son influyentes, dicho de
otra manera, que la variación de las respuestas se deben a la variación de los factores
36
Capítulo 1
influyentes y no a la del error aleatorio de las medidas, que se puede considerar

despreciable [72]. Otro parámetro que se puede evaluar para conocer el ajuste del
modelo a los datos experimentales es el coeficiente de determinación (R2), donde un
valor de R2 muy cercano a 1.0 indica que la regresión se ajusta perfectamente a los
datos.
El valor óptimo o punto crítico de las condiciones experimentales se suele identificar a

partir de la superficie de respuesta obtenida a partir del modelo. En el caso de los
modelos de segundo orden, el punto crítico suele estar caracterizado por un máximo, un
mínimo o un punto silla. En muchas ocasiones, cuando se optimizan las condiciones de
extracción de más de un analito, suele suceder que las condiciones óptimas no coinciden
para todos. Para ello, se debe buscar una solución de compromiso que satisfaga lo mejor
posible la extracción simultánea de todos ellos. Para alcanzar las condiciones óptimas,
se usa un procedimiento numérico para calcular la deseabilidad que representa la
calidad global del compromiso. Se obtienen las funciones de deseabilidad individuales
para cada analito y a continuación se genera la función de deseabilidad global, como
combinación de las anteriores.
Los diseños experimentales permiten evaluar el comportamiento de los analitos frente a

un grupo de factores así como su optimización, reduciendo el número de experimentos a
realizar y el tiempo dedicado a ello.
En la presente tesis doctoral se han optimizado tres métodos para la determinación de β-

lactamas y quinolonas en muestras de leche de vaca y validado según la normativa
Europea 2002/657/CE y la guía de la FDA. El primer método desarrollado permite la
determinación de 21 antibióticos, β-lactamas y quinolonas reguladas por la UE en
muestras de leche, usando una extracción en fase sólida (SPE) para la preparación de la
muestra. El uso de la SPE permitió conseguir unos LOD y LOQ muy bajos, debido a la
limpieza de la matriz y pre-concentración de los analitos. El método se validó tanto por
LC-QqQ como por UHPLC-QqQ.
Otro método, desarrollado y validado por UHPLC-QqQ, se estableció usando la

microextracción líquido-líquido dispersiva (DLLME) para determinar 31 antibióticos en
leche de vaca. Esta técnica dispersiva permite una extracción más rápida de los analitos
en comparación con técnicas clásicas, como la SPE, y usando una cantidad de
disolvente orgánico mucho menor.
37
Introducción
El tercer método que se optimizó y validó se desarrolló utilizando una extracción de 31

antibióticos con una mezcla de disolventes orgánicos y asistida por ultrasonidos (USE).
Para la etapa de clean-up se usó la metodología QuEChERS, que permite la limpieza de
la matriz de forma rápida y gastando poco disolvente orgánico. Este último método
también se validó por UHPLC-QqQ.
Además del desarrollo y validación de métodos analíticos para la determinación de

antibióticos, β-lactamas y quinolonas, en muestras de leche de vaca, durante la tesis
doctoral también se ha estudiado como se metabolizan determinados antibióticos en el
organismo animal y como estos se transforman al aplicar los tratamientos térmicos
usuales (pasteurización y esterilización) para eliminar los microorganismos patógenos
presentes en la leche.
En un primer trabajo, patrones individuales de quinolonas (ENR, CIP, DIF y SAR) en

agua, muestras de leche fortificadas y muestras de leche procedentes de vacas
medicadas con ENR, se sometieron a distintos tratamientos térmicos (120ºC durante 20
y 60 min). Las muestras se analizaron por LC-ToF y por comparación entre los
espectros de MS en full-scan de muestras y blanco, se obtuvieron las masas exactas de
una serie de compuestos presentes en muestras que contenían antibióticos y no en los
blancos. La estructura de dichos compuestos, que corresponden a metabolitos o
productos de transformación debido al tratamiento térmico (TPs), se elucidó a partir de
los espectros de MS/MS de alta resolución obtenidos por LC-LTQ-Orbitrap.
Análogamente en un trabajo posterior, se estudió el efecto de la temperatura de distintos

tratamientos térmicos (60, 72 y 120ºC durante 30 min) sobre los antibióticos β-
lactámicos (AMOX, PENG, PIR y TIO) en patrones individuales y muestras de leche
fortificadas. Además se contó con muestras de leche procedentes de vacas medicadas
con PENG. Se identificaron metabolitos y TPs que no se habían descrito previamente y
se propusieron rutas de degradación térmica y de metabolización.
Para terminar, se estudiaron muestras de leche de vaca medicada con ENR durante todo
un proceso farmacológico de tres días y cuatro días después de la finalización de éste.
Se han analizado las muestras de todo el proceso farmacológico, elucidando las
estructuras de diversos metabolitos y productos de transformación y se ha propuesto una
posible ruta de metabolización de la ENR. Además los datos fueron tratados mediante
38
Capítulo 1
herramientas quimiométricas (PCA), con el fin de clasificar y diferenciar las muestras

de leche entre muestras procedentes de vacas medicadas o sin medicar.
39
CAPÍTULO 2
Objetivos
Capítulo 2
2. OBJETIVOS
Los objetivos que pretende conseguir la presente Tesis Doctoral se centran en dos
aspectos diferentes. El primer aspecto se orienta al desarrollo y validación de métodos
analíticos suficientemente sensibles para permitir la determinación de residuos de
antibióticos (β-lactamas y quinolonas) en muestras de leche de vaca por cromatografía
de líquidos acoplada a la espectrometría de masas en tándem. El segundo aspecto, más
novedoso, se centra en la determinación e identificación de metabolitos y productos de
transformación de β-lactamas y quinolonas derivados, por un lado, del metabolismo
animal y por otro del efecto de los tratamientos térmicos a los que se somete la leche
para la eliminación de patógenos antes de su consumo.
43
CAPÍTULO 3
Desarrollo y validación de métodos para la determinación de

antibióticos en leche de vaca por LC-MS/MS
Capítulo 3
3. DESARROLLO Y VALIDACIÓN DE MÉTODOS PARA LA

DETERMINACIÓN DE ANTIBIÓTICOS EN LECHE DE VACA POR LC-
MS/MS
Todos los trabajos realizados durante esta tesis doctoral se han llevado a cabo usando
leche cruda de vaca como matriz. Debido a que se trata de una matriz compleja y los
residuos de antibióticos en muestras de leche se encuentran a muy bajas
concentraciones, se han estudiado diferentes tratamientos de muestra con el fin de
eliminar interferentes y preconcentrar los analitos. Con el objetivo de que los métodos
desarrollados sean lo suficientemente sensibles para determinar los residuos de
antibióticos en muestras de leche a concentraciones inferiores a los MRL regulados, las
muestras fueron analizadas por cromatografía de líquidos acoplada a la espectrometría
de masas, usando el triple cuadrupolo (QqQ) como analizador. Los métodos fueron
validados según la Normativa Europea 2002/657/CE y la guía de la FDA. Para
finalizar, los tres métodos desarrollados fueron aplicados a muestras de leche
procedentes de vacas medicadas, suministradas por el Laboratori Interprofessional
Lleter de Catalunya (ALLIC).
En un primer artículo, se determinaron simultáneamente las 7 penicilinas, 7

cefalosporinas y 5 quinolonas reguladas en leche por la Normativa 37/2010 de la UE.
Como tratamiento de muestra se usó la técnica clásica de la SPE con distintos cartuchos
de extracción. Se probaron tres métodos descritos en la bibliografía para determinar β-
lactamas, penicilinas y quinolonas respectivamente. El método final fue validado para
dos técnicas de análisis (LC y UHPLC) acopladas a la espectrometría de masas.
También se estimó el efecto matriz en las muestras analizadas por UHPLC-MS/MS.
En los otros dos artículos se han estudiado técnicas de tratamiento de muestra más
sencillas y que reduzcan el tiempo dedicado a este tratamiento y por tanto permitan el
análisis de un número más elevado de muestras al día que cuando se utiliza la SPE. En
el segundo artículo que se presenta en este capítulo, no sólo se analizaron los
antibióticos regulados por la Unión Europea, si no que se amplió el número de
antibióticos a estudiar con compuestos de las familias de las β-lactamas y de las
quinolonas. Así, se describe la extracción de 31 antibióticos (14 β-lactamas y 17
quinolonas) en muestras de leche usando la microextracción líquido-líquido dispersiva
(DLLME). Esta técnica nos permite la extracción de los analitos de una forma más
47
sencilla, rápida y usando menos disolventes que la SPE. Teniendo en cuenta que la
optimización del tratamiento de muestra es una de las etapas más laboriosas y tediosas
en el desarrollo de métodos, para la optimización del método de extracción se utilizaron
herramientas quimiométricas con el fin de conseguir las mejores condiciones para la
extracción haciendo el mínimo número de experimentos. Usando un diseño de cribado
de Plackett-Burman, se evaluó la influencia de los factores que afectaban a la
extracción de los analitos. Las condiciones óptimas de extracción se obtuvieron usando
un diseño Doehlert de superficie de respuesta. Debido a las diferentes propiedades
ácido-base de las dos familias de antibióticos estudiadas, β-lactamas y quinolonas, la
extracción simultánea de todos los analitos no fue posible y se validaron los dos
métodos de extracción propuestos, uno para cada familia de antibióticos.
En el tercer artículo se ha desarrollado un método para extraer 31 antibióticos (14 β-

lactamas y 17 quinolonas) en leche de vaca liofilizada, por extracción con disolvente
orgánico asistida por ultrasonidos (USE). Se optimizó la composición del disolvente de
extracción con un diseño de mezcla y se comprobó la necesidad de usar una etapa de
limpieza del extracto, usando la d-SPE. El último paso en el desarrollo del método de
extracción fue la aplicación de un diseño de Doehlert para establecer las condiciones
óptimas de la extracción de los analitos.
Las publicaciones incluidas en este capítulo son:
 Comparative study of the LC–MS/MS and UPLC–MS/MS for the multi-residue analysis
of quinolones, penicillins and cephalosporins in cow milk, and validation according to
the regulation 2002/657/EC.
A. Junza, R. Amatya, D. Barrón, J. Barbosa.
J. Chromatogr. B 879 (2011) 2601-2610.
 Multiclass method for the determination of quinolones and β-lactams, in raw cow milk
using dispersive liquid–liquid microextraction and ultra high performance liquid
chromatography–tandem mass spectrometry.
A. Junza, N. Dorival-García, A. Zafra-Gómez, D. Barrón, O. Ballesteros, J. Barbosa,
A. Navalón.
J. Chromatogr. A 1356 (2014) 10-22.
48
Capítulo 3
 Simultaneous determination of quinolone and β-lactam residues in raw cow milk

samples using ultrasound-assisted extraction prior to UHPLC−MS/MS analysis.
N. Dorival-García, A. Junza, A. Zafra-Gómez, D. Barrón, A. Navalón.
Food Control (2015) en revisión.
49
Capítulo 3
51
Desarrollo y validación de métodos analíticos
52
Capítulo 3
53
54
Capítulo 3
55
56
Capítulo 3
57
58
Capítulo 3
59
60
Capítulo 3
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62
Capítulo 3
63
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Capítulo 3
65
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Capítulo 3
67
68
Capítulo 3
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70
Capítulo 3
71
72
Capítulo 3
73
Supporting information
MULTICLASS METHOD FOR THE DETERMINATION OF
QUINOLONES AND β-LACTAMS, IN RAW COW MILK USING
DISPERSIVE LIQUID-LIQUID MICROEXTRACTION AND
ULTRA HIGH PERFORMANCE LIQUID CHROMATOGRAPHY-
TANDEM MASS SPECTROMETRY
A. Junza, N. Dorival-García, A. Zafra-Gómez, D. Barrón, O. Ballesteros,
J. Barbosa, A. Navalón
74
Capítulo 3
Figure S01. Response surfaces according to Doehlert experimental design for

selected analytes. Recovery of spiked milk samples is shown as a function of extraction
and dispersive solvent volumes. (A) ENO (amphoteric quinolone), (B) CIN (acidic
quinolone), (C) NAF (β-lactam). Results evaluated using a 95% confidence interval.
75
Table S01. Matrix used for Plackett-Burman design.

A B C D E F
1 1 1 1 -1 1 1
2 1 -1 1 -1 -1 -1
3 -1 -1 -1 1 1 1
4 -1 -1 -1 -1 -1 -1
5 -1 1 1 1 -1 1
6 1 1 -1 1 1 -1
7 0 0 0 0 0 0
8 0 0 0 0 0 0
9 -1 1 1 -1 1 -1
10 -1 -1 1 1 1 -1
11 0 0 0 0 0 0
12 -1 1 -1 -1 -1 1
13 1 -1 -1 -1 1 1
14 1 -1 1 1 -1 1
15 1 1 -1 1 -1 -1
76
Capítulo 3
Simultaneous determination of quinolone and β-lactam residues in

raw cow milk samples using ultrasound-assisted extraction and
dispersive-SPE prior to UHPLC−MS/MS analysis
N. Dorival-Garcíaa, A. Junzab, A. Zafra-Gómeza*, D. Barrónb, A. Navalóna
a
Research Group of Analytical Chemistry and Life Sciences, Department of Analytical
Chemistry, University of Granada, Campus of Fuentenueva, E-18071 Granada, Spain
b
Research Group of Bioanalysis, Department of Analytical Chemistry, Food and Nutrition
Torribera Campus, University of Barcelona, Avda. Prat de la Riba 171, E-08921 Sta. Coloma
de Gramenet, Barcelona, Spain
ABSTRACT
A new sensitive, selective and accurate method to determine 17 quinolone and 14 β-

lactam antibiotic residues in raw cow milk samples has been developed and validated.
The method is based on the extraction of the antibiotics by ultrasound-assisted
extraction (UAE) followed by a clean-up step using a dispersive solid-phase extraction
(d-SPE) sorbent. Parameters such as extraction solvent, volume of extraction solvent,
time of extraction and pH have been optimized by experimental designs. The optimized
extraction solvent was a mixture of acetonitrile/methanol/McIlvaine buffer solution
(60:25:15; v/v/v) at pH 6. An aliquot of 15 mL of this extraction solvent was added to
freeze-dried milk samples and the mixtures were sonicated during 20 min at 70%
amplitude. The extracts were further cleaned-up with PSA (primary-secondary amine)
SPE sorbent and analysed by UHPLC-MS/MS. The method was validated according to
European Directive 2002/657/EC and FDA guideline. Recovery rates ranged from
96.0% to 104.5%. The limits of detection of the method ranged from 0.1 to 0.6 ng g-1
and the limits of quantification from 0.3 to 2.0 ng g-1, while inter- and intra-day
variability was under 7.1% in all cases. The method was applied for the determination
of selected antibiotics in 28 raw cow milk samples.
Keywords: Quinolones; β-lactams; Ultrasound-assisted extraction; Dispersive solid-

phase extraction sorbent; Raw cow milk; UHPLC–MS/MS
_________________________
* Corresponding author: Tel.: +34 958 243399; fax: +34 958 243328
E-mail address: azafra@ugr.es (Alberto Zafra-Gómez)
77
1. Introduction preparation step is necessary before the

analysis. The majority of methods
Antibiotics are compounds of consist in an extraction followed by a
natural or synthetic origin widely used clean-up step, for the case of solid
in human and veterinary medicine that matrices; and usually the typical solid
are able to inhibit the proliferation of phase extraction (SPE) for liquid
bacteria. Since 2006, these substances matrices, like raw milk. However, the
are forbidden by the European Union number of proposed analytical methods
(EU) to be used in sub-therapeutic for liquid food matrices is very small,
doses for prophylaxis and as growth so that other alternatives are necessary.
promoters in veterinary medicine According to Marazuela et al., the
(Council Regulation No 1831/2003, reason for the lack of analytical
2003). In some cases the antimicrobials methods for liquid matrices is the
that are used in animals intended for negative influence of the presence of
food production are the same that those water in samples, which restricts the
used in human medicine. Although the diffusion of the analytes from the
presence of residues of antibiotics in matrix to the extraction solvent,
foodstuffs of animal origin could have resulting in low recoveries. However,
several effects on human health, the this problem could be solved by the
most serious issue is the transference of previous freeze-drying of the samples
resistant bacterial strains from animals and then, they are treated as solid
to humans. In order to ensure the samples, being extracted using modern
consumer health, the EU established the techniques that require small amounts
maximum residue limits (MRLs) for of organic solvents and short extraction
antibiotics in food by the Commission time, in comparison with the classical
of the European Communities (2009). techniques such as Soxhlet or steam
In recent years, several analytical distillation. Recently, pressurized liquid
methods have been proposed in the extraction (PLE), microwave-assisted
scientific literature for the extraction (MAE) and ultrasound-
determination of residues of antibiotics assisted extraction (UAE) have also
in food of animal origin for human been applied. These techniques are
consumption. Due to the complexity of easier to operate and automate as well
these matrices, an effective sample as they permit reducing drastically the

extraction time while the extraction
78
Capítulo 3
recoveries increase (Marazuela & After extraction, the obtained

Bogialli, 2009; Picó, 2013). PLE has extracts usually require a further clean-
been used to determine antibiotics up in order to reduce matrix effects.
(quinolones, tetracyclines, Although SPE is the most used
sulphonamides, β-lactams, macrolides) technique (Junza, Amatya, Barrón &
in several food matrices such as eggs Barbosa, 2011; Macarov et al., 2011), it
and bovine, poultry, lamb and porcine is tedious and relatively expensive.
tissues (Blasco, Di Corcia & Picó, Recently, new materials based on
2009; Carretero, Blasco & Picó, 2008; molecular recognition such as
Jiménez, Rúbies, Centrich, Companyó molecularly imprinted polymers (MIPS)
& Guiteras, 2011). MAE has also been appeared as alternative to classical
used for the extraction of antibiotics sorbents of SPE. However, the use of
from food (Hermo, Barrón & Barbosa, these synthetic polymers to carry out
2005; Xu et al. 2011). multi-class methods is not suitable due
The present work offers a new to its high specificity (Quesada-Molina,
alternative of sample treatment for the Claude, García-Campaña, del Olmo-
determination of antibiotics in raw Iruela & Morin, 2012; Urraca,
milk, which is previously freeze-dried Castellari, Barrios & Moreno-Bondi,
and then extracted by UAE. This 2014). In the last years, in order to
technique was selected because it simplify sample processing and to
produces a good solvent penetration reduce times and organic solvent
through the interstices of the freeze- amounts, other alternatives for
dried milk, resulting in good extraction extraction/clean-up have been
yields reducing significantly the developed, such as QuEChERS (Quick,
extraction time and the consumption of Easy, Cheap, Effective, Rugged and
organic solvents. Moreover, UAE also Safe). This technique has been
avoids the degradation of labile successfully applied for the
antibiotics, since the extraction happens determination of antibiotics like
at room temperature, which is an quinolones, penicillins, cephalosporins,
important advantage in comparison to tetracyclines among others (Pérez-
MAE or PLE (Picó, 2013) along with Burgos et al., 2012; Stubbings & T.
its lower cost in equipment in relation Bigwood, 2009). Matrix solid-phase
to the other two mentioned techniques dispersion (MSPD) (Bogialli,
(Chemat, Zill-e-Huma & Khan, 2011). D’Ascenzo, Di Corcia, Lafana &
79
Tramontana, 2009; Sun et al., 2014) and quinolones and 14 β-lactams in raw
dispersive liquid-liquid microextraction cow milk. These antibiotics were
(DLLME) and its modifications have selected due to they represent a quarter
attracted considerable attention and it of the total of sold antibiotics for
has been successfully applied for the veterinary medicine in the 25 countries
pre-concentration of pharmaceuticals of EU (Sales of Veterinary
from foodstuffs and biological samples Antimicrobial Agents, 2013). The
(Junza et al., 2014; Moema, Nindi & method was applied to freeze-dried raw
Dube, 2012). The liquid-liquid cow milk samples and it is based on an
extraction with partition at low extraction step by UAE followed by a
temperature (LLE-PLT) was also used clean-up using a dispersive sorbent
in literature for qualitative screening for (PSA). UHPLC−MS/MS was used for
the identification of antibiotics in food the analysis of target compounds. The
of animal origin (Lopes et al., 2011; optimization of extraction and clean-up
Robert et al. 2013). The combination of procedures was carried out by using
different techniques of extraction and experimental designs. The method has
clean-up has improved the quality been validated according to European
parameters of the resulted analytical Commission Regulation 2002/657/EC
methods (Karageorou & Samanidou, (2002) and US Food and Drugs
2013; Karageorou, Samanidou & Administration (FDA) guideline for
Papadoyannis, 2012; Rúbies et al., Bioanalytical Method Validation (2001)
2007; Shalaby, Salama, Abou-Raya, and has been applied to several samples
Emam & Mehaya, 2011; Zhang, Ren & from treated and untreated animals with
Bao, 2009). The combination of UAE antibiotics.
followed by a clean-up step using a
dispersive sorbent, which is commonly 2. Experimental
applied in QuEChERS, is an interesting
alternative that has been studied in the 2.1. Chemicals and reagents
present work because it consists in a
simple and fast procedure, which is also Water (18.2 MΩ cm) was purified
highly effective. using a Milli-Q system from Millipore
The aim of this work was to (Bedford, MA, USA). HPLC-grade
validate a multi-class method for the acetonitrile (MeCN), methanol
simultaneous determination of 17
80
Capítulo 3
(MeOH), acetone (Ace), hexane (Hex) Sigma-Aldrich; ceftiofur (TIO),

and ethyl acetate (EtAc) were cephazolin (ZOL) and cephapirin (PIR)
purchased from Merck (Darmstadt, from Fluka (St. Louis, MO, USA);
Germany). LC−MS grade MeOH, cefquinome (QUI) from AK Scientific
MeCN and water, ammonia (>25%) and (Union City, CA, USA) and
formic acid (>98%) −used for the cephalonium (LON) was provided by
preparation of standards, mobile phases Schering-Plough Animal Health
and pH adjustments− were purchased Corporation (Dublin, Ireland).
from Fluka (St. Louis, MO, USA). Penicillins: amoxicillin (AMO),
Disodium hydrogen phosphate and nafcillin (NAF) and oxacillin (OXA)
citric acid, for McIlvaine buffer from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
solution (McIlvaine, 1921), and USA); cloxacillin (CLO) and
anhydrous magnesium sulphate piperacillin (PIPE) (surrogate) from
(MgSO 4 ) were obtained from Panreac Fluka (St. Louis, MO, USA) and
(Barcelona, Spain). Primary-secondary ampicillin (AMP), dicloxacillin (DIC)
amine (PSA) solid-phase extraction and penicillin G (PENG) from
(SPE) sorbent was provided by European Pharmacopeia (Strasbourg
Scharlab (Barcelona, Spain). Analytical Cedex, France). 2-phenyl-4-quinoline
grade standards of antibiotics were carboxylic acid (cincophen, CIC), used
provided by different pharmaceutical as surrogate, and caffeine (CAF), used
firms. Quinolones: cinoxacin, (CIN), as internal standard, were purchased
ciprofloxacin (CIP), danofloxacin from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO,
(DAN), difloxacin (DIF), enoxacin USA).
(ENO), enrofloxacin (ENR), Individual standard solutions of
flumequine (FLU), lomefloxacin quinolones (200 µg mL-1) were
(LOM), marbofloxacin (MAR), prepared in a water/methanol mixture
moxifloxacin (MOX), nalidixic acid (1:4; v/v) and in water for β-lactams
(NAL), norfloxacin (NOR), ofloxacin (200 µg mL-1). These solutions were
(OFL), oxolinic acid (OXO), pipemidic stored at −20 ºC and prepared fresh
acid (PIP), piromidic acid (PIRO) and monthly. Working standard mixtures
sarafloxacin (SAR) were purchased were prepared at 100 ng mL-1 for
from Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, quinolones and 200 ng mL-1 for β-
USA). Cephalosporins: cephoperazone lactams by diluting the individual stock
(PER) and cephalexin (LEX) from solution in water. These solutions were
81
stored at 4 ºC and prepared fresh 2000 digital pH-meter with a combined

weekly. All solutions were stored in glass–Ag/AgCl (KCl 3 M) electrode
dark glass bottles to prevent photo- (Crison Instruments, Barcelona, Spain)
degradation. The internal standard was used for pH measurements. A
(CAF) was prepared at 80 ng mL-1 in vortex-mixer (IKA, Staufen, Germany),
mobile phase (ammonium formate 50 a Digicen 21 centrifuge from Orto
mM at pH 4.0 / MeOH, 50:50; v/v). Alresa (Madrid, Spain) and a
SpectrafugeTM 24D centrifuge from
2.2. Instrumentation and software Labnet International (Edison, NJ, USA)
were also used. Statgraphics Plus
Ultrasounds were generated with a software version 5.1 (Statpoint
®
Branson digital Sonifier unit model S- Technologies, Warrenton, VA, USA)
450D (Danbury, CT, USA), operated was used for statistical treatment of
with a standard 12.7 mm titanium data.
disruptor horn, a flat and replaceable
12.7 mm titanium tip a temperature 2.3. Milk samples
probe. UHPLC–MS/MS analysis was
performed using a Waters Acquity Milk samples were obtained from
UPLCTM H-Class (Waters, Manchester, different producing farms. All raw cow
UK), consisting of an ACQUITY milk samples were frozen at −20 ºC for
UPLCTM binary solvent manager and an 24 h prior being freeze-dried. The
ACQUITY UPLCTM sample manager. samples were not thermally treated nor
Separation of compounds was skimmed. Water content in raw milk
performed with ACQUITY UPLC sample, before to be freeze-dried, was
BEHTM C18 column (1.7 µm; 2.1 mm × around 87.5% (w/w) and was calculated
100 mm) (Waters, Manchester, UK). A by weight differences before and after
Xevo TQS tandem quadrupole mass lyophilization. Liquid milk samples
spectrometer (Waters, Manchester, UK) were freeze-dried in subsamples and
equipped with an orthogonal Z-sprayTM later they were mixed to ensure the
electrospray ionization (ESI) source homogeneity of the samples. Freeze-
was used for antibiotic detection. dried milk was kept in a desiccator
Milk samples were freeze-dried cabinet until analysis.
using a SCANVAC CoolSafe freeze
dryer (Lynge, Denmark). A Crison
82
Capítulo 3
2.4. Preparation of fortified milk 12 mL of a solvent mixture containing

samples MeCN and MeOH (70:30; v/v) were
added and vortexed for 2 min. The
For the optimization of the capsules with samples were sonicated
extraction procedure, 1.0 g of freeze- for 20 min at 70% amplitude. Then, the
dried milk was weighted into a stainless samples were transferred to
steel capsule and 0.5 mL of Ace and 0.5 polypropylene tubes and centrifuged for
mL of the working standard mixture of 3 min at 4109 × g. The supernatant was
antibiotics were added, to obtain a final decanted into a tube containing 300 mg
concentration of 200 ng g-1 for β- of the dispersive sorbent (PSA) and 900
-1
lactams and 100 ng g for quinolones. mg of anhydrous MgSO 4 , used as
This volume allows the analytes to desiccant. The mixture was shaken
come into contact with the whole vigorously for 1 min and centrifuged
sample. In order to attain sorption for 1 min at 4109 × g. The supernatant
equilibrium and to allow complete was transferred to a glass vial and
evaporation of the solvents from evaporated to dryness under a N 2
samples, the mixtures were shaken on a stream at 40 ºC. Before analysis, the
vortex mixer for 5 min and they were extracts were reconstituted with 1 mL
then left to stand for 24 h at room- of the initial mobile phase (ammonium
temperature in the dark before analysis. formate 50 mM, pH 4.0/MeOH, 80:20;
For method validation purposes v/v), centrifuged for 15 min at 16,300 ×
(recovery assays, precision and g and then injected into the LC system.
trueness), blank samples were spiked at
different concentrations by adding 1 mL 2.6. UHPLC−MS/MS analysis
of a standard solution containing the
analytes and the surrogates to 1.0 g of Chromatographic separation was
freeze-dried milk. performed using a binary gradient
elution at a flow rate of 300 µL min-1.
2.5. Sample extraction and clean-up The mobile phase consist of ammonium
formate 50 mM at pH 4.0 (solvent A)
A volume of 3 mL of McIlvaine and MeOH (solvent B). The gradient
buffer solution at pH 6.0 was added to a conditions were as follows: from 0.0 to
1.0 g of fortified freeze-dried milk 3.0 min, 20 % B; 6.0 min, 70 % B; 6.1
sample and vortexed for 1 min. Then, min, 100 % B; 8.0 min, 100 % B; 8.1
83
min, 20 % B; 10.0 min, 20 % B. The confirmation, the optimum collision

column was maintained at 30 ºC and the energies and the cone voltages for the
injection volume was 7 µL. studied compounds. The segment
The mass spectrometer (MS) was periods and retention times are also
operated in positive electrospray mode listed.
and in multiple reaction monitoring
(MRM) mode. MS/MS parameters were
optimized individually for each
antibiotic by direct infusion of 0.5 µg
mL-1 standard solution in the initial
mobile phase into the mass
spectrometer under combined mode,
using [M+H]+ as precursor ion.
Instrument parameters were as follows:
capillary voltage, 0.60 kV; source
temperature, 150 ºC; desolvation
temperature, 500 ºC; cone gas flow, 150
L h-1; desolvation gas flow, 500 L h-1;
collision gas flow, 0.15 mL min-1, and
nebuliser gas flow, 7.0 bar. Nitrogen (≥
99.995%) was used as cone and
desolvation gas, and argon (99.999%)
as collision gas. Dwell time for each
transition was 25 ms, and interscan
delay was set at 3 ms. Finally, data
acquisition was performed under time-
segmented conditions based on the
chromatographic separation of the
target compounds to maximize the
sensitivity of detection. MassLynx
software 4.1 was used for instrument
control and peak detection and
integration. Tables 1 and 2 summarize
the transitions for quantification and
84
Capítulo 3
Table 1. Quantification (SRM 1 ) and confirmation (SRM 2 ) transitions for quinolones

and internal standards, and retention times (RT) by UPLC-ESI(+)-MS/MS.
O O
R2
OH
R3 N1
R1
General structure of quinolone antibiotics
CV / CV / Segment RT
Compound SRM 1 SRM 2
CEa CEa (min) (min)
CIN 263.2→245.1 4 / 14 263.2→189.0 4 / 26 2.5 – 5.5 4.27
CIP 332.2→314.2 14 / 18 332.2→231.1 14 / 34 2.5 – 5.5 3.62
DAN 358.2→340.2 2 / 24 358.2→81.9 2 / 36 2.5 – 5.5 3.67
DIF 400.2→382.2 2 / 22 400.2→356.2 2 / 18 2.5 – 5.5 3.98
ENO 321.2→303.2 6 / 18 321.2→232.0 6 / 34 2.0 – 4.5 3.38
ENR 360.2→316.2 8 / 18 360.2→245.1 8 / 26 2.5 – 5.5 3.73
FLU 262.2→244.0 6 / 18 262.2→202.0 6 / 32 4.0 – 7.0 5.21
LOM 352.2→265.1 6 / 22 352.2→308.2 6 / 16 2.5 – 5.5 3.74
MAR 363.2→71.9 10 / 20 363.2→320.1 10 / 14 2.0 – 4.5 3.06
MOX 402.2→384.2 30 / 22 402.2→358.2 30 / 18 2.5 – 5.5 4.40
NAL 233.1→215.0 2 / 14 233.1→187.0 2 / 24 4.0 – 7.0 5.14
NOR 320.2→302.2 38 / 18 320.2→276.2 38 / 16 2.5 – 5.5 3.52
OFL 362.2→318.2 4 / 18 362.2→261.1 4 / 26 2.0 – 4.5 3.35
OXO 262.2→244.0 4 / 18 262.2→215.9 4 / 26 4.0 – 7.0 4.68
PIP 304.2→217.1 10 / 22 304.2→286.2 10 / 18 2.0 – 4.5 2.86
PIRO 289.2→271.1 8 / 18 289.2→243.1 8 / 28 4.0 – 7.0 5.37
SAR 386.4→368.2 50 / 20 386.4→342.2 50 / 18 2.5 – 5.5 3.99
CAFb 195.1→137.9 32 / 18 195.1→109.9 32 / 22 2.0 – 4.0 3.01
CICc 250.2→127.9 4 / 34 250.2→222.0 4 / 26 4.0 – 7.0 5.12
a
CV, cone voltage (V) and CE, collision energy (eV); b internal standard; c surrogate
85
Table 2. Quantification (SRM 1 ) and confirmation (SRM 2 ) transitions for β-lactams and
surrogate, and retention times (RT) by UPLC-ESI(+)-MS/MS.
β-LACTAMS
(a) O O (b) O
R3 O
O O R3
X
N R2 N
O O
S S
N N
R1 H R1 H
General structure of (a) cephalosporin antibiotics and (b) penicillin antibiotics.
Segment RT
Compound SRM 1 CV / CEa SRM 2 CV / CEa
(min) (min)
LEX 348.1→157.9 4/6 348.1→173.9 4 / 14 2.0 – 4.5 2.90
LON 459.1→151.9 8 / 20 459.1→337.0 8/8 2.0 – 4.5 2.63
PER 646.1→143.0 4 / 36 646.1→530.2 4 / 12 2.0 – 4.5 3.47
PIR 423.9→292.0 2 / 14 423.9→151.9 2 / 24 2.0 – 4.5 2.26
QUI 529.1→134.0 4 / 14 529.1→124.9 4 / 56 2.0 – 4.5 2.39
TIO 524.1→241.0 4 / 16 524.1→125.1 4 / 58 2.0 – 4.5 4.49
ZOL 455.1→323.1 4 / 10 455.1→155.9 4 / 14 2.0 – 4.5 2.97
AMO 366.1→113.9 24 / 22 366.1→208.0 24 / 12 4.0 – 7.0 5.62
AMP 350.0→105.9 42 /18 350.0→159.9 42 / 12 2.0 – 4.5 3.14
CLO 436.1→159.9 4 / 12 436.1→277.0 4 / 12 4.0 – 7.0 5.20
DIC 470.1→160.0 28 / 12 470.1→311.0 28 / 14 4.0 – 7.0 5.26
NAF 415.1→199.0 10 / 14 415.1→171.0 10 / 36 4.0 – 7.0 5.26
OXA 402.1→160.0 4 / 12 402.1→243.1 4 / 14 4.0 – 7.0 5.15
PENG 335.1→159.8 4 / 20 335.1→90.8 4 / 42 4.0 – 7.0 4.96
PIPEb 518.2→143.0 8 / 16 518.2→160.0 8 / 10 4.0 – 7.0 4.80
a
CV, cone voltage (V) and CE; collision energy (eV); b surrogate
86
Capítulo 3
3. Results and discussion organic solvent (salting out effect). The
3.1. Optimization of ultrasound-assisted capsules were vortexed for 1 min and
extraction sonicated for 10 min at 70% amplitude.
3.1.1. Selection of the extraction solvent Samples were decanted into a tube and
and the dispersive-SPE sorbent centrifuged for 3 min at 4109 × g. The
for the clean-up organic phase was transferred to a tube
Four different solvents and mixtures of containing 300 mg of PSA and 900 mg
them: MeCN, MeCN/MeOH (1:1; v/v), of MgSO 4 . The tubes were shaken for 1
Ace/Hex (1:1; v/v) and EtAc were min and centrifuged for another 1 min.
evaluated. The following basic The supernatant was evaporated in a
procedure was used during this glass vial under a N 2 stream at 40 ºC.
optimization: a stainless steel capsule The dried extracts were dissolved with 1
containing 1.0 g of spiked freeze-dried mL of solution of internal standard
milk was mixed with 3 mL McIlvaine (CAF) at 80 ng g-1 prepared in mobile
buffer solution at pH 3.0. Then, 12 mL phase (ammonium formate 50 mM (pH
of organic solvent, 2.0 g of anhydrous 4.0)/MeOH, 50:50; v/v), and analysed in
MgSO 4 and 1.0 g NaCl were added. The the UHPLC−MS/MS system. Figure 1
aim of the addition of these salts to the shows the normalized areas of the
medium is to promote the partitioning of analytes for the evaluated organic
the analytes between water and the solvents.
DKP-AMO
Fig. 1 Optimization of the solvents for the extraction of: (A) quinolones and (B) β-lactams, in raw
cow milk.
87
The mixture of MeCN/MeOH (1:1; sorbent is useful to remove fatty acids

v/v) was the most appropriated solvent and some sugars by interaction by
for the extraction of all studied hydrogen bonds (Anastassiades, 2003).
quinolones and most of β-lactams. Due Milk samples were extracted according
to the use of the mixture MeCN/MeOH to the procedure described above, using
(1:1; v/v) does not provoke phase the optimized mixture of organic
separation, then it does not make sense solvents (MeCN/MeOH). Then, half of
the addition of the MgSO 4 and NaCl samples were cleaned-up using 300 mg
salts to produce the salting-out effect. of PSA and 900 mg of anhydrous
Consequently, this step was MgSO 4 , whereas the other half did not
disregarded of the experimental experimented this clean-up step. Figure
procedure. 2 shows the effect of the application of
The effect of using the dispersive a clean-up step with PSA.
sorbent PSA was also evaluated. PSA
DKP-AMO
Fig. 2 Effect of the use of dispersive sorbent PSA in the d-SPE step: (A) quinolones and (B) β-lactams,
in raw cow milk.
88
Capítulo 3
PSA has a positive effect for all >0.05, the model appears to be
studied quinolones, being not the same satisfactory. The optimum composition
for β-lactams. PSA did not have an was 32% MeCN, 23% MeOH and 45%
effect, or had a negative effect, in 9 of buffer. However, the P values for the
the 14 studied β-lactams. However, the lack-of-fit test were lower than 5% for all
use of PSA was decisive for penicillins β-lactams. The worst extraction
NAF, PENG, AMP, CLO and OXA. efficiency was obtained using 100%
Thus, it was decided to include a clean- MeCN or 100% MeOH.
up step with 300 mg of PSA and 900 mg
of anhydrous MgSO 4 . Considering the obtained results, an
The composition of the extraction extreme vertices design was applied for
solvent was optimized using a simplex- β-lactams, which is a constrained
lattice mixture design for three variables mixture design on the solvents
(% MeCN, % MeOH and % McIlvaine proportions (% MeCN and % MeOH
buffer solution at pH 3.0). The between 0 to 90%) that covers only a
composition ranges studied were sub-portion within the simplex-lattice
between 0 to 100% for each solvent with design. This new design also consisted
the restriction that the sum of all of 16 experiments, including the
components was 100%. The mixture replicates of three experiments. The
design resulted in 16 experiments that results were satisfactory with R2 from
included three experiments by 0.866 to 0.984 and with P values for the
duplicated. The mathematical model was lack-of-fit test >0.05. The optimum
adjusted to a cubic model and was composition for β-lactam extraction was
evaluated by ANOVA with a confidence 65% MeCN, 25% MeOH and 10%
interval of 95%. R2 statistics were from McIlvaine buffer solution. The
0.918 to 0.973 for the series of desirability functions of the designs for
quinolones. Since the P values for the both studied families of antibiotics are
lack-of-fit test for all quinolones were shown in Figure 3 (A) and (B).
89
Fig. 3 Representation of the desirability functions vs composition of the extraction solvent (%

MeCN, % MeOH and % McIlvaine buffer solution) of the mixture designs for both studied
families of antibiotics. (A) quinolones, (B) β-lactams and (C) global desirability function.
90
Capítulo 3
As the optimum composition for the 0.768, although the P value for the lack-
extraction solvents is different for the two of-fit test was >0.05 for all antibiotics.
families of antibiotics, the best overall Volume and extraction time were the
extraction for all analytes was calculated most significant parameters for both
using a global desirability function, as families of antibiotics, in their linear and
shown in Figure 3 (C). The optimum quadratic terms, respectively. The
composition of the extraction solvent was interaction between the extraction time
60% MeCN, 25% MeOH and 15% and pH was also influential. Although pH
McIlvaine buffer solution. 3.0 is the optimum for most of the studied
compounds, some of them are better
3.1.2. Optimization of the extraction extracted at higher pH values, as is the
parameters by a Doehlert design case of ENR and OXO, so that the
optimum pH resulted from a compromise
The extraction time, pH and volume solution, which corresponded to a pH of
of the extraction solvent were optimized 6.0, according to the applied Doehlert
using a Doehlert experiment design. The design. In order to determine the best
Doehlert matrix for 3 variables consisted overall extraction efficiency, the
on 13 experiments including 3 central desirability functions, one for quinolones
points. The extraction time was evaluated and other for β-lactams, were obtained
at 5 levels (5–20 min), pH at 7 levels (3.0 from the combination of optimized
to 9.0), and the volume of the extraction experimental values for each compound.
solvent was considered at 3 levels (5–15 Desirability function was plotted vs. the
mL). The data were evaluated by extraction time and volume of extracting
ANOVA in order to identify the variables solvent. Responses for each compound in
that have influence on the the efficiency the experiments of Doehlert design were
of the extraction process. The results first normalized from 0 to 1, and then the
indicated that the model was satisfactory global desirability function was defined
for the obtained data at the selected 95% as their geometric mean. Figure 4 shows
confidence level. The determination the plots of desirability at pH 6.0 vs. the
coefficient (R2) were in the range extraction time and volume of the
0.806−0.992 for the most of compounds, extraction solvent. The optimum
except for TIO, DKP-AMO, OXO and conditions coincided for the two families
FLU that varied between 0.689 and of antibiotics and corresponded to 15 mL
91
of the extraction solvent and 20 min of Regulation 2002/657/EC (2002) and US

extraction time. Food and Drugs Administration (FDA)
guideline for Bioanalytical Method
Validation (2001). All reported
concentration values are expressed with
respect to the mass of the original raw
cow milk.
Linearity. Due to the presence of
strong matrix effects, quantification was
performed by using the matrix-matched
calibration, based on relative peak areas.
Cincophen and piperacillin were used as
surrogates for quinolones and β-lactams,
respectively. Seven calibration points
were generated in the range from the limit
of quantification to 12.5 ng g-1. Each
calibration level was made in triplicate,
and analyzed twice. The linearity was
quantified by both linear correlation
coefficient (R2, %) and the lack-of-fit test
Fig. 4 Representation of the global desirability

(P lof ). Table 3 shows the main calibration
function vs. extraction time and parameters. Linearity for all compounds
extraction solvent volumes for (A) within this wide concentration range was
quinolones and (B) β-lactams. achieved with R2 ranging from 97.9% to
99.9% and P values of the lack-of-fit test
were >5% in all cases; these facts
3.2. Analytical performance. Method
indicated a good linearity within the
validation
stated range.
The analytical method was validated

in terms of linearity, selectivity,
sensitivity and accuracy (trueness and
precision), according to the protocols
described in the European Commission
92
Table 3
Analytical and statistical parameters.
β lactams
DKP-
PER QUI TIO DIC LON ZOL CLO PIR NAF OXA AMP LEX PENG
AMO
MRL (ng g–1) 50 20 100 30 20 50 30 60 30 30 4 100 4
R2 (%) 99.4 99.9 98.1 98.7 99.4 99.9 97.9 99.4 98.6 99.9 98.8 98.3 99.9 99.9
n 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42
Plof (%) 72.1 34.4 45.0 10.6 72.3 70.1 73.5 90.2 88.8 66.7 9.6 12.5 88.2 29.5
–1 –2 –2 –2 –2 –2 –2 –2 –2 –2 –2 –2 –2 –1
b [1/(ng g )] 6.3⋅10 8.5⋅10 1.4⋅10 2.1⋅10 4.8⋅10 1.5⋅10 8.1⋅10 3.0⋅10 1.1⋅10 2.0⋅10 3.0⋅10 5.1⋅10 1.0⋅10 5.5⋅10–2
sb [1/(ng g–1)] 1⋅10–4 4⋅10–4 5⋅10–5 4⋅10–3 2⋅10–4 9⋅10–5 5⋅10–4 2⋅10–4 7⋅10–5 1⋅10–4 5.5⋅10–3 3⋅10–4 2·10-4 2·10-4
sy/x 1.4⋅10–2 5.0⋅10–2 5.4⋅10–3 4.3⋅10–3 2.8⋅10–2 1.0⋅10–2 5.6⋅10–2 2.0⋅10–2 8.2⋅10–3 1.6⋅10–2 2.7⋅10–3 3.9⋅10–2 2.7·10-2 1.8·10-2
–1
LOD (ng g ) 0.1 0.3 0.2 0.4 0.3 0.3 0.3 0.3 0.3 0.4 0.3 0.1 0.1
–1
LOQ (ng g ) 0.3 0.9 0.6 1.2 0.9 1.0 1.0 1.0 1.1 1.2 1.1 0.4 0.5
CCα (ng g–1) 51.4 20.9 101.0 31.4 20.5 50.6 31.2 60.6 30.8 31.0 5.4 100.7 5.2
–1
CCβ (ng g ) 52.8 21.9 102.1 32.4 21.8 51.1 32.4 61.1 31.6 32.1 6.8 101.3 6.4
Quinolones
MOX MAR OFL ENR LOM CIP ENO NOR PIP DIF SAR DAN PIRO CIN OXO FLU NAL
–1 a
MRL (ng g ) nr (30) 75 nr (30) 100 nr (30) 100 nr (30) nr (30) nr (30) nr (30) nr (30) 30 nr (30) nr (30) nr (30) 50 nr (30)
R2 (%) 99.9 99.4 99.9 99.8 99.8 99.9 99.8 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 99.9 98.9 99.9 99.9 99.7
n 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42 42
Plof (%) 73.3 11.3 24.8 53.7 80.8 11.5 21.2 99.7 99.2 99.0 59.3 89.5 9.4 98.1 72.0 28.7 6.0
–1 –2 –1 –1 –1 –1 –1 –1 –1 –2 –1 –1 –1 –2 –1 –2
b [1/(ng g )] 6.9⋅10 5.1⋅10 4.8⋅10 5.5⋅10 1.6⋅10 5.6⋅10 6.3⋅10 5.1⋅10 6.9⋅10 4.5⋅10 4.5⋅10 7.3⋅10 7.7⋅10 1.382 1.2⋅10 6.4⋅10 1.1⋅10–1
sb [1/(ng g–1)] 4⋅10–4 1⋅10–2 4⋅10–3 4⋅10–3 2⋅10–3 4⋅10–3 5⋅10–3 4⋅10–3 4⋅10–4 2⋅10–3 2⋅10–3 2⋅10–3 4⋅10–4 8⋅10–3 7⋅10–4 2⋅10–4 1⋅10–3
sy/x 4.2⋅10–2 1.1 4.3⋅10–1 4.2⋅10–1 2.1⋅10–1 4.8⋅10–1 5.4⋅10–1 5.1⋅10–1 5.0⋅10–2 2.5⋅10–1 2.2⋅10–1 2.5⋅10–1 5.0⋅10–2 9.0⋅10–1 7.6⋅10–2 2.7⋅10–2 1.4⋅10–2
–1
LOD (ng g ) 0.3 0.2 0.4 0.3 0.6 0.4 0.4 0.4 0.3 0.2 0.2 0.2 0.3 0.3 0.3 0.2 0.6
–1
LOQ (ng g ) 0.9 0.8 1.3 1.1 2.0 1.3 1.3 1.5 1.1 0.8 0.7 0.5 1.0 1.0 1.0 0.6 2.0
CCα (ng g–1) 30.5 30.6 30.9 101.4 30.8 100.8 30.3 30.7 30.6 30.7 30.3 30.8 30.3 30.8 30.7 50.2 31.0
–1
CCβ (ng g ) 30.9 31.2 31.9 102.7 31.6 101.7 30.7 31.3 31.2 31.4 30.7 31.6 30.6 31.6 31.5 50.4 32.0
MRLs, maximum residue limits; nr, not regulated antibiotic; R2, determination coefficient; n, points of calibration; b, slope; sb, slope standard deviation; sy/x, regression standard
deviation; LOD, limit of detection; LOQ, limit of quantification; CCα, decision limit; CCβ, detection capability. a The MRL assigned to not regulated quinolone antibiotics
corresponds to the minimum MRL value for regulated quinolones, which corresponds 30 ng g–1 (for danofloxacin, DAN).
Selectivity. The specificity of the (1.0, 2.5 and 7.5 ng g-1) rather to the
method was demonstrated by LC−MS/MS MLRs.
analysis of blank raw cow milk samples. Precision was determined from
Retention times of the analytes showed no triplicate milk samples (two injections of
interferences after analysis of the blank each one) at these levels during the same
samples and after analysis of spiked day (repeatability) and in five successive
matrices with all studied antibiotics. These days (reproducibility). Precision was
observations approve the high selectivity expressed as relative standard deviation
of the LC−MS/MS method. (RSD, %). The values obtained are
Sensitivity. The limits of detection summarized in Table 4. RSD values fell
(LODs) and quantification (LOQs) were between 0.3% and 7.1%. All compounds
calculated by taking into consideration the were within the acceptable limits for
minimum concentration of analyte that the bioanalytical method validation, which are
method can detect, with a signal-to-noise considered ≤15% of the actual value,
ratio of 3 for LODs and 10 for LOQs, except at the LOQ, which it should not
using the quantification transition. Table 3 deviate by more than 20%. The data
shows the obtained values. It is important indicate that the method is reproducible.
to indicate that even though the freeze-
drying process produces a strong
concentration of the matrix, which will
cause inevitably an increase of matrix
effects, the careful optimization of
extraction process resulted in a sensitive
analytical method, with low LOQs,
between 0.3 and 2.0 ng g-1, which were
lower than the corresponding MRLs as is
shown in Table 3.
Accuracy (precision and trueness).
Since the LOQs of the method are
markedly lower than the MLRs, in order to
ensure the proper operation of the method,
the study of accuracy was performed at
three concentration levels near the LOQ
94
Capítulo 3
Table 4
Accuracy of the method. Precision and trueness.
Spiked Recovery Precision Spiked Recovery Precision
(ng g–1) (%) (% RSD, n=30) (ng g–1) (%) (% RSD, n=30)
Quinolones β-lactams
1.0 99.4 2 1.0 98.1 3
PIP 2.5 99.9 0.6 PIR 2.5 97.7 6
7.5 100.1 0.5 7.5 103.8 5
1.0 100.5 2 1.0 98.0 4
MAR 2.5 99.7 2 QUI 2.5 98.1 3
7.5 99.9 2 7.5 100.1 2
1.0 100.1 2 1.0 99.6 3
OFL 2.5 101.5 2 LON 2.5 99.8 3
7.5 97.2 3 7.5 98.7 4
1.0 98.7 2 1.0 97.5 3
ENO 2.5 101.2 3 LEX 2.5 97.1 3
7.5 101.3 1 7.5 100.5 3
1.0 96.8 3 1.0 99.6 7
NOR 2.5 98.9 3 ZOL 2.5 99.6 5
7.5 101.5 3 7.5 100.3 5
1.0 98.0 2 1.0 99.3 5
CIP 2.5 97.9 2 AMP 2.5 99.2 3
7.5 98.6 3 7.5 101.7 3
1.0 102.7 3 1.0 98.5 3
DAN 2.5 99.1 3 PER 2.5 99.7 3
7.5 99.6 3 7.5 100.0 3
1.0 99.6 5 1.0 102.1 4
ENR 2.5 99.2 3 TIO 2.5 100.7 4
7.5 100.9 2 7.5 101.2 4
1.0 99.4 2 1.0 96.7 3
LOM 2.5 99.3 2 PENG 2.5 97.5 2
7.5 99.6 3 7.5 96.0 3
1.0 102.0 3 1.0 94.9 2
DIF 2.5 99.8 3 OXA 2.5 96.8 5
7.5 99.4 2 7.5 97.3 4
1.0 98.4 4 1.0 98.7 4
SAR 2.5 99.4 3 CLO 2.5 100.0 3
7.5 101.2 2 7.5 99.9 5
1.0 99.4 3 1.0 97.5 5
CIN 2.5 104.2 2 DIC 2.5 99.1 3
7.5 99.1 3 7.5 99.5 3
1.0 100.5 6 1.0 97.7 3
MOX 2.5 99.9 3 NAF 2.5 97.3 5
7.5 100.1 2 7.5 98.6 2
1.0 100.3 6 1.0 96.8 3
DKP-
OXO 2.5 99.8 2 2.5 99.4 3
AMO
7.5 100.2 1 7.5 97.2 5
1.0 99.4 2
NAL 2.5 98.6 3
7.5 101.1 3
1.0 97.4 3
FLU 2.5 97.0 2
7.5 100.8 2
1.0 98.9 4
PIRO 2.5 100.4 2
7.5 104.5 3
95
Due to the absence of certified deviation (SD). Supposing that the

materials, a recovery assay to validate the standard deviation at the MRL was
method in terms of trueness was carried similar to that obtained at CC α
out. Blank spiked freeze-dried milk concentration, the detection capability
samples were previously analyzed to (CC β ) was calculated as CC α plus 1.64
ensure they did not contain the times the SD. The results are summarized
compounds of interest or that these were in Table 3, shown that both values are
below the LOD of the method. Trueness very close to MRL’s.
was evaluated by determining the In relation to other techniques
recovery of known amounts of tested previously used for the determination of
compounds in milk samples. Samples quinolones and b-lactams in milk, as SPE
were analyzed using the proposed and DLLME, the UAE followed by a
method and the concentration of each clean-up using a dispersive sorbent, this
compound was determined by last procedure present similar results than
interpolation from the calibration curve SPE in terms of LOD and LOQ. In
within the linear dynamic range and relation with the recovery, better results
compared with the amount of analytes were obtained by UAE and in terms of
previously added to the samples. As it is precision, CC α and CC β similar results
shown in Table 4, the recoveries were were obtained for DLLME and UAE.
close to 100% (96.0% to 104.5%).
Precision and trueness data indicate 3.3. Study of matrix effects
that this method to determine the target
compounds in milk samples is accurate, When complex biological matrices
and that the presence of co-extracted such as raw cow milk are studied, the
matrix components, which typically analysis by LC–MS, especially in the ESI
suppress the analyte signal in mass mode, might significantly be influenced
spectrometry, did not affect the by matrix effects. It is well known that
performance of the method. electrospray mass spectrometry is prone
CC α and CC β . To calculate the to signal suppression or enhancement
decision limit (CCα), α error 5%, 20 effects (Matuszewski, Constanzer &
spiked samples at the MRL level were Chavez-Eng, 1998). Large amounts of
analyzed. CC α was determined as the endogenous species may coelute with the
concentration at the MRL level for each target analyte. Co-eluting matrix
analyte plus 1.64 times the standard components have an influence on the
96
Capítulo 3
ionisation efficiency of the analyte and

affect adversely the reproducibility and
accuracy of the method. These results agree with previous
The matrix effect was evaluated studies that also emphasize the existence
comparing the calibration curves of matrix enhancement effects,
prepared in pure solvent (mobile phase) particularly in quinolones (Aguilera-
with those prepared in matrix extracts. Luiz, Martínez-Vidal, Romero-González
The t–Student test was applied in order to & Frenich, 2008; Stolker, Peters,
compare the calibration curves. The t– Zuiderent, Di Bussolo & Martins, 2010).
Student test showed important statistical However, these studies also determined
differences among slope values of all the that the matrix effects did not vary
target analytes, which allowed us to greatly between different types of milk
confirm the existence of significant (skimmed, semi-skimmed and full-cream
matrix effects. Therefore, the milk) (Becker, E. Zittlau & Petz, 2004),
quantification was done using the so that the milk constituents that are
matrix–matched calibration. responsible for these effects are still
Significant matrix enhancement unknown.
effects were observed for almost all
quinolones, and for some β-lactams
(PER, QUI, TIO, LON, ZOL, PIR),
whereas the quinolones PIR and FLU, as
well as the remaining β lactams (DIC,
CLO, NAF, OXA, AMP, LEX, DKP-
AMO, PENG) experimented signal
suppression. It was also observed that
matrix effects were higher for the group
of quinolones in comparison with β-
lactams (Becker, E. Zittlau & Petz,
2004).
97
3.4. Application of the method only for positive samples are shown in
Table 5. Samples with higher
The validated method was applied for concentrations than the established linear
the determination of antibiotic (quinolone dynamic range were appropriately diluted.
and β-lactam) residues in 28 raw cow milk Figure 5 shows examples of
samples from medicated and not chromatograms for two of the analyzed
medicated cows. Concentration values positive samples.
Table 5. Application of the method to raw cow milk samples.

Sample Antibiotic(s) found Amount (ng g-1)a
ENR 15.1 (0.6)
CIP 29.0 (0.4)
S01 MAR 11.7 (0.4)
DKP-AMO
PENG 3.3 (0.4)
DKP-AMO
S02 PENG 2.3 (1.1)
LON 5.5 (0.3)
CIP 5.1 (0.4)
S03 DKP-AMO
PENG 3.5 (1.1)
ENR 9.7 (0.6)
S04 CIP 18.6 (0.3)
MAR 2.8 (0.4)
ENR 14.7 (0.3)
S05 CIP 34.0 (0.2)
DIC 3.6 (0.8)
S06 DKP-AMO
S07 PENG 4.7 (0.2)

DKP-AMO
S08
PER 5.1 (0.3)
a
Mean of six determinations. Relative standard deviation (% RSD) in parentheses
98
Capítulo 3
DKP-AMO DIKETO
Fig. 5 UHPLC–MS/MS chromatograms for two positive raw cow milk samples: S03 (A) and S04 (B),
containing the corresponding surrogates (CIC and PIPE).
99
The results corroborated that the with current EU legislation. The

studied families of antibiotics are remaining positive samples showed
extensively applied not only in human concentrations that were within the
but also in veterinarian medicine. All established boundaries by MRLs values
the found antibiotics have been licensed that have been included in the European
in Europe for their use in animals from Commission Regulation 37/2010
which milk are produced for human (2009).
consumption, being remarkable the Some samples of milk were previously
presence of the quinolones ENR, CIP analysed by DLLME. The results of
and MAR, and the β-lactams AMP, concentration were similar (Junza et al;
DKP-AMO and PENG in most of the 2014) but using UAE followed by a
analyzed samples, as well as DIC and clean-up using a dispersive sorbent, the
LON only in two samples. CIP, the presence of ENR was also observed
primary metabolite of ENR was always while is ENR is lost by DLLME as
found at higher concentrations than its happen in S01, S04 and S05.
parent compound, which demonstrates In relation to other characteristics, as
that ENR is metabolized mostly into time consuming, solvent consumption,
CIP (S01, S04 and S05). In Figure 5, we waste generated, and cost, DLLME and
think that the peak obtained at 5.66 min, UAE are comparable and were better
correspond to one of the main than classical SPE. In relation to other
metabolites of AMO. Amoxicillin parameters as sensitivity, UAE has
diketopiperazine-2,5-dione (DIKETO, similar results than SPE and better than
DKP-AMO) has the same theoretical DLLME.
m/z than AMO, but elutes later that the
parent compound. This metabolite was 4. Conclusions
also observed in chicken kidney (Hermo
et al.; 2014). In the present paper, A sensitive multi-class method for
DIKETO has not been quantify because the simultaneous determination of 17
the lack of the available standard. quinolones and 14 β-lactams in raw cow
Finally, it is important to indicate that milk by UHPLC−MS/MS has been
the 28% of the analyzed samples were developed and validated. The method is
positive, and only 11%, which based on ultrasound-assisted extraction
contained AMO, as DIKETO, and of milk samples that have been
PENG, were considered non-compliant
100
Capítulo 3
previously freeze-dried. This represents Acknowledgement

an advantage, since it eliminates the
difficulties of the extraction of highly The present work was supported by
water soluble compounds, such as these the Spanish Ministry of Education,
families of antibiotics, from aqueous Culture and Sport (Project No.
matrices. Due to the known complexity CTQ2013-44077-R). The authors are
of biological matrices, the obtained grateful to MICINN for the fellowship
extracts showed significant matrix granted to A. Junza (BES-2011-045849)
effects; however, the thorough for researchers training.
optimization by design of experiments
of both, the most influential parameters
of UAE and the clean-up by dispersive
References
SPE sorbents, together with the
sensitive detection and quantification by Aguilera-Luiz, M.M., Martínez-Vidal, J.L.,
UHPLC−MS/MS, allowed the Romero-González, R., & Frenich, A.G.
validation of the analytical performance (2008). Multi-residue determination of
veterinary drugs in milk by ultra-high-
of the method, which showed good
pressure liquid chromatography-tandem
analytical parameters in terms of
mass spectrometr. Journal of
sensitivity, selectivity, accuracy and Chromatography A, 1205, 10–16.
precision in the determination of the Becker M., Zittlau E., & Petz M. (2004).
selected compounds, achieving low Residue analysis of 15 penicillins and
cephalosporins in bovine muscle, kidney
LOQs (between 0.3 and 2.0 ng g-1), high
and milk by liquid chromatography-
recoveries and precision. The method
tandem mass spectrometry. Analytica
was successfully applied to the Chimica Acta, 520, 19-32.
determination of the levels of the target Blasco, C., Di Corcia, A., & Picó Y. (2009).
antibiotics in 28 raw cow milk samples Determination of tetracyclines in multi-
specie animal tissues by pressurized liquid
from medicated and not medicated
extraction and liquid chromatography-
cows.
tandem mass spectrometry. Food
Chemistry, 116, 1005-1012.
Bogialli, S., D’Ascenzo, G., Di Corcia, A.,
Lafana, A., & Tramontana G. (2009).
Simple assay for monitoring seven
quinolone antibacterials in eggs: extraction
with hot water and liquid chromatography
101
coupled to tandem mass spectrometry, Jiménez, V., Rúbies, A., Centrich, F.,
Laboratory validation in line with the Companyó R., & Guiteras J. (2011).
European Union Commission Decision Development and validation of a
657/2002/EC. Journal of Chromatography multiclass method for the analysis of
A, 1216, 794-800. antibiotic residues in eggs by liquid
Carretero, V., Blasco, C., & Picó Y. (2008). chromatography-tandem mass
Multi-class determination of antimicrobials spectrometry. Journal of Chromatography
in meat by pressurized liquid extraction A, 1218, 1443-1451.
and liquid chromatography-tandem mass Junza, A., Amatya, R., Barrón, D., & Barbosa,
spectrometry. Journal of Chromatography J. (2011). Comparative study of the LC–
A, 1209, 162-173. MS/MS and UPLC–MS/MS for the multi-
Chemat F., Zill-e-Huma, & Khan, M.K. (2011). residue analysis of quinolones, penicillins
Applications of ultrasound in food and cephalosporins in cow milk, and
technology: Processing, preservation and validation according to the regulation
extraction. Ultrasonics Sonochemistry, 18, 2002/657/EC. Journal of
813-835. Chromatogratography B, 879, 2601-2610.
Council Regulation No 1831/2003 of the Junza, A., Dorival-García, N., Zafra-Gómez, A.,
European Parliament and of the Council of Barrón, D., Ballesteros, O., Barbosa, J.,
22 September 2003 on additives for use in Navalón, A. (2014). Multiclass method for
animal nutrition. Off. J. Eur. Comm. L 268 the determination of quinolones and β-
(2003) 29-43. lactams, in raw cow milk using dispersive
Commission of the European Communities, liquid-liquid microextraction and ultra
Commission Regulation (EU) No. 37/2010 high performance liquid chromatography-
of 22 December 2009 on tandem mass spectrometry. Journal of
pharmacologically active substances and Chromatography A, 1356, 10-22.
their classification regarding maximum Karageorou, E.G., & Samanidou, V.F. (2013)
residue limits in foodstuffs of animal Multi-residue LC-MS/MS analysis of
origin, Off. J. Eur. Comm. 37/2010 (2009) cephalosporins and quinolones in milk
L15/1. following ultrasound assisted matrix solid
European Commission Regulation (2002). phase dispersive extraction combined with
Commission Decision 2002/657/EC of 12 QuEChERS methodology. Journal of
August 2002 implementing Council Separation Science, 36, 2020-2027.
Directive 96/23/EC concerning the Karageorou, E.G., Samanidou, V.F., &
performance of analytical methods and the Papadoyannis, I.N. (2012). Ultrasound
interpretation of results. Official Journal of assisted matrix solid phase dispersive
the European Union, L221, 8-36. extraction for the simultaneous analysis of
Hermo, M.P., Barrón, D., & Barbosa, J. (2005). β-lactams (four penicillins and eight
Determination of residues of quinolones in cephalosporins) in milk by HPLC-DAD.
pig muscle. Analytica Chimica Acta, 539, Journal of Separation Science, 35, 2599-
77-82. 2607.
102
Capítulo 3
Macarov, C.A., Tong, L., Martínez-Huélamo, using LC–MS/MS. Journal of

M., Hermo, M.P., Chirila, E., Wang, Y.W., Chromatography B, 899, 57-65.
Barrón, D., & Barbosa, J. (2012). Multi
Picó, Y. (2013). Ultrasound-assisted extraction
residue determination of the penicillins
for food and environmental samples.
regulated by the European Union, in
Trends in Analytical Chemistry, 43, 84-99.
bovine, porcine and chicken muscle, by
LC-MS/MS. Food Chemistry, 135, 2612- Quesada-Molina C., Claude B., García-
2681. Campaña A.M., del Olmo-Iruela M., &
Marazuela, M.D., & Bogialli, S. (2009). A Morin P. (2012). Convenient solid phase
review of novel strategies of sample extraction of cephalosporins in milk using
preparation for the determination of a molecularly imprinted polymer. Food
antibacterial residues in foodstuffs using Chemisty, 135, 775-779.
liquid chromatography-based analytical Rúbies, A., Vaquerizo, R., Centrich, F.,
methods. Analytica Chimica Acta, 645, 5- Companyó, R., Granados, M., & Prat,
17. M.D. (2007). Validation of a method for
Matuszewski, B.K., Constanzer, M.L., & the analysis of quinolones residues in
Chavez-Eng, C.M. (1998). Matrix effect in bovine muscle by liquid chromatography
quantitative LC/MS/MS analyses of with electrospray ionisation tandem mass
biological fluids: a method for spectrometry detection. Talanta, 72, 269-
determination of finasteride in human 276.
plasma at picogram per milliliter Sales of Veterinary Antimicrobial Agents in 25
concentrations. Analytical Chemistry, 70, EU / EEA Countries in 2011. Third
882–889. European Surveillance of Veterinary
McIlvaine, T.C. (1921). A buffer solution for Antimicrobial Consumption (ESVAC)
colorimetric comparison. Journal of Report. EMA/236501/2013, 2013.
Biological Chemistry, 49, 183-186. Shalaby, A.R., Salama, N.A., Abou-Raya, S.H.,
Moema, D., Nindi, M.M., & Dube, S. (2012). Emam, W.H., & Mehaya, F.M. (2011).
Development of a dispersive liquid–liquid Validation of HPLC method for
microextraction method for the determination of tetracycline residues in
determination of fluoroquinolones in chicken meat and liver. Food Chemistry,
chicken liver by high performance liquid 124, 1660-1666.
chromatography. Analytica Chimica Acta, Stolker, A.M., Peters, R.J.B., Zuiderent, R., Di
730, 80-86. Bussolo, J.M., & Martins, C.P.B. (2010).
Pérez-Burgos, R., Grzelak, E.M., Gokce, G., Fully automated screening of veterinary
Saurina, J., Barbosa, J., Barrón, D. (2012). drugs in milk by turbulent flow
Quechers methodologies as an alternative chromatography and tandem mass
to solid phase extraction (SPE) for the spectrometry. Analytical and Bioanalytical
determination and characterization of Chemistry, 397, 2841-2849.
residues of cephalosporins in beef muscle Stubbings G., & Bigwood T. (2009). The
development and validation of a multiclass
103
liquid chromatography tandem mass Validation FDA (2001). Department of

spectrometry (LC-MS/MS) procedure for Health and Human Services, Center for
the determination of veterinary drug Drug Evaluation and Research (CDER),
residues in animal tissue using a Center for Veterinary Medicine (CVM),
QuEChERS (Quick, Easy, Cheap, 2001.
Effective, Rugged and Safe) approach. Xu, H., Chen, L., Sun, L., Sun, X., Du, X.,
Analytica Chimica Acta, 637, 68-8. Wang, J., Wang, T., Zeng, Q., Wang, H.,
Sun, X., Wang, J., Li, Y., Yang, J., Jin, J., Shah, Xu, Y., Zhang, X., & Ding, L. (2011).
S.M., & Chen J. (2014). Novel dummy Microwave-assisted extraction and in situ
molecularly imprinted polymers for matrix clean-up for the determination of
solid-phase dispersion extraction of eight fluoroquinolone antibiotics in chicken
fluoroquinolones from fish samples. breast muscle by LC-MS/MS. Journal of
Journal of Chromatography A, 1359, 1-7. Separation Science, 34, 142-149.
Urraca, J.L., Castellari, M., Barrios, C.A., & Zhang, H., Ren, Y., & Bao, X. (2009).
Moreno-Bondi, M.C. (2014). Multiresidue Simultaneous determination of
analysis of fluoroquinolone antimicrobials (fluoro)quinolones antibacterials residues
in chicken meat by molecularly imprinted in bovine milk using ultra performance
solid-phase extraction and high liquid chromatography-tandem mass
performance liquid chromatography. spectrometry. Journal of Pharmaceutical
Journal of Chromatography A, 1343, 1-9. and Biomedical Analysis, 49,
US Food and Drugs Administration (FDA)
guideline for Bioanalytical Method
104
CAPÍTULO 4
Determinación y caracterización de productos de transformación y

metabolitos de antibióticos en leche por espectrometría de masas de
alta resolución (HRMS)
Capítulo 4
4. DETERMINACIÓN Y CARACTERIZACIÓN DE PRODUCTOS DE

TRANSFORMACIÓN Y METABOLITOS DE ANTIBIÓTICOS EN LECHE
POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS DE ALTA RESOLUCIÓN (HRMS)
Como se ha comentado en la introducción, los antibióticos β-lactámicos (penicilinas y

cefalosporinas) y las quinolonas se usan frecuentemente en medicina veterinaria. La
presencia de residuos de antibióticos en alimentos, supone un riesgo para la seguridad
del consumidor. En la normativa europea 37/2010, se establecen los valores de MRL
para los antibióticos regulados en los alimentos de origen animal. Los MRL hacen
referencia, en la gran mayoría de casos, al compuesto administrado sin tener en cuenta
los metabolitos producidos durante el proceso de metabolización del animal, y que
también pueden estar presentes en los alimentos. Por otra parte, en el caso de la leche de
vaca, antes de su consumo, ésta debe ser sometida a tratamiento térmico (esterilización
o pasteurización) para eliminar los microorganismos patógenos. El tratamiento térmico
puede ser la causa de la formación de productos de transformación (TPs), derivados de
los antibióticos, que pueden ser causa de riesgo para la salud del consumidor.
En los artículos incluidos en este capítulo se estudió el efecto de la temperatura sobre 4

quinolonas (ENR, CIP, DIF y SAR) y 4 β-lactamas (AMOX, PENG, PIR y TIO), tanto
en patrones como en leche de vaca fortificada con uno de estos antibióticos. Las
muestras se analizaron con HRMS y analizador ToF, con el fin de obtener el espectro de
masas en full-scan de las muestras antes y después del tratamiento térmico. Por
comparación manual y más adelante usando el software MZmine 2, se buscaron las
diferencias entre ambos espectros considerando las relaciones m/z. Al trabajar en
HRMS, se pudo obtener la fórmula molecular a partir de la masa exacta indicada por los
valores de m/z. Para conocer la estructura de los TPs, las muestras se analizaron con un
espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap permitiéndonos obtener los espectros de
fragmentación de los TPs en alta resolución y la posterior elucidación de sus
estructuras.
En el primer artículo, además de los patrones y leche fortificada con ENR, CIP, DIF y
SAR, se analizaron 4 muestras de leche procedentes de vacas medicadas con ENR.
Dichas muestras fueron calentadas y analizadas como se ha comentado anteriormente.
En el segundo artículo, de manera análoga, se estudió en qué se transformaban las β-
lactamas (AMOX, PENG, PIR y TIO) al calentar y se analizaron dos muestras de leche
107
Metabolitos y productos de transformación
de vaca medicada con PENG, durante y después del tratamiento farmacológico. En

ambos artículos, se han identificado diversos TPs y metabolitos, algunos de ellos no
descritos anteriormente en la bibliografía, como es el caso de conjugados con
aminoácidos.
En el último artículo, se han analizado muestras de leche de vaca medicada con ENR
durante los 3 días de tratamiento y durante los 4 días posteriores al cese del tratamiento
farmacológico. Además de buscar y elucidar nuevos metabolitos, se ha estudiado la
posible ruta de metabolismo seguida por ENR y como varía el perfil metabólico durante
los 7 días indicados (durante y después del tratamiento con ENR). Se han usado
herramientas quimiométricas para encontrar marcadores que nos permitan diferenciar
entre las leches de vacas que están recibiendo tratamiento farmacológico, aquellas
procedentes de vacas para las que el tratamiento ya está finalizado e incluso distinguir
entre estas leches y las procedentes de vacas que no han sido medicadas.
Las publicaciones incluidas en este capítulo son:
 Identification of Metabolites and Thermal Transformation Products of Quinolones in

Raw Cow’s Milk by Liquid Chromatography Coupled to High-Resolution Mass
Spectrometry.
A. Junza, S. Barbosa, M. R. Codony, A. Jubert, J. Barbosa, D. Barrón.
J. Agric. Food Chem. 62 (2014) 2008-2021.
 High resolution mass spectrometry in the identification of transformation products and

metabolites from β-lactam antibiotics in thermally treated milk.
A. Junza, A. Montané, J. Barbosa, C. Minguillón, D. Barrón.
J. Chromatogr. A 1368 (2014) 89-99.
 Study of metabolome modification in cow milk after enrofloxacin administration by

liquid chromatography coupled with high resolution mass spectrometry
A. Junza, J. Saurina, J. Barbosa, C. Minguillón, D. Barrón.
Pendiente de enviar 2015
108
Capítulo 4
109
110
Capítulo 4
111
112
Capítulo 4
113
114
Capítulo 4
115
116
Capítulo 4
117
118
Capítulo 4
119
120
Capítulo 4
121
122
Capítulo 4
IDENTIFICATION OF METABOLITES AND THERMAL
TRANSFORMATION PRODUCTS OF QUINOLONES IN RAW
COW MILK BY LIQUID CHROMATOGRAPHY COUPLED TO
HIGH RESOLUTION MASS SPECTROMETRY
A. Junza, S. Barbosa, R. Codony, A. Jubert, J. Barbosa, D. Barrón
123
124
Capítulo 4
125
126
Capítulo 4
127
128
Capítulo 4
129
130
Capítulo 4
131
132
Capítulo 4
133
134
Capítulo 4
135
136
Capítulo 4
137
HIGH RESOLUTION MASS SPECTROMETRY IN THE
IDENTIFICATION TRANSFORMATION PRODUCTS AND
METABOLITES FROM β-LACTAM ANTIBIOTICS IN
THERMALLY TREATED MILK
A. Junza, A. Montané, J. Barbosa, C. Minguillón, D. Barrón
138
Capítulo 4
Elucidation comments
CEPHAPIRIN (PIR)
The mass spectrum of PIR-1 (m/z 226.0646) shows common fragments with that of PIR.
Among them, m/z 152.0164 and 124.0216 come from the side chain of the β-lactam ring
and m/z 181.0429, 209.0376 from the cleavage of β-lactam ring. PIR-1 is 45.0215 Da
higher than the fragment m/z 181.0429. This mass increase corresponds to a molecular
fragment CH 3 NO. Therefore, the TP is suggested to be the result of the cleavage of the
β-lactam and dihydrothiazine rings (Table 1 and Table A).
As for PIR-1, fragments from the β-lactam ring side chain (m/z 112.0214, 124.0214 and
152.0164) are observed for PIR-2 (m/z 229.0641). The fragment m/z 211.0533
corresponds to hydrogenated m/z 209.0376, which has been previously discussed in
PIR-1 MS description. The mass of PIR-2 differs in a water molecule mass from the
first fragment at m/z 211.0533. Thus, on the view of the structure proposed for this
fragment, the structure of PIR-2 is suggested to correspond to a hydrated form of the
former.
PIR-9 (m/z 440.0576) has a mass increase of 15.9946 Da respect to PIR without any
change in DBE. An hydroxylated form of PIR may account for this observation.
Dehydration (440.076 - H 2 O → 422.0471) followed by decarboxylation of the
carboxylic acid (422.0471 - CO 2 → 378.0568) and a loss of acetic acid (378.0568 –
C 2 H 4 O 2 → 318.0361) were observed in the MS of this compound. The fragment m/z
207.0219, allows us to suggest the position of the hydroxyl group. As mentioned
139
previously, fragment m/z 209.0376 corresponds to the cleavage of the β-lactam ring.
The fragment m/z 207.0219 is analogous to that at m/z 209.0376 observed for PIR-1.
The 2H mass difference could be produced by the dehydration of this compound.
Therefore, the OH group is located in this part of the molecule. In Table A, the most
important fragments are explained.
Full structures for PIR-3 (m/z 268.0206) and PIR-10 (m/z 458.0237) could not be
assigned. The fragments m/z 112.0216 and 152.0165 in the MS of PIR-3 seem to
indicate that the compound contains the side chain of the β-lactam ring of PIR.
Additionally, fragments associated with pyridine (m/z 112.0216, 124.016 and 152.0165)
were detected in the MS of PIR-10. Moreover, the same fragmentation underwent by
the parent compound (ie, deacetylation: 458.0245 - Acetyl → 398.0031; followed by
decarboxylation: 398.0031 - CO 2 → 354.0130; and loss of CO: 354.0130 - CO →
326.0180), is observed. From these observations it can be deduced that PIR-10 differs
mainly from PIR in the pyridine moiety while the rest of the molecule is not altered.
CEFTIOFUR (TIO)
In the fragmentation study of the parent compounds the ion at m/z 241.0390 was
observed. This peak was assigned to the cleavage of the β-lactam ring in the parent TIO
antibiotic. When the MS spectrum of TIO-1 was studied, m/z 243.0545 was determined
to be the molecular ion. The difference of 2H between these ions, and the presence of
common fragments at m/z 156.0228 and 126.0121 in the spectra of the two compounds,
permits to suggest the structure of TIO-1 as the aldehyde resulting from the cleavage of
the β-lactam ring.

140
Capítulo 4
In the MS of TIO-3 the fragment m/z 396.0428, as in the parent TIO compound, is
observed. This fragment corresponds to the loss of thiofuroic acid from the parent
structure. The observation of two successive losses of CO 2 (414.0533 – CO 2 →
370.0636 and 370.0636 – CO 2 → 326.0737) allows us to suggest the presence of two
carboxylic acids in the molecule. In Table A the suggested structure for TIO-3 and
assignments for other fragments in the MS are shown.
The MS of TIO-4 (m/z 428.0698) shows common fragments with that of TIO-3 (m/z
396.0428, 352.0526, 201.0436 and 126.0120). This common fragmentation for the two
compounds seems to indicate a structural relationship between them. The difference in
mass between the two TPs fits with a methylation reaction. As only one decarboxylation
is observed (428.0698 – CO 2 → 384.0798), it can be concluded that TIO-4 corresponds
to a methylated TIO-3.
TIO-4 and TIO-5 have the same exact mass, which indicates the isomeric nature for
these two TPs. Nevertheless, fragmentation is very different from one to the other. The
loss of hydrogen sulfide (H 2 S) (m/z 428.0693 → 394.0818) that TIO-5 undergoes seem
to indicate that the sulphur atom is not included in a ring. Moreover, the loss of CO 2
(m/z 428.0693 → 384.0797) indicates that the molecule has a carboxylic acid. The
fragment m/z 329.0370 comes of the cleavage of a fragment C 4 H 5 NO 2 from the
molecular peak, which is only is possible in the dihydrothiazine ring. In spite of these
indications and the high fragmentation observed for this TP, it has not been possible to
suggest a coherent structure for TIO-5.
141
PENICILLIN G (PENG)
Among the TPs detected for penicillin G, PENG-3 (m/z 351.1020) resulted to have 16
Da higher MW than the parent compound. This increase in mass accompanies an
increase in DBE in one additional unit (DBE:10). These data suggest for PENG-3 the
structure of oxidized PENG. The ion that corresponds to one of the fragments from the
the β-lactam ring cleavage (m/z 176.0709) is observed. However, its complementary ion
(m/z 160.0423) is not visible in the spectrum. This observation led us to suggest that the
oxidation has taken place on the thiazolidine ring of the parent PENG. The fragment m/z
301.1189, resulting from the loss H 2 OS, resulted fundamental to assign sulfoxide-
PENG as the suggested structure for this TP.
PENG-8 (m/z 313.1223) differs only in one oxygen atom from PENG-7 (m/z 297.1271)
and they share some fragments in common in their MS spectra (m/z 249.1235 and
120.0808). The fragment 166.0533 indicates that the additional oxygen atom in
PENG-8 is on the penicillamine moiety, and therefore, on the sulphur atom.
Figure 2E shows the MS/MS spectrum of PENG-9. The exact mass of PENG-9 (m/z
367.1335) is 14.0156 Da higher than that of PENG-4, which corresponds to a gain of
CH 2 respect to this later. As in PENG-4, the m/z 160.0430 fragment is observed in
PENG-9 spectrum. Therefore, it can be suggested that methylation took place on the
carboxylic acid formed after β-lactam ring opening. The suggested structure is shown in
Figure 2E.
142
Capítulo 4
A 1)
O
O
HO OH
O
N
N
H S
NH3
AMOX
m/z 366.1118
HO
O
O OH
N NH O
H
H 3N
S
OH
AMOX-3
m/z 384.1224
HO
O
O
O H2
O NH N OH
OH HO
HN
N HN S
H
H3N
O
S
AMOX-1 AMOX-2
m/z 340.1326 m/z 366.1118
Figure A 1. Degradation pathways of AMOX in spiked milk samples.
143
O
A 2)
S NH2
N
H
HO OH
HN O O
PIR-1
m/z 226.0645 S
N
H
O
HN
OH
O
PIR-2
O
N
m/z 229.0641
S O
N
H S
HN
O
PIR-7
OH
m/z 396.0682 O
O
N
S
OH
N
H S
O
HN
OH
O
PIR-5 O O
N
m/z 382.0526
S O
O O N
O O H S
HN
S N PIR
N OH
H O m/z 424.0632
HN S
O O
PIR-8
O
m/z 396.0682 N
S
N O
H S OH
O
HN
PIR-4 OH O O
N
m/z 364.0420
S O
N
H S
N
PIR-9
O OH
m/z 440.581
O
O
H
S N
N
H O
HN S
PIR-6
m/z 382.0526
Figure A 2. Degradation pathways of PIR in spiked milk samples.
144
Capítulo 4
A 3)
O N O O O
O N
N
H3N
N HN N OH
O
S O
H3N S HN
S
TIO
O TIO-1
m/z 524.0363
m/z 243.0546
O O
O O
O
OH N N
O O N OH
H
O S
N
N
N
OH
O N TIO-4
H S
S m/z 428.0693
H3N
N
S
TIO-2 O OH
H3N m/z 414.0537 O O
N N
O N OH
H
S
N
S TIO-3
H3N m/z 414.0537
Figure A 3. Degradation pathways of TIO in spiked milk samples.
145
Table A. Structure elucidation of transformation products detected in thermally treated milk samples spiked with AMOX, PIR, TIO and PENG.
m/z m/z Error

TPs DBE Fragments Structure suggested Ref
(exp) (theo) (ppm)
AMOX
323.1056 HO
[C 15 H 19 N 2 O 4 S]+ 229.0641
277.1002 O
O 189.0692
AMOX- 340.1326 [C 14 H 17 N 2 O 2 S]+
340.1323 -0.9 7 [8,12,16,21,29]
1 [C 15 H 22 N 3 O 4 S]+ 229.0638 [C 9 H 13 N 2 O 3 S]+ HN OH
189.0688 [C 7 H 13 N 2 O 2 S]+ N
160.0423 [C 6 H 10 NO 2 S]+ H3N
H
323.1060 S 277.1005
160.0427
O
O
H2
NH N
207.0762 [C 10 H 11 N 2 O 3 ]+ OH
AMOX- 366.1118 [6,8,12,16,21,
366.1116 -0.6 9 160.0427 [C 6 H 10 NO 2 S]+ HO
2 [C 16 H 20 N 3 O 5 S]+ 28-30]
113.0344 [C 4 H 5 N 2 O 2 ]+ HN S
113.0346 O
207.0764
HO
367.0955 O
O
[C 16 H 19 N 2 O 6 S]+ OH
340.1322 340.1326
[C 15 H 22 N 3 O 4 S]+ N
AMOX- 384.1224 H NH [6,8,12,16,21,
384.1226 0.5 8 323.1058 H3N O
3 [C 16 H 22 N 3 O 6 S]+ 28,29]
[C 15 H 19 N 2 O 4 S]+ 367.0958
S
189.0690 [C 7 H 13 N 2 O 2 S]+
160.0424 [C 6 H 10 NO 2 S]+ OH
PIR
209.0379
112.0216 O
209.0376 [C 9 H 9 N 2 O 2 S]+
181.0429 [C 8 H 9 N 2 OS]+ S NH2
226.0645
PIR-1 226.0646 0.4 6 152.0164 [C 7 H 6 NOS]+ N --
[C 9 H 12 N 3 O 2 S]+ H
124.0216 [C 6 H 6 NS]+
HN O
112.0215 [C 5 H 6 NS]+ 181.0430
152.0165
124.0216 HO OH
211.0533 [C 9 H 11 N 2 O 2 S]+ O
229.0641 152.0164 [C 7 H 6 NOS]+
PIR-2 229.0642 0.4 5 S --
[C 9 H 13 N 2 O 3 S]+ 124.0214 [C 6 H 6 NS]+ N 211.0536
112.0214 [C 5 H 6 NS]+ H
HN
250.0099 [C 10 H 8 N 2 OS 2 ]+
157.0063 [C 5 H 5 N 2 O 2 S]+
268.0209
PIR-3 268.0206 -1.1 8 152.0164 [C 7 H 6 NOS]+ n.a --
[C 10 H 10 N 3 O 2 S 2 ]+
117.0117 [C 3 H 5 N 2 OS]+
112.0214 [C 5 H 6 NS]+
320.0524 209.0379 O
C 14 H 14 N 3 O 2 S 2 ]+ O O
292.0570 [C 13 H 14 N 3 OS 2 ]+
O
364.0420 226.0227 [C 9 H 10 N 2 OS 2 ].+ N
PIR-4 364.0419 -0.3 11 320.0522 [20,21,25]
[C 15 H 14 N 3 O 4 S 2 ]+ 209.0376 [C 9 H 9 N 2 O 2 S]+ S
169.0427 [C 7 H 9 N 2 OS]+ N
H S
152.0164 [C 7 H 6 NOS]+ HN 226.0229
112.0215 [C 5 H 6 NS]+ 169.0430
364.0419
O
[C 15 H 14 N 3 O 4 S 2 ]+
OH
320.0524 292.0573 O
[C 14 H 14 N 3 O 2 S 2 ]+ O
382.0526 292.0570 [C 13 H 14 N 3 OS 2 ]+ N
PIR-5 382.0523 -0.8 10 [20,21,25]
[C 15 H 16 N 3 O 5 S 2 ]+ 226.0227 [C 9 H 10 N 2 OS 2 ].+ S
OH
209.0376 [C 9 H 9 N 2 O 2 S]+ N
H S
169.0427 [C 7 H 9 N 2 OS]+ HN
152.0164 [C 7 H 6 NOS]+ 364.0420
112.0215 [C 5 H 6 NS]+
338.0628
338.0627
294.0729
[C 14 H 16 N 3 O 3 S 2 ]+
227.0307
294.0728 [C 13 H 16 N 3 OS 2 ]+ O OH
271.0204 O
O
382.0526 [C 10 H 11 N 2 O 3 S 2 ]+ H
PIR-6 382.0522 -1.0 10 S N [21,25]
[C 15 H 16 N 3 O 5 S 2 ]+ 227.0306 [C 9 H 11 N 2 OS 2 ]+
N
169.0427 [C 7 H 9 N 2 OS]+ H O
152.0164 [C 7 H 6 NOS]+ HN S
112.0215 [C 5 H 6 NS]+
271.0206
364.0419 O
[C 15 H 14 N 3 O 4 S 2 ]+ OH
O
320.0524
[C 14 H 14 N 3 O 2 S 2 ]+ O
396.0682 N
PIR-7 396.0678 -1.0 10 292.0570 [C 13 H 14 N 3 OS 2 ]+ [20]
[C 16 H 18 N 3 O 5 S 2 ]+ S
226.0227 [C 9 H 10 N 2 OS 2 ].+ N
O
209.0376 [C 9 H 9 N 2 O 2 S]+ H S
152.0164 [C 7 H 6 NOS]+ HN
364.0420
112.0215 [C 5 H 6 NS]+
364.0420
O O
O O
364.0423[C 15 H 14 N 3 O 4 S 2 ]+
396.0682 352.0782 S N
PIR-8 396.0678 -1.0 10 [20]
[C 16 H 18 N 3 O 5 S 2 ]+ [C 15 H 18 N 3 O 3 S 2 ]+ N OH
112.0215 [C 5 H 6 NS]+ H
HN S
352.0784
O
422.0471 OH
[C 17 H 16 N 3 O 6 S 2 ]+ O
378.0571 OH O O
440.0581 [C 16 H 16 N 3 O 4 S 2 ]+ N
PIR-9 440.0576 -1.1 11 422.0475 --
[C 17 H 18 N 3 O 7 S 2 ]+ 318.0361 S O
[C 14 H 12 N 3 O 2 S 2 ]+ N
H S 318.0.365
269.0046 [C 10 H 9 N 2 O 3 S 2 ]+ N 170.0270 242.0178
253.0094 [C 10 H 9 N 2 O 2 S 2 ]+
242.0174 269.0049
[C 9 H 10 N 2 O 2 S 2 ].+
225.0147 [C 9 H 9 N 2 OS 2 ]+
207.0219 [C 9 H 7 N 2 O 2 S]+
170.0270 [C 7 H 8 NO 2 S]+
152.0164 [C 7 H 6 NOS]+
112.0215 [C 5 H 6 NS]+
398.0031
[C 18 H 10 N 2 O 5 S 2 ]+
354.0130
458.0237 [C 17 H 10 N 2 O 3 S 2 ]+
PIR-10 458.0245 1.7 15 n.a --
[C 20 H 14 N 2 O 7 S 2 ]+ 326.0180
[C 16 H 10 N 2 O 2 S 2 ]+
310.0260 [C 12 H 10 N 2 O 6 S]+
141.0478 [C 6 H 9 N 2 S]+
TIO
144.0226
O
126.0120
+
196.0177 [C 9 H 9 N 4 O 3 S 2 ] N 156.0226
243.0546 156.0223 [C 5 H 6 N 3 OS]+ 196.0181 N
TIO-1 243.0545 -0.4 6 H3N --
[C 8 H 11 N 4 O 3 S]+ 144.0224 [C 4 H 6 N 3 OS]+
O
126.0119 [C 4 H 4 N 3 S]+
S O
HN
241.0390
O
OH
O
156.0226
O
+ N
285.0109 [C 9 H 9 N 4 O 3 S 2 ]
414.0537 241.0389 [C 8 H 9 N 4 O 3 S]+ N
OH
TIO-2 414.0533 -1.0 10 O N [31,32]
[C 14 H 16 N 5 O 6 S 2 ]+ 156.0225 [C 5 H 6 N 3 OS]+ H S
285.0111
N
H3N
396.0428 326.0740
[C 14 H 14 N 5 O 5 S 2 ]+
169.0430 O OH
370.0636
O O
[C 13 H 16 N 5 O 4 S 2 ]+
352.0526 N N
414.0537 [C 13 H 14 N 5 O 3 S 2 ]+ O N OH
TIO-3 414.0533 -1.0 10 --
[C 14 H 16 N 5 O 6 S 2 ]+ 326.0737 H
[C 12 H 16 N 5 O 2 S 2 ]+ S 370.0638
259.0491 [C 8 H 11 N 4 O 4 S]+ N
126.0120 259.0496
201.0436 [C 6 H 9 N 4 O 2 S]+ S
169.0436 [C 7 H 9 N 2 OS]+ 201.0441
126.0120 [C 4 H 4 N 3 S]+ H3N
410.0589
[C 14 H 12 N 5 O 4 S 2 ]+
396.0428
[C 14 H 14 N 5 O 5 S 2 ]+ 271.0383
O O
384.0798 O O
[C 14 H 18 N 5 O 4 S 2 ]+
N N
352.0526
O N OH
428.0693 [C 13 H 14 N 5 O 3 S 2 ]+ H
TIO-4 428.0698 1.2 10 --
[C 15 H 18 N 5 O 6 S 2 ]+ 317.0371 S 384.0795
[C 10 H 13 N 4 O 4 S 2 ]+ N
227.0485
285.0110 [C 9 H 9 N 4 O 3 S 2 ]+
271.0384 S
317.0373
[C 10 H 11 N 2 O 5 S 2 ]+ H3N
227.0484 [C 9 H 11 N 2 O 3 S]+ 285.0111
201.0436 [C 6 H 9 N 4 O 2 S]+
126.0120 [C 4 H 4 N 3 S]+
396.0429
[C 14 H 14 N 5 O 5 S 2 ]+
394.0818 [C 15 H 16 N 5 O 6 S]+
384.0798
[C 14 H 18 N 5 O 4 S 2 ]+
428.0693
TIO-5 428.0697 0.9 10 362.0553 [C 14 H 12 N 5 O 5 S]+ n.a --
[C 15 H 18 N 5 O 6 S 2 ]+
350.0917 [C 14 H 16 N 5 O 4 S]+
329.0370
[C 11 H 13 N 4 O 4 S 2 ]+
318.0654 [C 13 H 12 N 5 O 3 S]+
297.0112 [C 10 H 9 N 4 O 3 S 2 ]+
285.0652 [C 10 H 13 N 4 O 4 S]+
265.0388 [C 10 H 9 N 4 O 3 S]+
253.0394 [C 9 H 9 N 4 O 3 S]+
225.0504 [C 9 H 9 N 2 O 5 ]+
181.0609 [C 8 H 9 N 2 O 3 ]+
167.0449 [C 7 H 7 N 2 O 3 ]+
126.0120 [C 4 H 4 N 3 S]+
PENG
263.1213
174.0583 O
+ 136.0737 OH
263.1220 [C 14 H 19 N 2 OS]
O
177.1027 [C 10 H 13 N 2 O]+ H2N
309.1267
PENG-1 309.1278 3.4 7 174.0588 [C 7 H 12 NO 2 S]+ [3,6,15,33]
[C 15 H 21 N 2 O 3 S]+ 128.0529
136.0762 [C 8 H 10 NO]+ N
S
H
128.0533 [C 6 H 10 NS]+
177.1022
138.0917 289.1005
289.1008
O
[C 15 H 17 N 2 O 2 S]+ O
243.0953
243.0953 [C 14 H 15 NS]+
335.1063 203.0818 [C 11 H 11 N 2 O 2 ]+ H2
PENG-2 335.1060 -0.9 9 N [4,34]
[C 16 H 19 N 2 O 4 S]+ 176.0708 [C 10 H 9 NO 2 ]+ N O
159.0919 [C 10 H 11 N 2 ]+ 176.0706
138.0917 [C 8 H 12 NO]+ 159.0919 S
128.0531 [C 6 H 10 NS]+ 203.0815
OH
333.0912 305.0954
[C 16 H 17 N 2 O 4 S]+ 236.0376 O
323.1060
323.1065 O
OH
[C 15 H 19 N 2 O 4 S]+
O NH
305.0961
351.1009
PENG-3 351.1020 3.1 10 [C 15 H 17 N 2 O 3 S]+ --
[C 16 H 19 N 2 O 5 S]+
301.1189 [C 16 H 17 N 2 O 4 ]+ N
S
H
236.0380 [C 11 H 10 NO 3 S]+ 176.0706
203.0817 [C 11 H 11 N 2 O 2 ]+ O
189.0692 301.1189
189.0694 [C 7 H 13 N 2 O 2 S]+
176.0709 [C 10 H 9 NO 2 ]+
309.1267
335.1156 O O 335.1060
[C 16 H 19 N 2 O 4 S]+
OH
309.1261
353.1166 [C 15 H 21 N 2 O 3 S]+ HN
PENG-4 353.1156 -2.7 8 [3,6,15,33]
[C 16 H 21 N 2 O 5 S]+ 263.1205 [C 14 H 19 N 2 OS]+
NH2
174.0579 [C 7 H 12 NO 2 S]+
160.0423 [C 6 H 10 NO 2 S]+ 160.0427 S O
OH
335.1060
285.1267 86.0964
335.1165
O O
[C 16 H 19 N 2 O 4 S]+
285.1270 N
420.1952 [C 13 H 21 N 2 O 3 S]+
PENG-5 420.1961 1.9 9 HN --
[C 21 H 30 N 3 O 4 S]+ 261.1602 [C 15 H 21 N 2 O 2 ]+
176.0709 [C 10 H 9 NO 2 ]+ 176.0706 NH2
160.0423 [C 6 H 10 NO 2 S]+ O
261.1598 S
86.0965 [C 5 H 12 N]+
OH
Capítulo 4
Study of metabolome modification in cow milk after Enrofloxacin

administration by liquid chromatography coupled with high
resolution mass spectrometry
A. Junza1, J. Saurina2, J. Barbosa2, C. Minguillón3, D. Barrón1
1
Department of Analytical Chemistry, Campus de l’Alimentació de Torribera,
University of Barcelona, Avda. Prat de la Riba, 171, 08921 Sta. Coloma de
Gramenet, Barcelona, Spain
2
Department of Analytical Chemistry, University of Barcelona, Martí i Franquès,
1-11, 08028 Barcelona, Spain
3
Department of Pharmacology and Therapeutic Chemistry, Campus de
l’Alimentació de Torribera, University of Barcelona, Avda. Prat de la Riba, 171,
08921 Sta. Coloma de Gramenet, Barcelona, Spain
ABSTRACT
The performance of high resolution accurate mass spectrometry (HRMS) operating

in full scan MS mode was used as qualitative analysis of metabolomic profiles in
tissues of medicated chickens. The metabolomic approach was exploited to
compile analytical information on changes in the metabolome of muscle, kidney
and liver from chickens subjected to a pharmacological program with ENR. Data
consisting of m/z features taken throughout the entire chromatogram were
extracted and filtered to be treated by Principal Component Analysis. As a result, it
was found that medicated and non-treated animals and blanks were clearly
clustered in distinct groups.
Keywords: Enrofloxacin, Linear Trap Quadrupole-Orbitrap mass spectrometry,

metabolomics, multivariate analysis (PCA).
153
1. INTRODUCTION A number of accurate and sensitive

methods exist to detect and quantify
The administration of antibiotics, as a
quinolones, β-lactams, tetracyclines or
prophylactic or as growth promoters, to
macrolides in milk [5-12]. However,
animals destined to human consumption
studies addressing the identification and
is a controlled practice. However, their
determination of unknown metabolites
use is widespread in farms. The misuse
or degradation products from the
of these drugs in animals intended for
administered antibiotics are scarce.
human consumption results in the
Some of these studies deal with
presence of residues of antibiotics and
metabolome modification resulting after
their metabolites in foodstuff. Several
pharmacological treatment with
authors pointed out that the widespread
quinolones or β-lactams in chicken, pig,
presence of these compounds may
bovine or rats [13-19]. Nevertheless,
contribute to the development and
milk is a particularly sensitive food in
transmission of antibiotic-resistant
this regard. Milk is an excretion product
pathogenic bacteria through the food
where drugs and other xenobiotics are
chain [1,2]. Given their widespread
cleared. Moreover, milk and dairy
consumption in diversity of cultures and
products are broadly consumed,
particularly in childhood, this effect may
especially by certain ranges of
result specially significant when milk
population. Therefore, the studies
and dairy products are considered. More
addressing metabolome changes or
than 6 billion people worldwide
transformation products, from the
consume milk and dairy products [3].
common treatment of milk before
Dairy farms produce million tonnes of consumption, as a result of an antibiotic
milk intended for human consumption. veterinary treatment, are of particular
To ensure the safety use/intake of these interest. Nonetheless, the elucidation of
products, the European Union (EU) has antibiotic metabolites or transformation
established Safe Maximum Residue products in milk is not common [20-22].
Limits (MRLs) for residues of veterinary In this context, LC-MS techniques are
drugs in milk and animal tissues the most adequate to tackle the study of
intended to enter the human food chain unknown compounds occurring at very
[4]. low concentrations. Concretely, liquid
chromatography-high resolution mass
154
Capítulo 4
spectrometry (LC-MS) instruments conditions and manufacturing practices

using time-of-flight mass spectrometry as well as relationships among variables.
(LC-ToF) have been used to determine
The current work is focused on the
the exact mass of the compounds
search and identification of metabolites
detected. This information is used in
and TPs produced from enrofloxacin as a
combination with that provided by linear
result of the thermal treatment at which
ion-trap quadrupole-Orbitrap MS (LQT-
raw milk is subjected prior consumption.
Orbitrap MS), which produces MSn
Samples of cow milk were collected
spectra. The study of resulting data
during seven days of therapeutic
permits the elucidation of non-targeted
treatment with enrofloxacin and were
structures and the tentative suggestion of
compared with samples of milk from
degradation routes for the considered
non-treated cows in order to search for
drugs.
residues only existing in samples from
Additionally, the emergence of
medicated animals. Also, the influence
unexpected metabolites or the
of temperature on the stability of the
observation of an altered metabolic
diverse metabolites and transformation
profile may constitute a tool to discover
products of enrofloxacin was studied.
possible biomarkers of pharmacologic
The application of PCA in this context is
treatments, pathologic states and,
performed considering contents of
therefore, quality and safety markers for
enrofloxacin, its metabolites and other
milk. Such studies involve the process
unknown compounds whose presence
and interpretation of complex data
may depend on the process at which
obtained by LC-MS. Metabolomic
milk is submitted, among other factors.
multivariate chemometric tools are also
needed in this context to facilitate the
recovery of underlying information. In
2. EXPERIMENTAL
particular, principal component analysis
(PCA) constitutes the most frequently 2.1. Chemicals and reagents
employed method for exploratory studies
Acetonitrile (MeCN), methanol
in order to investigate patters in sample
(MeOH), formic acid (HCOOH), sodium
clustering as a function of a diversity of
dihydrogenphosphate (NaH 2 PO 4 ) and
variables. In the present case, treatment
sodium hydroxide (NaOH), all of
analytical grade, were purchased from
155
Merck (Darmstadt, Germany). Water M7). The samples were stored at -20ºC
was generated by a Milli-Q purification prior to analysis.
system of Millipore (Billerica, MA,
USA).
2.3. Heat treatment of samples
Solution of 0.1 mol·L-1 sodium
dihydrogenphosphate was adjusted to pH All cow milk samples were exposed to
10 with 5 mol·L-1 NaOH. thermal treatments consisting of heating
at 120ºC for 20 and 60 min (samples
Polymeric cartridges Oasis HLB
referred to as T120.20 and T120.60
(3cm3·60 mg-1) supplied by Waters
respectively) before the analysis.
(Mildford, MA, USA) were used for
Previously to heating, samples were also
solid phase extraction (SPE).
analysed. The results obtained were
Membrane filters Ultra free Durapore considered as control values (T0).
PVDF 0.22 µm from Millipore were
2.4. Sample preparation
used to filter the extract before injection
into LC-LTQ-Orbitrap. A validated method for determination of
quinolones and β-lactams in cow milk
2.2. Sample collection
was used for sample preparation [5].
Milk samples were provided by the farm Thus, to 2 g of milk, 0.5 mL of 0.1
La Saireta S.C.P (Vallfogona de mol·L-1 sodium dihydrogenphosphate
Balaguer, Lleida, Spain). Cows were solution at pH 10, and 2 mL of water
pharmacologically medicated with were added. The samples were shaken
Enrovet (Group Divasa Farmavic, Vic, using a vortex and were subsequently
Spain) whose active principle is centrifuged at 6000 rpm for 5 min. A
enrofloxacin (ENR). The SPE extraction was carried out with the
pharmacological treatment consisted of supernatant. The SPE cartridges were
the intramuscular administration of 5 preconditioned successively with 1 mL
mg·kg-1 of drug for three days. Milk of MeOH, 1 mL of water and 1 mL of
samples were collected before treatment 0.1 mol·L-1 sodium
(Blank sample (B)), for the three days of dihydrogenphosphate at pH 10. After
drug administration (M1-M3) and during sample loading, the cartridges were
the four days after the treatment (M4- washed with 3 mL of water and eluted
with 2 mL of MeOH. The methanolic
156
Capítulo 4
eluted fraction was evaporated to temperature 300ºC, drying gas (N 2 ) at a

dryness using a TurboVap LV under N 2 flow rate of 9 L·min-1, nebulizer gas
stream. The extract was reconstituted (N 2 ) 40 psi, fragmentor voltage 150V,
with 200 µL of water and centrifuged at skimmer voltage 60 V and OCT 1 RF
9000 rpm for 5 min. voltage 250 V. ToF-MS mass resolving
power was approximately 10,000
FWHM at m/z 922. Spectra were
2.5. Chromatographic and mass acquired over the m/z 50-1100 range.
spectrometry conditions Data storage was performed in profile
and centroid modes.
The LC-MS system consisted of an HP
Agilent Technologies 1100 LC equipped An HP Agilent Technologies 1100 LC
with an autosampler and coupled to a system equipped with an autosampler
6220 oa-ToF LC/MS mass spectrometer and coupled to an API 3000 triple-
with an ESI source (Agilent quadrupole mass spectrometer (QqQ)
Technologies, Santa Clara, CA, USA) (PE Sciex, Framingham, MA, USA)
working in positive mode. with a turbo ion-spray source in positive
mode was used to quantify ENR. The
The chromatographic separation was
column and chromatographic conditions
carried out on a Zorbax Eclipse XDB-C8
were the same as those used for analysis
column (5 μm, 4.6 × 150 mm) from
by LC-ToF. The optimized parameters
Agilent Technologies. A Kromasil C8 (5
were: capillary voltage 4500 V,
μm, 4.6 × 15 mm) pre-column supplied
nebulizer gas (N 2 ) 10 (arbitrary units),
by Akady (Barcelona, Spain) was used.
curtain gas (N 2 ) 12 (arbitrary units) and
The mobile phase was composed of an
drying gas (N 2 ) was heated to 400ºC and
aqueous solution of 0.1% HCOOH
used at 6500 mL·min-1 flow-rate. The
(solvent A) and MeCN with 0.1%
declustering potential (DP), focusing
HCOOH (solvent B) at a constant flow
potential (FP) and entrance potential
rate of 1 mL·min-1. The injection volume
(EP) were 45, 200 and 10 V,
was 20 µL. The gradient applied was:
respectively. Multiple reaction
from 0 to 1 min, 15% B; 4 min, 45% B;
monitoring (MRM) was used during the
7 min, 56% B; 8.5 min, 15% B; and 11
detection. Two different transitions were
min, 15% B. The conditions of ToF
followed for ENR. First transition (360
were: capillary voltage 4000V,
→ 316) was used for quantification and
157
second one (360 → 342) was used for maximum injection time was set to 100
confirmation. ms with one micro scan for MS mode
and to 500 ms with one micro scan for
An Accela LC system coupled to an
MSn mode. Given that some metabolites
LTQ Orbitrap Velos mass spectrometer,
were not fragmented in the trap, TPs
from Thermo Scientific (Hemel
were fragmented in the HCD Collision
Hempstead, UK), with an ESI source in
Cell. The HCD potential selected was 45
positive mode was used in the
V. The mass range was from m/z 100 to
elucidation of metabolites. Metabolites
1000.
and degradation products were separated
on a Pursuit UPS C18 column (2.4 μm, 2
× 50 mm) from Varian (Harbor City,
2.6. Auxiliary equipments
CA, USA) using the following
chromatographic method: from 0 to 3.5 Samples were heated with a laboratory
min, 1% B; 4.5 min, 25% B; 5 min, 50% oven (Selecta, Barcelona, Spain). A
B; 6.5 min, 50% B; 7.5 min, 25% B; 8.5 vortex mixer VX-200 of Labnet
min, 10% B and 11 min, 1% B. The International (Edison, NJ, USA) and a
optimized conditions were source Rotanta 460RS centrifuge of Hettich
voltage, 3.5 kV; sheath gas (N 2 ), 40 Zentrifuguen (Tuttlingen, Germany)
(arbitrary units); auxiliary gas (N 2 ), 10 were used in sample treatment. The SPE
(arbitrary units); sweep gas (N 2 ), 10 process was performed in a Supelco
(arbitrary units); and capillary vacuum manifold with disposable liners
temperature, 275°C. Default values were for 24 cartridges connected to a Supelco
used for most other acquisition vacuum tank (Bellefonte, PA, USA).
parameters (Fourier transform (FT), The extract evaporation was carried out
Automatic gain control (AGC), target into a TurboVap LV of Caliper Life
1·106 for MS mode and 5·104 for Science (Hopkinton, MA, USA). A
MSn mode). Milk samples were first Crison 2002 potentiometer (± 0.1mV)
analysed in full MS mode setting the with a Crison 5203 combined pH
Orbitrap mass resolving power at 30,000 electrode (Barcelona, Spain) was used to
FWHM at m/z 400. The successive adjust of pH of the phosphate solution.
analyses were done in MSn mode setting
the Orbitrap mass resolving power at
15,000 FWHM at m/z 400. The
158
Capítulo 4
2.7. Data treatment data matrix was then exported as comma

separated values (CSV) files. Standard t-
The LC-ToF data were treated with
tests were conducted for univariate
Mzmine2 [23] free software. This
statistics using R (Version 2.13.0) in
program provides a list of m/z for the
order to rank MS features according to
ions in mass spectra. In order to select
their discrimination significance (p-
the ions that correspond to metabolites
values and fold-change data was
or transformation products of ENR, the
calculated to detect those MS features
comparison between positive samples
up- or down-expressed in treated or
and blanks was made. The selected ions
control groups. Solo from Eigenvector
only appear in positive samples but not
Research was used for Principal
in blanks. Only the ions which appeared
Component Analysis (PCA) calculations
in the range between 1 to 9 min and
[26]. A detailed description of the
from 150 to 800 Da were considered. A
theoretical background of these methods
mass defect filter (MDF) of 120 mDa
is given elsewhere [27]. Data for
was also applied.
exploratory studies by PCA consisted of
To facilitate the interpretation of the
a set of 690 filtered features recorded
resulting MS spectra, METLIN
from a series of 72 sample injections.
Metabolomics Database [24], which
Data were autoscaled to provide similar
contains tandem mass spectrometry data
weights to all variables so contributions
of metabolites, was used. The search was
of minor and major signals had a similar
made by matching the exact mass,
influence on the model. The study of
molecular formula or/and common
scores was conducted to find out patterns
fragments with other compounds.
of sample characteristics, such as
In order to study the behaviour respect a
veterinary and thermal treatments. The
diversity of variables of metabolites and
plot of loadings provides information
transformation products of ENR by
dealing with potential characteristic
Principal Component Analysis. LC-
markers for the different processes.
HRMS/MS raw files were first
converted to mzXML format using
MSConvert. Automatic peak detection
and integration was performed using
XCMS package for R [25]. The resulting
159
duplicate. The milk samples from
3. RESULTS AND DISCUSSION medicated animals were collected during

the pharmacological treatment (DT:
3.1. Quantification of ENR in milk from Days 1-3) and post-treatment, i.e., after
medicated cows finishing it (PT: Days 4-7). These
The amount of metabolites or samples were first analysed by LC-QqQ,
transformation products formed in milk prior to any thermal treatment, using the
was expected to be dependent on the quantification and confirmation
concentration of the parent compound transitions given in section 2.5. ENR
present in samples from medicated was also determined in samples of milk
animals. ENR was analysed in milk from that were thermally treated in two
medicated cows by LC-QqQ using the different conditions, namely: 120 oC for
matrix-matched calibration method with 20 min (T120-20) and 120 oC for 60 min
standards prepared at concentrations (T120-60). Table 1 shows the results
from 0.1 to 3 MRL, being MRL the obtained in the quantification of ENR in
maximum residue limit established by the above mentioned samples. As
European Regulation 37/2010. Given expected, the concentration of ENR
that the presence of internal standard increased during the pharmacological
(IS) could interfere in the search of treatment and decreased when the
metabolites and TPs, IS was not added administration of drug was finished.
neither to calibration curves nor to the Also, thermally treated samples
milk samples from cows medicated with presented lower values of ENR than
ENR. those not heated.
Standards at each level of the calibration

curves were prepared and assayed in
160
Capítulo 4
Table 1. Quantification of ENR in milk samples by LC-QqQ.
ENR (µg/kg)
T0 T120-20 T120-60
1DT 16.1 ± 1.5 12.7 ± 1.9 10.7 ± 0.2
2DT 19.9 ± 11.8 ± 0.4 12.2 ± 0.2
3DT 21.9 ± 1.7 18.8 ± 1.8 12.9 ± 1.9
1PT 6.7 ± 2.2 6.2 ± 1.0 5.5 ± 0.1
2PT 6.1 ± 0.8 6.0 ± 0.1 3.9 ± 2.5
3PT 4.2 ± 0.3 3.3 ± 0.1 2.9 ± 0.1
4PT 2.5 ± 0.4 1.9 ± 0.2 1.4 ± 0.2
3.2. Search and characterization of CIP and ENR, respectively, were also
metabolites and TPs in milk from detected. Other ions found in samples
medicated cows were 263.0826, 291.0783, 334.1198,
346.1198, 348.1354, 360.1354,
In order to get information of non-target
374.1511, 376.1667 and the isomers
compounds (e.g., metabolites or
390.1460. These compounds fitted with
transformation products) in samples, a
those previously described [21].
high resolution ToF mass analyser was
Besides, twelve additional compounds
used. Spectra were acquired in full scan
were detected, which corresponded to
mode.
m/z 302.1348, 307.1095, 321.0886,
When treated and blank milk samples
329.1496, 350.1518, 350.1700 and
were compared, 22 compounds were
405.2135. Some of them were found to
detected in treated milk which did not
proceed from the quinolone structure
appear in blank samples. The
while others were attributed to changes
elucidation of the structure of these
in the cow metabolism as a consequence
compounds was carried out using the
of the pathologic process for which they
MS2 spectra obtained by LC-LTQ-
were treated.
Orbitrap. In addition to the principal
active principle administered, ENR (m/z
360.1718) and its main metabolite
ciprofloxacin (CIP) (m/z 332.1405), the
ions with m/z 306.1248 and 334.1561,
corresponding to desethyl derivates of
161
3.2.1. Compounds derived from the presence of this compound suggested

quinolone structure that the peak with m/z 307.1095 could
be attributed to the reduction of the
The MS2 spectra of ion m/z 321.0886
carboxylic acid in ENR, which yields an
fitted with the spectra of a compound
alcohol group in a terminal carbon,
that results from oxidative break-up of
unlike what explained previously [21].
the piperazine ring. This compound was
In Table 2, the experimental and
previously identified in a study about
accurate m/z values for all new found
the biotransformation of
ions, the molecular formula, the
fluoroquinolones in a membrane
assignation error in ppm and their
bioreactor treatment of wastewater [28].
retention times (t R ) are given.
Figure 1A shows the MS2 spectrum of
Assignation errors were lower than 2
the compound with m/z 321.0886. The
ppm in all cases.
Table 2. Accurate m/z values, the molecular formula, the assignation error in ppm and
their retention times (t R ) for all new found ions.
Molecular
m/z experimental m/z theorical Error (ppm) t R (min)
formula [M + H]+
4.1, 4.5, 5.5,

302.1348 302.1347 C 12 H 20 N 3 O 6 + 0.3
5.7
307.1095 307.1089 C 15 H 16 N 2 O 4 F+ 2.0 6.5
321.0886 321.0881 C 15 H 14 N 2 O 5 F+ 1.6 6.6
329.1498 329.1496 C 18 H 21 N 2 O 4 + 0.6 3.5, 5.0
350.1518 350.1511 C 17 H 21 N 3 O 4 F+ 2.0 5.1
350.1705 350.1710 C 17 H 24 N 3 O 5 + 1.4 4.7
405.2135 405.2132 C 20 H 29 N 4 O 5 + 0.7 3.4, 4.2
162
321.0886
100
A) B)
136.0762
12
120.0811
Relative Abundance
Relative Abundance
50 166.0865
6
Tyr – NH3
91.0543
CO CH2 CH2
2O
CO NH3
303.0782 107.0493 146.0604 206.0815
270.1124
120.0811 192.0656
217.0411 257.0724 262.0383 H2O 238.1230 284.1288 312.1206 329.1498
0 0
110 120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220 230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
m/z m/z
86.0964
100
C) D)
129.1026
100
Lys
237.0871
192.0656
Relative Abundance
Relative Abundance
84.0809 220.0605
120.0811 50
50
136.0761 350.1518 202.0499
101.0711 174.0551 NH3
H2O
H2O
CO2 + CH
209.0921 Lys – NH3
136.0759 164.0708
209.0923 330.1457
226.1189 146.0602 CO
NH3 312.1349 CO CO
184.1084 HF 94.0650
70.0653 166.0865 244.1297 H2O 131.1180 CO
202.1229 350.1705
H2O 274.1559
0 0
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340
m/z m/z
Figure 1. MS/MS spectra of metabolites of ENR detected in thermally treated milk coming from medicated cows.
Two different chromatographic peaks carboxylic acid and demethylation. The

with m/z 329.1498 were detected at 3.5 base peak of m/z 129.1026 fitted with
and 5.0 min, as reported in a previous the amino acid lysine (Lys). With this
study [21]. The most significant information and that obtained from the
fragments in the assignment of the rest of fragments, the structure
structure of the compound eluting at 5.0 suggested for the metabolite was the
min (Figure 1B), were 284.1288, conjugation of a methyl-Lys with the
270.1124, 238.1230, 206.0815, basic structure of fluoroquinolones
166.0865, 136.0762 and 120.0811. based on an aromatic ring fused with a
Fragments 284.1288 and 270.1124 heteroaromatic ring.
suggested the presence of a terminal
The last metabolite corresponds to m/z
amide next to a C atom. The following
350.1705 and tentative molecular
net loss to give the fragment 238.1230
formula C 17 H 24 N 3 O 5 +. The most
fitted with 2 atoms of oxygen which
important signals in the MS2 spectrum
could be explained for 2 hydroxyl
(Figure 1D) for the assignation of
groups. The fragments 166.0865,
structure were 220.0605 and 131.1180
136.0762, 120.0811 indicated that the
which are complementary fragments.
metabolite was conjugated with tyrosine
The ion m/z 131.1180 was attributed to
(Tyr). The suggested structure of this
Lys while the fragment 220.0605 and
metabolite corresponded to a benzylic
the successive neutral losses of water
acid from reduction of quinolone
and two decarbonylation indicated that
conjugated with a deaminated Tyr.
the metabolite came from enamine
The compound with m/z 350.1518, with hydrolysis conjugated with Lys as can
a molecular formula C 17 H 21 N 3 O 4 F+, be observed in Figure 1D.
was also found in milk from medicated
The suggested metabolomic pathway of
cow but not in blank milk. The key
ENR is shown in Figure 2. All
fragmentations to elucidate its structure
compounds obtained at this step are of
(Figure 1C) were the ions with m/z
Phase I. It was proposed that ENR
330.1457, 274.1559 and 129.1026. The
metabolism occurred via the oxidation
first fragment was consistent with the
of the richest nitrogen atom in electrons
presence of fluorine atom in the
of the molecule (1) (i.e., piperazine ring)
molecule. The ion 274.1559
or their α position (2)(3). The metabolite
corresponded to loss of CO 2 of
164
Capítulo 4
(3) resulted of the additional oxidation Phase II: Amino acid conjugations
of the aromatic ring. The oxidation in α
Figure 3 shows other metabolites from
position of N of piperazine led to a ring
the conjugation of several amino acids.
opening (4) and subsequent oxidation of
Thus, from (6) and the opening
ethyl group to give an amide (5) which
quinolone ring the conjugation of amino
was hydrolyzed resulting (6). This
acids like Lys and Tyr, or sometimes
compound can be also obtained from (2)
their deaminated analogous, could take
by inverting the order of oxidation and
place leading to (15) and (16). The
hydrolysis steps (7)(8). (9) can be
metabolite (13) losing the cyclopropyl
generated by formylation of (6) or for
was then conjugated with methyl-Lys
the oxidation of the piperazine ring of
giving (17).
the metabolite (10) which occurred
through formylation of (7). Other
metabolites from (6) were (11), (12) and
(13). (13) can also come from (5) by
oxidation of N aniline type and give
(14) by formylation.
165
O O O O
O O F F
F OH OH
OH O N N
1 2
NH NH
NH N N N
N
m/z 376.1667 O m/z 374.1511
O O
OH O O O O F O O O O
F F OH F F
OH OH OH OH
N N
N
3
N N N
4 10
N N N NH
N
H
NH2
H N
H H2N 7 H N
O
m/z 390.1460 m/z 334.1561 ENR m/z 332.1405 m/z 360.1354
m/z 360.1718
O O O O O O
F F F
OH OH OH
5
N N N N
8
NH
6
H2 N
H HN
NH H3N
O m/z 348.1354 m/z 306.1248 m/z 346.1198
O O
F
OH
O O O O
F N N
F H2
OH OH H N
H
9
H3N N
13 HO
N
H2
N
11
O
m/z 334.1198
O O m/z 263.0826 m/z 307.1089 O O
O F F
OH OH
14
H N NH N N
H
HO
H2
12
m/z 291.0783
m/z 321.0881
Figure 2. Suggested degradation pathway for ENR in milk coming from medicated cows (I).
OH
H3N
N
15
O O O
F m/z 329.1496
OH O O O O
N F HO
6
N OH OH
H
H3N N N N NH2 O O
H H H
m/z 306.1248 H3N H3N
OH
O
16
O
N N
H H
m/z 350.1705 NH3
O O
F
OH
O O N
F
OH O O H2N
O
F
H3N N
13 OH CH3
H3N N
m/z 263.0826
H
NH3 17
m/z 350.1511
Figure 3. Suggested degradation pathway for ENR in milk coming from medicated cows (II).
3.2.1. Other compounds spectrum matched with a dipeptide

phenylalanine (Phe)-tyrosine (Tyr) as
Other four compounds, which were not
the Figure 4B shows. The assignation
related with the structure of quinolones,
error is also shown in Table 2.
were also found in milk from medicated
cows. Four chromatographic peaks with The last metabolite elucidated, m/z
the same m/z 302.1348 were detected. In 405.2135 (Figure 4C), was attributed to
all the cases, the mass spectra were a tripeptide. The fragments with m/z
identical which indicated that they may 240.1347 and 166.0864 were
be isomers of a molecule with two complementary fragments; the latter
stereogenic centres and, therefore, four coinciding with phenylalanine (Phe). In
isomers were possible. The fragments the mass spectrum database, the
m/z 205.0818, 155.0816 and 148.0604 fragment m/z 294.1814 was described as
were found in the METLIN database as the dipeptide Phe-Lys. The Figure 4C
residues related to three different amino shows the tandem mass spectrum with
acids. As can be observed in the mass the explanation of each fragment.
spectrum of Figure 4A, the m/z Assignation error was 0.7 ppm as
302.1348 was attributed to a tripeptide. indicated in Table 2.
The fragments m/z 155.0816 and
148.0604 corresponded at two
complementary parts of the tripeptide,
which matched with proline (Pro)-
glycine (Gly)- glutamic acid (Glu). The
assignation error for this compound was
0.3 ppm as given in Table 2.
As explained previously (section 3.2.1),

two different compounds with m/z
329.1496 were detected. The elucidation
of the peak eluted at 5.0 min was
explained above. In order to elucidate
the structure of the peak obtained at 3.5
min, the MS/MS spectrum was searched
in METLIN database. In this case, the
168
Capítulo 4
155.0816
100
Glu
A)
Gly + Pro
Pro
Gly
302.1348
Relative Abundance
Glu
50
127.0867
205.0818
CO
85.0284
NH3 H2O
H2O
148.0604 187.0712
217.1076
170.0453 284.1267
0
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300
m/z
120.0812
B)
12
Tyr Phe
182.0816
136.0761
Relative Abundance
165.0551
6
NH3
Tyr
CO2
103.0544
NH3 CO2
H2O
147.0443 283.1449 329.1496

208.0615
0
100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320
m/z
(Gln – NH3) + Lys

25
129.1025 240.1347
C) Gln – NH3
Lys
Lys
Relative Abundance
84.0808
222.1238
10 Phe
258.1451
120.0809
Phe
Phe + Lys
CO
166.0864 H2O
H2O
139.0868 195.1128 294.1814 304.1655 CO 405.2135
NH3 NH3
CO2
359.2084 387.2031
277.1549
0
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z
Figure 4. MS/MS spectra of peptides detected in thermally treated milk coming from
medicated cows with ENR.A) Glu-Gly-Pro. B) Phe-Tyr. C) Gln-Lys-Phe
169
3.2.1. PCA analysis column cleaning periods (t R > 10 min).

Extracted features were further sorted
Prior to chemometric analysis, raw LC-
according to their ability to discriminate
MS data consisting of MS features taken
among the predefined classes. For such
throughout the entire chromatographic
a purpose, statistic tests were used to
and spectral domains was transformed
search for those ions occurring at
and pretreated to provide compatible file
significantly higher amounts (p < 0.01)
formats as well as to improve the data
in positive samples related to veterinary
quality. Typical signal pre-processing
treatment in comparison with blank
mechanisms such as peak alignment
milks (and vice versa). Hence, features
were applied to minimize the variability
retained corresponded to potential
among runs. In the chromatographic
biomarkers while compounds/features
dimension, the shifting tolerance was set
occurring at similar levels in blank and
to 15 s and peak width variability of ±10
positive samples were discarded for
s were allowed. Due to the high
analysis. After this filtering process, the
accuracy and resolution in the MS
number of features was reduced from
spectra, mass error lower than 3 ppm
2000 gross contributions to 700,
was considered. Data was further
approximately. Data selected was
filtered to try to remove irrelevant
arranged in a table, or data matrix, of
variables and noise according to several
signal intensities in which each row
analytical and statistic criteria. In this
corresponded to a given sample and
case, signal-to-noise and the signal
each column corresponded to a
intensity thresholds for taking peaks
characteristic retention time and m/z.
were set to 25 and 3000 counts,
The number of runs under analysis,
respectively. Sections of chromatograms
including replicates, was 72 consisting
without descriptive compounds were
of 9 blank milks, 20 non-heated milk
also removed, which included the death
assays from treated cow, and 42 heated
volume region (t R < 1.25 min) and
milk assays from treated cow.
170
Capítulo 4
A) 70 1
-
60
Blank Post-treatment
Scores on PC 2 (21.6%)
50 samples samples
3
40 26
25 Drug and +
30 - 64 metabolites
5 Treated
20 28
24 samples
7 30 27
29 23 21 19
10
10 9 48
43 14
11
18 20 12 13
4951
50 46 22 40 15
0 47
45 44 17
16
41
4233
-10 8 65 67
66 64 3937
34
3132
38
36
68 70 69
+ 62 35
-20 72 71 6361
5259
58 5360 55
5456 57
-30
-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50
B) 0.08
330
341 332 347 486
283 350 263
415
259
271 325 273
301 369
247
225
265
222
328
218
285
292
266
287
255
217
256
211
2277
299
279
278
314
296
280
67
302
303
286
294
272
305 414
405275
412
417
342
411
289
326
419
379
375
298240
397
246
270 315
388
396
329452
453
348 437 611605
457
0.06 224
254
219
291 284
276
258
264
262311
310
253
458393
398
336 406
490 349 519
416
308 534
474 364
516 537 422
548
210
209
257227
306
234 229
297
251
221
318 461
410 496
499
324
510
479 623
628
656 616
613
632
502 575
550
569
316
567 487
300 589
585
352618
635
471597
615
376345
248
226 360
359373
491
493
488 413
428 670
655
661
665
664
431
389660
435
434 685 561
512565
666
485682663 564
508
514
579562 590
250
401355 386
500
521 433
408
558 676
450 607
600
Loadings on PC 2 (21.65%)
241
260
327 526
489
290 524
407675
427
680
441
451 322 596 528 606
269625576
609
573
568
560
592
556
538671
331184
317 507523 566
634
394
659 688
418
403 687
612
650 368 624
233
216
460 532
522
627
539
552
0.04 338 356 395 536293 637 503
472
440
480473
531362
443
645
242
244
377
423295
378
387381
581 677
281
261 268
157
497
574
288
307
158 639
649
320374
636
553 546520
545
540 517 239
163
150
153
367 557 651 392
344
343
358
354 420689
580629
409
572
447122 115
111673678
154 309
647 469 346
340 380
333
335
334
563 463
501 100
424 61 59
60
669 357
35
34339
116323
372312245
652 582197
321 505 118
228110108
109 686 527 598
646
648
0.02 468 657
20
608
19
1840
414 2 668
30 65
48
47
46
64
49 593
544
630 638
654
653
643
571 525
484252
214215
249
361 543
533
515 9417
482529 642
658
640
167
124
8 602 104
337 63
674
66 45504
159
617
44
38
12939
684
84
442106
282
274
186
391 476 237 1071 586 173 439170
641
644 67
79
662
622 382
201
203
191
165
89
85
11
12
212
177187
610 188
584 455
390436 492 232238 243179 213 603 91 230
231135
0 438384
400
679 667
626 477495445
587 551
601
595
185 22321 570555 370
363
559
429189 32 112
113
385
176
182
426
404
456
430
371 583
202
206190
475
194 554498 174 166672 365
351 99
192
198
164
494 464
459 518 454 193690 130 511
577 175 169 152 57
58
432
449
86
448 180
207
172
16087
1
81168
81
183
10
196
446
421 478 481
465 121
483 155Enr 399
425
55
56 50123
204
319
304
156
171 82
125127
547 128 Cip54 105
513 51
142
62
2772151
29
69120
71
103 140
444
466
467
470 138 200
199
205
195
73
7568
70
83 117
162
178 78
-0.02 462 530
509 102 402 383
236
97 144
24143 93
77
9
549
535541 136 11915
45
37
80
23
53
98
101
36
16 33
31
22
604 599 313
14 126366 147
146
145 90 95
92
88
52
74
96
766
28
588 614 2
149 353 220 43
591 542
578
148 7
-0.04 619
620633
594
631 621 139
141
133
134137
114
208
235
681506
683 132
131
Drug and
-0.06 metabolites
-0.04 -0.02 0 0.02 0.04 0.06
Loadings on PC 1 (26.88%)
Figure 5. Results of the exploratory study of milks by PCA. A) Plot of scores; B) Plot of
loading.
171
PCA was applied to the data matrix in the heating time. These results were
order to get an overall picture of the attributed to the progressive thermal
behavior of samples as a function of degradation of compounds when
veterinary and thermal treatment as well subjected to high temperatures.
as to identify features representative of
Regarding the map of variables, the plot
each sample class. As indicated above,
of loading of PC1 vs PC2 was complex
data was first autoscaled to equalize the
because the huge amount of features
influence of major and minor
retained (Figure 5B). Most of them,
contributions to the model. Results
however, were attributed to endogenous
obtained are summarized in Figure 5A.
compounds with altered (increased or
The scatter plot of scores of PC1 and
decreased) concentrations with respect
PC2 showed three main clusters
to the blank class. Components up-
corresponding to blanks, milks produced
expressed in blank milks were mainly
during the days when the cow was under
located to the left part of the graph. In
the pharmacological treatment (days 1
contrast, compounds such as ENR and
to 3) and milks obtained post-treatment,
related molecules, specific of samples
i.e., after finishing the drug
from medicated cow, were to the right.
administration (days 4 to 7). PC1
For instance, CIP and other metabolites
reasonably explained the sample
were encountered in the same area.
distribution depending on the ENR and
Degradation molecules occurring as a
ENR metabolite levels. It can be seen
consequence of milk heating were
that blanks were located to the left,
spread throughout the bottom-left
treated samples to the right, and post-
quadrant. Rather than xenobiotic nature,
treatment samples in the center,
these molecules seemed to be mainly
approximately. The influence of heating
related to transformation products of
treatment on the sample distribution was
diverse major endogenous components.
also evidenced in the graph. Samples
subjected to the thermal treatment
displayed lower scores on PC2,
especially for the longer heating 4. BIBLIOGRAPHY
periods. Besides, the plot suggested that [1] A. Fàbrega, J. Sánchez-Céspedes, S. Soto, J.
concentrations of ENR and ENR Vila. Quinolone resistance in the food chain. Int.
J. Antimicrob. Ag., 31 (2008) 307-315.
metabolites decreased with increasing
172
Capítulo 4
[2] F.J. Lara, A.M. García-Campaña, F. Alés- out supported liquid extraction (SOSLE), Anal.
Barrero, J.M. Bosque-Sendra, L.E.García- Chim. Acta, 820 (2013) 56-68.
Ayuso, Multiresidue Method for the
[8] B.J.A. Berendsen, L.A.A.M. Stolker,
determination of quinolone antibiotics in bovine
M.W.F. Nielen, Selectivity in the sample
raw milk by Capillary Electrophoresis-Tandem
preparation for the analysis of drug residues in
Mass Spectrometry, Anal. Chem., 78 (2006)
products of animal origin using LC-MS, TRAC-
7665-7673.
Trends Anal. Chem., 43 (2013) 229-239.
[3] http://www.fao.org/agriculture/dairy-
[9] A. Freitas, J. Barbosa, F. Ramos,
gateway/milk-and-milk-products
Development and validation of a multi-residue
[4] Commission of the European Communities, and multiclass ultra-high-pressure liquid
Commission Regulation (EU) No. 37/2010 of 22 chromatography-tandem mass spectrometry
December 2009 on pharmacologically active screening of antibiotics in milk, Int. Dairy J.,
substances and their classification regarding 33(2013) 38-43.
maximum residue limits in foodstuffs of animal
[10] E. Karageorgou, A. Myridakis, E.G.
origin, Off. J. Eur. Comm. 37/2010 (2009)
Stephanou, V. Samanidou, Multiresidue LC–
L15/1.
MS/MS analysis of cephalosporins and
[5] A. Junza, R. Amatya, D. Barrón, J. Barbosa. quinolones in milk following ultrasound-assisted
Comparative study of the LC–MS/MS and matrix solid-phase dispersive extraction
UPLC–MS/MS for the multi-residue analysis of combined with the quick, easy, cheap, effective,
quinolones, penicillins and cephalosporins in rugged, and safe methodology, J. Sep. Sci., 36
cow milk, and validation according to the (2013) 2020-2027.
regulation 2002/657/EC. J. Chromatogr. B, 879
[11] L. Kantiani, M. Farré, D. Barceló, Rapid
(2011) 2601- 261.
residue analysis of fluoroquinolones in raw
[6] A. Junza, N. Dorival-García, A. Zafra- bovine milk by online solid phase extraction
Gómez, D. Barrón, O. Ballesteros, J. Barbosa, followed by liquid chromatography coupled to
A. Navalón, Multiclass method for the tandem mass spectrometry, J. Chromatogr. A,
determination of quinolones and beta-lactams, in 1218 (2011) 9019-9027.
raw cow milk using dispersive liquid-liquid
[12] M. Lombardo-Agüí, L. Gámiz-Gracia, C.
microextraction and ultrahigh performance
Cruces-Blanco, A.M. García-Campaña,
liquid chromatography-tandem mass
Comparison of different sample treatments for
spectrometry, J. Chromatogr. A, 1356 (2014)
the analysis of quinolones in milk by capillary-
10-22.
liquid chromatography with laser induced
[7] A. Kaufmann, P. Butcher, K. Maden, S. fluorescence detection, J. Chromatogr. A, 1218
Walker, M. Widmer, Multi-residue (2011) 4966-4971.
quantification of veterinary drugs in milk with a
[13] M.P. Hermo, P. Gómez-Rodríguez, J.
novel extraction and cleanup technique: Salting
Barbosa, D. Barrón, Metabolomic assays of
173
amoxicillin, cephapirin and ceftiofur in chicken [19] J. Sun, L.K. Schnackenberg, S. Khare, X.
muscle: Application to treated chicken samples Yang, J. Greenhaw et al. Evaluationg effects of
by liquid chromatography quadrupole time-of- penicillin treatment on the metabolome of rats.
fligth mass spectrometry, J. Pharm. Biomed. J. Chromatogr. B, 932 (2013) 134-143.
Anal., 85 (2013)169-178.
[20] S. B. Turnipseed, J. M. Storey, S. B. Clark,
[14] M. P. Hermo, J. Saurina, J. Barbosa, D. K.E. Miller, Analysis of Veterinary Drugs and
Barrón, High resolution mass spectrometry Metabolites in Milk using quadrupole Time-of-
applied to the study of metabolome Fight liquid Chromatography-Mass
modifications in various chicken tissues after Spectrometry, J. Agr. Food Chem., 59 (2011)
amoxicillin administration, Food Chem., 153 7569-7581.
(2014) 405-413.
[21] A. Junza, S. Barbosa, M.R. Codony, A.
[15] F. J. Morales-Gutiérrez, M.P. Hermo, J. Jubert, J. Barbosa, D. Barrón, Identification of
Barbosa, D. Barrón, High resolution mass metabolites and thermal transformation products
spectrometry applied to the identification and of quinolones in raw cow’s milk by liquid
transformation products of quinolones from chromatography coupled to high resolution mass
stability studies and new metabolites of spectrometry, J. Agr. Food Chem., 62 (2014)
enrofloxacin in chicken muscle tissues, J. 2008-2021.
Pharm. Biomed. Anal., 92 (2014) 165-176.
[22] A. Junza, A. Montané, J. Barbosa, C.
[16] F. J. Morales-Gutiérrez, J. Barbosa, D. Minguillón, D. Barrón, High resolution mass
Barrón, Metabolic study of enrofloxacin and spectrometry in the identification of
metabolic profile modifications in broiler transformation products and metabolites from b-
chicken tissues after drug administration, Food lactam antibiotics in thermally treated milk, J.
Chem., 172 (2015) 30-39. Chromatogr. A, 1368 (2014) 89-99.
[17] T. Reyns, S. de Boever, S. Schauvliege, F. [23] http://mzmine.sourceforge.net

Gasthuys, et al., Influence of administration
[24] https://metlin.scripps.edu
route on the biotransformation of amoxicillin in
the pig. J. Vet. Pharmacol. Therap., 32 (2008) [25] C.A. Smith, E.J. Want, G. O'Maille, R.
241-248. Abagyan, G. Siuzdak. XCMS: Processing Mass
Spectrometry Data for Metabolite Profiling
[18] B.J.A. Berendsen, M. L. Essers, P.P.J.
Using Nonlinear Peak Alignment, Matching,
Mulder, G.D. van Bruchem, A. Lommen, W. M.
and Identification Anal. Chem., 78 (2006) 779-
van Overbeek, L.A.A.M. Stolker, Newly
787.
identified degradation product of ceftiofur and
cephapirin impact the analytical approach for [26]
quantitative analysis of kidney, J. Chromatogr. http://www.eigenvector.com/software/solo.htm
A, 1216 (2009) 8177-8186.
[27] D.L. Massart, B.G.M. Vandeginste, L.M.C.
Buydens, S. de Jong, P.J. Lewi, J. Smeyers-
174
Capítulo 4
Verbeke, Handbook of Chemometrics and macrolide and fluoroquinolone antibacterials in

Qualimetrics, Elsevier, Amsterdam, 1997. membrane bioreactor treatment by ultrahigh-
performance liquid chromatography/quadrupole
[28] S. Terzic, I. Senta, M. Matosic, M. Ahel.
time of flight mass spectrometry. Anal. Biomed.
Identification of biotransformation products of
Chem., 401 (2011) 353-363.
175
CAPÍTULO 5
Resultados y discusión
Capítulo 5
5. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
En este apartado de la tesis, se recoge una discusión global de los resultados más
interesantes obtenidos en este trabajo. En primer lugar se describen los distintos
métodos multiresiduo desarrollados y validados, siguiendo las etapas del proceso
analítico. Para que la leche pueda ser apta para el consumo humano, es necesario que
pase un determinado tiempo entre la última administración del antibiótico al animal y la
recogida de la leche, con el fin de que pueda eliminarse del organismo los antibióticos y
sus metabolitos. Si no se respeta este tiempo, la leche procedente de vacas medicadas
con antibióticos puede contener residuos de éstos, además de compuestos resultantes de
la metabolización en el animal. Por otro lado, también requiere que se eliminen los
microorganismos patógenos a través de la aplicación de determinados tratamientos
térmicos. Como se ha comentado en la introducción, con el fin de garantizar la
seguridad del consumidor, la UE estableció los MRL de medicamentos veterinarios en
la normativa CE/2377/90 y en sus sucesivas modificaciones, la última de las cuales es
37/2010. En dicha legislación, se tienen en cuenta los residuos del compuesto
administrado y solamente en casos muy excepcionales como en el caso de ENR, se
considera la determinación de su principal metabolito CIP. Es de especial interés el
estudio de la metabolización de los antibióticos y como pueden afectar los tratamientos
térmicos sobre éstos, dando lugar a productos de transformación (TPs). Al igual que los
antibióticos administrados, tanto los metabolitos como los TPs pueden provocar efectos
adversos como toxicidad, alergias y en el caso de mantener la actividad antibacteriana,
resistencia bacteriana. Así, en el segundo bloque de esta tesis, se ha estudiado la
metabolización de diferentes antibióticos (ENR, CIP, DIF, SAR, AMOX, PENG, PIR y
TIO), y la influencia de los tratamientos térmicos en la estructura de los antibióticos.
Para conseguir este objetivo se han analizado las diferentes muestras mediante LC-ToF
y LC-LTQ-Orbitrap.
5.1. TRATAMIENTO DE MUESTRA
La leche de vaca es una matriz biológica compleja que requiere de un tratamiento de

muestra, previo al análisis, con el fin de eliminar compuestos interferentes. El
tratamiento de muestra es una etapa clave del proceso analítico y del que puede
depender la buena calidad de los resultados. El primer tratamiento de muestra que se
179
usó para la extracción de β-lactamas y quinolonas en leche de vaca fue la extracción en

fase sólida (SPE). Se trata de una técnica clásica de extracción y ampliamente usada en
nuestro grupo de investigación para la extracción de residuos de antibióticos en distintos
tejidos (músculo, hígado, riñón y plasma) de animales destinados al consumo humano
(pollo, cerdo y ternera).
Para desarrollar un método multiresiduo, se probaron distintos métodos de extracción

descritos en la bibliografía, cuyo tratamiento de muestra constaba de una etapa de SPE.
El método que se eligió fue previamente optimizado para determinar penicilinas en
leche de vaca y consiste en la adición de un tampón de pH 10, seguido de una
extracción por SPE con un cartucho polimérico Oasis HLB. De los métodos probados,
fue el que dió los mejores resultados para la extracción simultánea de cefalosporinas y
quinolonas, aunque las condiciones no eran las óptimas para la mayoría de las
penicilinas. Las recuperaciones fueron del 75-110 % para las cefalosporina, entre 65-95
% para las quinolonas y del 45-90 % para las penicilinas. Como ya se ha comentado con
anterioridad, la SPE ofrece muchas ventajas para determinar residuos de fármacos en
muestras biológicas compuestas, como la leche. A pesar de ello, el procedimiento
experimental es largo, tedioso y caro. Además, al trabajar con leche cruda de vaca, su
elevado contenido en grasa provocó ciertas dificultades durante la carga y limpieza de la
muestra en el cartucho de SPE, ya que se obturaban los poros del cartucho y se impedía
la elución de los analitos.
Siguiendo la tendencia de estos últimos años, se desarrollaron nuevos métodos de

extracción de residuos de antibióticos más rápidos, que consumieran menos disolventes
orgánicos y que fueran más baratos, con el fin de poder procesar un elevado número de
muestras en un tiempo razonable. En este sentido, uno de los métodos descritos en la
bibliografía, que a priori ofrecía buenas perspectivas, es la microextracción líquido-
líquido dispersiva (DLLME). La DLLME está basada en la formación de un sistema
ternario compuesto por una fase acuosa que contiene los analitos, un disolvente
extractante inmiscible con agua y un disolvente dispersante miscible en agua. Así, se
optimizó y validó un método para la determinación de más de 30 antibióticos de las
familias de β-lactámicos y quinolonas. La primera etapa consistió en la elección del par
de disolventes dispersante-extractante que mejores recuperaciones ofrecía, siendo el par
formado por MeCN-Cloroformo el único capaz de extraer todas las β-lactamas y
quinolonas estudiadas. Además de la naturaleza de los disolventes usados, la extracción
180
Capítulo 5
de los antibióticos puede estar influenciada por otros factores como son pH, volumen de
disolventes extractante y dispersante, la concentración de sal (% NaCl) y el tiempo de
agitación y centrifugación. Con el fin de obtener las condiciones óptimas de la
extracción, primero se evaluó cuales de estos 6 parámetros tenían influencia mediante
un diseño experimental de Plackett-Burman, ya que éste permite evaluar muchos
factores con un número reducido de experimentos. El pH y los volúmenes de disolvente
dispersante y extractante fueron influyentes para todos los antibióticos. Los parámetros
que menos afectaban a la extracción fueron fijados a unos valores de compromiso con el
fin de que no afectasen negativamente a la extracción de ninguna de las familias de los
antibióticos estudiados.
Para que los analitos pasen de la fase acuosa a la fase orgánica extractante, es necesario
que éstos se encuentren en forma neutra. Las β-lactamas y las quinolonas ácidas (PIRO,
CIN, OXO, FLU y NAL) tienen solamente un grupo ionizable correspondiente al grupo
carboxílico y considerando los valores de sus constantes de disociación, se encuentran
en forma neutra a pH ácidos inferiores a 4. En el caso de las quinolonas anfóteras,
tienen dos grupos ionizables, uno correspondiente al ácido carboxílico y el segundo a la
presencia de un grupo amino). Para este grupo de quinolonas, la forma neutra
corresponde a la forma zwitteriónica que se encuentra a valores de pH entre 6 y 9. Dado
que las propiedades ácido-base de los antibióticos estudiados son tan distintas, no es
posible encontrar un pH de compromiso para la extracción simultánea de todos los
compuestos asegurando una buena recuperación para todos ellos. Para solucionar este
problema, se realizaron dos extracciones de una misma muestra de leche a dos pH
distintos, pH 3 para extraer las β-lactamas y las quinolonas ácidas y a pH 8 para la
extracción de las quinolonas anfóteras. Los dos extractos obtenidos se mezclaron y se
evaporaron juntos. Las recuperaciones fueron del 78 al 99 % para las penicilinas, del 81
al 98 % para las cefalosporinas y del 81 al 99 % para las quinolonas.
El último tratamiento de muestra optimizado y validado se basa en el uso de los

ultrasonidos (USE) y una etapa de clean-up usando la d-SPE con sorbente de PSA y
MgSO 4 . Se ha aplicado a la determinación de 31 antibióticos. La optimización de la
composición de la disolución de extracción se llevó a cabo mediante un diseño
experimental de mezclas de tres componentes. Tras una prueba inicial con distintos
disolventes de extracción y mezclas de ellos, se concluyó que las mejores
recuperaciones se obtenían al extraer los analitos con una mezcla orgánica formada por
181
MeCN y MeOH. El tercer componente para el diseño fue un tampón acuoso a pH 3. En

el caso de las β-lactamas, se observó que usando solamente disolventes orgánicos o solo
tampón acuoso, su extracción no era buena. Para ello, se repitió el diseño usando como
restricción la necesidad de usar al menos un 10% de tampón acuoso y no más del 90%.
La mezcla óptima para las quinolonas fue de 32% MeCN, 45% MeOH y 23% de
tampón, mientras que para las β-lactamas la composición óptima está formada por 65%
MeCN, 25% MeOH y 10% tampón. A partir de la función global de deseabilidad, se
obtuvo la composición de compromiso para que se extrajeran todos los antibióticos y
que fue de 60% MeCN, 25 % MeOH y 15 % tampón.
Un segundo diseño experimental de superficie de respuesta fue necesario para optimizar

el resto de parámetros de la extracción, como es el caso del pH del tampón acuoso, el
tiempo de ultrasonidos y el volumen total de mezcla extractante. Para la gran mayoría
de los antibióticos, las mejores recuperaciones se obtenían usando un volumen de 15
mL y aplicando ultrasonidos durante 20 min, que fueron a los valores a los que se
trabajó. A pesar de que los valores óptimos correspondían a los valores extremos
evaluados, no se probaron volúmenes ni tiempos mayores ya que al aumentar el
volumen de extractante se aumenta drásticamente el tiempo de la evaporación. Además,
un aumento de tiempo de ultrasonidos, implicaría un aumento de la temperatura de la
muestra y una posible degradación térmica de los antibióticos más lábiles. El parámetro
más influyente para la extracción simultánea de los 31 antibióticos, resultó ser el pH.
Para casi el 90 % de los compuestos el pH 3 era el óptimo para su extracción, a
excepción de OXAC, ENR, OXO y FLU. En el caso de OXAC, OXO y FLU, las
mejores recuperaciones se obtenían a pH 9, mientras que para ENR el óptimo
correspondía a pH 6. A pH 3 no podía extraerse OXO y a pH 9 no se extraía ENR. A
pesar de que pH 9 era el mejor para la extracción de OXAC y FLU, a pH 3 también se
obtenían recuperaciones adecuadas para ambos. Así pues, para poder establecer un
método multiresiduo, se seleccionó un pH de compromiso, pH 6, para que todos los
antibióticos se pudieran extraer simultáneamente. Después de la extracción, se hizo una
etapa de clean-up usando la d-SPE ya que se trata de un método rápido para eliminar
interferentes de la matriz.
Si se comparan los tres métodos de extracción estudiados, el método basado en la

técnica clásica SPE, resultó ser el más laborioso y lento, además de ser el que más
disolvente orgánico gastaba. La DLLME, en cambio, resultó ser la más rápida y con la
182
Capítulo 5
que menos residuos se generaban. De todas maneras, al trabajar con cloroformo era
necesario trabajar con tubos de vidrio y tapones de caucho, que se debían limpiar
siguiendo un protocolo largo para evitar la contaminación entre muestras. El último
método de USE y posterior clean-up con d-SPE, resultó ser también un procedimiento
relativamente rápido y sin un gasto de disolvente excesivo.
5.2. SEPARACIÓN CROMATOGRÁFICA
Los métodos optimizados y validados durante la presente tesis doctoral, son métodos
que permiten determinar simultáneamente más de una veintena de antibióticos. Pero,
antes del análisis de las muestras de leche por MS, es necesaria una separación
cromatográfica de los analitos, ya que al tratarse de una matriz compleja, los diferentes
componentes pueden interferir en la detección de los antibióticos produciendo una
disminución de la señal (supresión iónica) o un aumento (enhancement) de ésta.
Inicialmente, el método en el que se utiliza la SPE como tratamiento de muestra, fue
validado utilizando cromatografía de líquidos convencional (LC). La separación
cromatográfica de los antibióticos β-lactámicos se había optimizado anteriormente en
nuestro grupo de investigación usando columnas hidrocarbonadas, tanto de C8 como
C18. En cambio, en el caso de las quinolonas, se observó que las columnas C18
interactuaban demasiado con los analitos dando como resultado picos cromatográficos
anchos y con colas. De esta manera, se decidió hacer la separación de la mezcla de los
antibióticos de las distintas familias usando una columna de XDB-C8 (5 µm, 4.6 x 150
mm), cuya interacción con las quinolonas era menor y se obtenían picos estrechos y de
forma gausiana. Con esta columna se usaba un flujo de 1 mL/min. Este flujo es
demasiado elevado para trabajar con MS, con lo que se trabajó con un divisor de flujo o
split, que permitía la entrada al MS de solo 1/3 del eluyente que salía de la columna
cromatográfica.
Durante estos últimos años ha habido un aumento del uso de la cromatografía líquida de
ultra altas presiones (UHPLC), que permite aumentar la eficacia de las separaciones y
de esta forma obtener cromatogramas con picos más estrechos y en menos tiempo. Para
obtener los mejores resultados con UHPLC se requiere el uso de columnas mucho más
cortas y cuyo diámetro de partícula es inferior a las columnas de cromatografía de
líquidos convencional. En nuestro caso se escogió una columna Acquity UPLC BEH
183
Shield RP 18 (1.7 µm, 2.1 x 50 mm). Este cambio de LC convencional a UHPLC

permitió pasar de un tiempo de análisis de 10 min a 4 min para la separación de más de
20 antibióticos (Figura 5.1). El flujo de trabajo para el equipo UHPLC, fue de 0.3
mL/min y por consiguiente se ganó en sensibilidad ya que entraba más cantidad de
muestra en el MS al prescindir del divisor de flujo.
17
A) LC-MS/MS 11 17 2e6 B) UHPLC-MS/MS
2e5
2
Intensity, cps
Intensity, cps
15
2
5 20
20
1e6 12
1e5 4
4
8 7 11
5 9 9
14
10 14 18
7 10 3 19
12 18 19
8 16 13
3 13 21 1 6 15 16
1 6 21
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Time, min 0 1 2 3 Time, min 4
Figura 5.1. Cromatogramas de la separación de los 21 antibióticos estudiados obtenidos por A)

LC-MS/MS y B) UHPLC-MS/MS.
Se validó el método, desarrollado previamente utilizando SPE y UHPLC-MS/MS.

Durante la validación, se usaron dos patrones internos distintos, una penicilina (PIPE)
para cuantificar las β-lactamas, y (PIP) para las quinolonas. Ningún problema surgió a
la hora de establecer los parámetros de calidad del método para las quinolonas. En
cambio, en el caso de todas las β-lactamas, excepto para PENG, no se observó una
buena correlación entre la señal y la concentración. Tras el análisis detallado de los
datos, se evaluó el efecto matriz como posible causa de que los resultados no fueran los
deseados para todas las β-lactamas, excepto para una de ellas. El efecto matriz se evaluó
comparando la señal obtenida con MS para PENG y PIPE en muestras fortificadas
preparadas en agua y en leche. Se observó, que al analizar las muestras de leche por
UHPLC-MS/MS, estas dos sustancias sufrían una disminución de la señal muy similar
para ambas, alrededor del 80%, cosa que no ocurría al analizar las mismas muestras por
LC-MS/MS. Con el fin de solventar el problema, fue necesario un cambio de patrón
interno, usándose PIP como patrón interno para la cuantificación de todos los
antibióticos (β-lactamas y quinolonas), excepto para PENG que se usó PIPE, ya que
184
Capítulo 5
ambas sustancias presentan un efecto matriz del mismo orden. Otra forma de haber
corregido este efecto matriz, observado en el patrón interno y en el antibiótico, podría
haber sido un cambio en la separación de los compuestos, pero en este caso el efecto
matriz afectaba a otros compuestos.
5.3. OPTIMIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS DEL QqQ
El análisis de residuos de antibióticos en leche utilizando MS requiere la optimización

de las condiciones óptimas de los distintos parámetros del analizador de masas, con el
fin de conseguir la mejor señal de los analitos y ganar sensibilidad. Para ello, se
inyectaron por infusión directa en el espectrómetro de masas con analizador de QqQ,
patrones individuales preparados en medio hidroorgánico y 0.1% de ácido fórmico. El
medio hidroorgánico es necesario para facilitar la evaporación del disolvente y mejorar
la calidad del espray. Por otro lado, al trabajar en modo positivo, la adición de una
pequeña cantidad de ácido favorece la protonación de los analitos y en consecuencia se
aumenta la intensidad de la señal.
Si las muestras se analizan mediante LC-ESI-QqQ, deben optimizarse distintos

parámetros de la fuente de ionización y de los cuadrupolos para mejorar la detección de
los analitos por MS. En la fuente de ionización los principales parámetros a optimizar
son el potencial necesario para ionizar la muestra (ionspray, IS) y la temperatura de
desolvatación (T). Estos deben permitir la máxima ionización con la mínima
fragmentación de las moléculas antes de entrar en el primer cuadrupolo (Q1). Otros
parámetros importantes son el flujo del gas nebulizador (NEB) y de gas cortina (CUR)
que facilitan la formación del espray y aceleran la desolvatación de sus gotas cargadas
respectivamente. En Q1 deben optimizarse el potencial que asegura la formación de
iones moleculares y no de clústeres (declustering potential, DP), el potencial para
focalizar las moléculas en Q1 (focusing potencial, FP) y el potencial de entrada al
cuadrupolo (entrance potencial, EP). Estos tres parámetros son característicos para cada
compuesto y es necesaria su optimización al trabajar en modo SIM (Single ion
monitoring). En la Figura 5.2, se muestran, a modo de ejemplo, la optimización para los
potenciales IS y DP de la cefalosporina cefalexina (LEX). En el caso del potencial IS
(Figura 5.2.A), se observa que al aumentar el potencial aumenta la intensidad hasta
obtener un máximo de señal a 4500V. Valores superiores a 4500V no suponen una
185
mejora en la señal. Para el DP (Figura 5.2.B), la máxima intensidad se obtiene al aplicar

un potencial de 30 V.
30 V
5.8e6
(A) 4500 V 5000 V 6.5e6
(B)
4000 V
3500 V
Intensity, cps
Intensidad, cps
3.0e6
3.0e6
3000 V
0.0
0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 0.0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150 160 170 180 190 200
Time, min DP, V
Figura 5.2. Gráficas de optimización de distintos parámetros del QqQ: (A) IS, (B) DP, para la
cefalosporina cefalexina (LEX).
Cuando el análisis de la muestra se realiza en modo tándem, es necesario optimizar

también los parámetros de los otros dos cuadrupolos. En la celda de colisión (Q2) se
aplica un voltaje activo de disociación-colisión (CAD), seleccionando el ión molecular
proveniente de Q1 y se aplica una energía de colisión (CE) para fragmentar el ión
precursor en iones productos, que son seleccionados en Q3. Los iones productos que se
seleccionan en Q3, corresponden a los que dan lugar a las mayores relaciones
señal/ruido (S/N). La transición entre el ión molecular seleccionado en Q1 y los iones
seleccionados en Q3 con mejor S/N es escogida para la transición de cuantificación,
mientras que la transición de confirmación se escoge como la que muestra la segunda
mejor relación S/N.
En la Tabla 5.1 se muestran los parámetros óptimos para el análisis de las β-lactamas y
quinolonas reguladas por la comunidad europea en diferentes matrices y estudiadas en
la presente tesis, junto con las transiciones de cuantificación y confirmación usadas para
la determinación de los analitos en muestras analizadas por LC-MS/MS (QqQ).
186
Capítulo 5
Tabla 5.1. Parámetros óptimos para el análisis de antibióticos por LC-QqQ.
Transición Transición
m/z IS (V) DP (V) FP (V) EP (V)
Cuantificación (CE) Confirmación (CE)
PENICILINAS
AMOX 366 4500 40 150 6 366 → 114 (28) 366 → 208 (19)
AMPI 350 4500 65 150 6 350 → 106 (26) 350 → 192 (21)
CLOX 436 4500 40 140 7 436 → 160 (20) 436 → 277 (20)
DICL 470 4500 50 150 8 470 → 160 (21) 470 → 311 (22)
NAFC 415 4500 50 120 9 415 → 199 (19) 415 → 256 (21)
OXAC 402 4500 40 160 9 402 → 160 (18) 402 → 243 (18)
PENG 335 4500 40 150 7 335 → 160 (16) 335 → 176 (16)
PIPE(PI) 518 4500 40 175 5 518 → 143 (27) 518 → 160 (16)
CEFALOSPORINAS
LEX 348 4500 30 125 5 348 → 140 (35) 348 → 158 (15)
LON 459 4500 30 125 5 459 → 152 (30) 459 → 337 (20)
PER 646 4500 50 200 11 646 → 290 (35) 646 → 530 (20)
PIR 424 4500 40 150 5 424 → 292 (20) 424 → 181 (35)
QUI 529 4500 40 175 5 529 → 134 (20) 529 → 396 (20)
TIO 524 4500 50 200 5 524 → 285 (30) 524 → 241 (25)
ZOL 455 4500 40 175 5 455 → 323 (15) 455 → 295 (25)
QUINOLONAS
CIP 332 4500 45 200 10 332 → 314 (32) 332 → 288 (27)
DIF 400 4500 47 200 10 400 → 382 (30) 400 → 356 (30)
DAN 358 4500 45 200 10 358 → 340 (31) 358 → 283 (31)
ENR 360 4500 45 200 10 360 → 316 (29) 360 → 342 (29)
FLU 262 4500 38 200 10 262 → 244 (26) 262 → 202 (45)
MAR 363 4500 45 200 10 363 → 320 (22) 363 → 345 (30)
PIP (PI) 304 4500 50 200 10 304 → 286 (30) 304 → 261 (25)
SAR 386 4500 47 200 10 386 → 368 (35) 386 → 342 (29)
5.4. PARÁMETROS DE CALIDAD DE LOS MÉTODOS VALIDADOS
Los métodos desarrollados para la determinación de antibióticos β-lactámicos y

quinolonas en leche cruda de vaca durante esta tesis doctoral (SPE-LC-MS/MS, SPE-
UHPLC-MS/MS, DLLME-UHPLC-MS/MS y USE-UHPLC-MS/MS), han sido
validados según los criterios establecidos en la Directiva europea CE/657/2002 y el la
guía de la Food and Drug Administration (FDA).
Los parámetros de calidad que se han establecido durante las validaciones son los
límites de detección (LOD) y de cuantificación (LOQ), los intervalos de linealidad, la
veracidad en términos de recuperación, precisión de muestras preparadas en un mismo
día (intra-day) o en días distintos (inter-day), el límite de decisión (CC α ) y capacidad de
detección (CC β ).
Al validar un método, lo primero que hay que conocer es el intervalo de

concentraciones de trabajo. Para ello se determina los LODs y LOQs que son criterios
187
que aparecen únicamente en la guía de la FDA. Como puede observarse en la Tabla 5.2,
para los cuatro métodos validados (SPE-LC-MS/MS, SPE-UHPLC-MS/MS, DLLME-
UHPLC-MS/MS y USE-UHPLC-MS/MS), los LOQ son inferiores a los MRL
regulados indicando que todos los métodos desarrollados pueden ser usados con el fin
de determinar residuos de antibióticos en leche de vaca y cumplir con la Regulación
Europea 37/2010. Si se comparan los LOQs obtenidos con los cuatro métodos, se
observa que en general los valores más bajos se obtienen al usar la SPE para la
extracción de los analitos. Hay que remarcar, que con el método basado en USE-d-SPE,
se consiguen LOQs del mismo orden de magnitud.
Para todos los métodos, las rectas de calibrado se prepararon a concentraciones entre el
LOQ y 3 MRL mostrando buena linealidad para todos los compuestos.
Las recuperaciones se han calculado usando muestras de externos, dicho de otro modo,
fortificadas después de la etapa de extracción. Los mejores resultados de recuperación
se obtienen usando la extracción con USE seguida de d-SPE, con valores muy próximos
al 100% para todos los compuestos estudiados.
Para obtener el nivel de precisión del método, se prepararon muestras replicadas a tres
niveles de concentración durante tres días. En la Tabla 5.2, se recogen los valores
máximos para la precisión inter-day. Como puede observarse, en todos los casos al %
RSD es inferior al 15% tal como indica la guía de la FDA. También se estableció la
precisión intra-day, y como era de esperar el % RSD obtenido es menor que para
muestras preparadas en distintos días. Los métodos basados en técnicas dispersivas
(DLLME y USE-d-SPE) son los que ofrecen mayor precisión entre muestras, dando %
RSD inferiores al 7%.
La calidad de los últimos parámetros establecidos, CC α y CC β , están estrechamente

relacionados con la calidad de la precisión de los métodos usados para la extracción de
los antibióticos. De esta manera, los valores de los CC α y CC β calculados para los
métodos dispersivos, que como se ha comentado tienen los % RSD más bajos, son los
más cercanos a los MRLs.
188
Capítulo 5
Tabla 5.2. LOQ, recuperaciones y precisión Inter-day obtenidos con los métodos
desarrollados durante la tesis para los antibióticos regulados separados por familias.
AMOX AMPI CLOX DICL NAFC OXAC PENG

-1
LOQ (µg kg )
SPE-LC/MS/MS 0.3 0.3 0.15 0.5 0.1 0.15 0.1
SPE-UHPLC/MS/MS <1 0.4 0.4 9 0.1 0.3 0.4
DLLME-UHPLC/MS/MS 0.6 2 2 0.8 2 0.5
USE-d-SPE-UHPLC/MS/MS 1.1 1 1.2 1.1 1.2 0.5
Recovery (%)
SPE-LC/MS/MS 55 ± 3 79 ± 2 90 ± 2 99 ± 2 99 ± 3 83 ± 3 81 ±1
SPE-UHPLC/MS/MS 52 ± 3 85 ± 2 96 ± 3 99 ± 3 108 ± 6 96 ± 4 88 ±2
DLLME-UHPLC/MS/MS 79 ± 4 99 ± 4 93 ± 2 99 ± 1 95 ± 1 78 ± 3
USE-d-SPE-UHPLC/MS/MS 100 ± 1 100 ± 1 99 ± 1 98 ± 1 96 ± 1 97 ± 1
Precisión Interday (%RSD) b
SPE-LC/MS/MS < 14 < 13 <8 <9 <9 <8 <9
SPE-UHPLC/MS/MS < 13 < 13 < 13 < 11 < 12 < 13 < 12
DLLME-UHPLC/MS/MS <3 <1 <2 <1 <3 <3
USE-d-SPE-UHPLC/MS/MS <5 <5 <5 <5 <5 <3
LEX LON PER PIR QUI TIO ZOL

LOQ (µg kg-1 )
SPE-LC/MS/MS 1 1 1.25 0.3 0.5 0.5 0.3
SPE-UHPLC/MS/MS 1 0.2 1.25 0.5 0.06 2.5 0.5
DLLME-UHPLC/MS/MS 3 1 4 4 1 4 4
USE-d-SPE-UHPLC/MS/MS 0.4 0.9 0.3 1 0.9 0.6 1
Recovery (%)
SPE-LC/MS/MS 87 ± 2 110 ± 3 81 ± 3 107 ± 3 98 ± 3 102 ± 3 99 ± 5
SPE-UHPLC/MS/MS 95 ± 4 100 ± 3 89 ± 3 100 ± 6 112 ± 2 91 ± 3 101 ± 5
DLLME-UHPLC/MS/MS 98 ± 2 80 ± 2 82 ± 4 84 ± 12 81± 6 90 ± 1 84 ± 8
USE-d-SPE-UHPLC/MS/MS 98 ± 2 99 ± 1 99 ± 1 100 ± 3 99 ± 1 101 ± 1 100 ± 1
SPE-LC/MS/MS <8 < 13 < 14 < 12 < 13 < 10 < 14
SPE-UHPLC/MS/MS < 13 < 13 < 11 < 15 < 14 < 13 < 14
DLLME-UHPLC/MS/MS <4 <3 <5 <1 <2 <3 <5
USE-d-SPE-UHPLC/MS/MS <3 <4 <3 <6 <4 <4 <7
CIP DAN ENR FLU MAR

-1
LOQ (µg kg )
SPE-LC/MS/MS 0.1 0.1 0.1 0.15 0.5
SPE-UHPLC/MS/MS 0.1 0.1 0.5 0.05 0.75
DLLME-UHPLC/MS/MS 7 1 6 1 4
USE-d-SPE-UHPLC/MS/MS 1.3 0.5 1.1 0.6 0.8
Recovery (%)
SPE-LC/MS/MS 71 ± 2 39 ± 2 68 ± 3 101 ± 5 81 ± 4
SPE-UHPLC/MS/MS 95 ± 3 49 ± 5 79 ± 3 99 ± 6 88 ± 3
DLLME-UHPLC/MS/MS 81 ± 3 81 ± 6 84 ± 1 99 ± 1 80 ± 3
USE-d-SPE-UHPLC/MS/MS 98 ± 1 101 ± 2 100 ± 1 98 ± 2 100 ± 1
SPE-LC/MS/MS < 11 < 12 < 14 < 12 < 14
SPE-UHPLC/MS/MS <9 < 13 < 13 < 14 < 10
DLLME-UHPLC/MS/MS <1 <2 <1 <1 <2
USE-d-SPE-UHPLC/MS/MS <3 <3 <5 <3 <2
a b
Recuperación promedio de las recuperaciones a 3 niveles de concentración. Valor de precisión más
elevado de las precisiones a 3 niveles de concentración.
189
5.5. ANÁLISIS DE MUESTRAS DE LECHE
Los métodos desarrollados y validados durante la tesis doctoral fueron aplicados para el
análisis de 84 muestras de leche procedentes del Laboratorio Interprofesional Lechero
de Cataluña. Estas muestras habían pasado por un método de screening y habían
resultado positivas en antibióticos, pero se desconocía el fármaco que se había
suministrado al animal. Del total de muestras analizadas, 64 resultaron positivas en
algún antibiótico y en 21 de ellas la concentración encontrada fue superior al CC β ,
siendo no conformes para el consumo humano tal y como establece la Normativa
Europea sobre los MRL.
En la Figura 5.3 se muestran los porcentajes de muestras positivas por familias

(Cefalosporinas, Penicilinas y Quinolonas), así como los porcentajes de los antibióticos
individuales determinados en las distintas muestras.
MAR LEX
Cefalosporinas Penicilinas Quinolonas 2% 4%
AMPI
DICL 4%
4% ENR+CIP PIR PER
10% 15% 4%
12% 25%
CLOX
2% LON
2%
PENG AMOX
30% 23%
63%
Figura 5.3. Porcentajes de muestras positivas por familias y por antibióticos individuales.
Como puede observarse en la Figura 5.3, el 63% de las muestras de leche positivas
corresponden a penicilinas, el 25% a cefalosporinas y el 12% a quinolonas. En concreto,
los antibióticos más detectados en las muestras fueron PENG (30%), AMOX (23%),
PIR (15%) y ENR junto a su metabolito mayoritario CIP (10%). El resto de los
antibióticos detectados se encontraron con un porcentaje inferior al 5%. En la Figura 5.4
se muestran, como ejemplo, dos muestras de leche positivas en PENG y en ENR
obtenidos por LC-MS/MS, con su correspondiente cromatograma de confirmación. La
primera muestra contiene 12.7 µg kg-1 de PENG, por lo que se trata de una muestra no
190
Capítulo 5
conforme porque supera la concentración del MRL que es de 4 µg kg-1. En cambio, la

segunda muestra, contiene 11.3 µg kg-1 de ENR y 24.1 µg kg-1 de su principal
metabolito CIP, y por tanto no superaría el valor de MRL que está fijado en 100 µg kg-1
para la suma de ambos.
PIPE
(518 → 143)
PIPE
(518 → 359)
3,0e4
1,0e5 Identificación
2,0e4
PENG
(335 → 176)
Intensity, cps
1,0e4
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
5,0e4
PENG
(335 → 160)
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 min
PIPE
PIPE
(518 → 143)
2,0e5 ( 518 → 359)
3,0e4
Identificación
1,5e5 2,0e4
Intensity, cps
CIP ENR
1,0e4
1,0e5
( 332 → 288) ( 360 → 342)
0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
ENR
5,0e4
(360 → 316)
CIP
(332 → 314)
0 min
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Figura 5.4. Cromatogramas de dos muestras de leche positivas en antibióticos β-lactámicos

(PENG) y en quinolonas (ENR y CIP) obtenidos por LC-MS/MS.
El 78 % de las muestras que contenían antibiótico, fueron positivas en solo una

sustancia, pero el resto resultaron positivas en dos o incluso tres antibióticos. En la
mayoría de las muestras que se detectaron más de un antibiótico, estos fueron
compuestos de la misma familia. Los resultados obtenidos en cuanto a la presencia de
191
antibióticos en leche se pueden considerar representativos de los antibióticos más

ampliamente usados en veterinaria y por ello se han escogido ENR, CIP, DIF, SAR,
AMOX, PENG, PIR y TIO para realizar los trabajos sobre metabolización de la
presente tesis.
5.6. OPTIMIZACIÓN DE LOS PARÁMETROS DEL ToF Y ORBITRAP
Análogamente a lo realizado mediante LC-QqQ, antes de analizar las muestras por LC-
ToF y LC-LTQ-Orbitrap se realizó una optimización de los parámetros experimentales
por infusión directa de patrones individuales. Ambos analizadores fueron usados para la
determinación de metabolitos y productos de transformación (TPs). Al no disponer de
patrones de TPs, la optimización se llevó a cabo por infusión de los antibióticos
originales.
Si las muestras son analizadas por LC-ToF, para obtener la máxima señal del analito se
deben optimizar tres potenciales (Fragmentor, Skimmer y Octapole RFV). El primero de
ellos, y más influyente, es el Fragmentor, que se aplica para ionizar los compuestos. Si
este potencial es demasiado elevado, las moléculas se fragmentarán dando lugar a una
disminución de la intensidad del ión molecular. Si el objetivo es la caracterización de
metabolitos y productos de transformación es necesario determinar la masa exacta de
estos compuestos y por tanto se requiere una energía no demasiado elevada para que las
moléculas no se fragmenten en exceso, pues podría darse el caso de no observar el pico
molecular. Los otros dos potenciales que se optimizan son el de Skimmer y el Octapole
RFV. Ambos parámetros sirven para focalizar los iones hacia el analizador. A diferencia
del QqQ, el equipo de LC-ToF no permite la selección de los parámetros optimizados
para cada analito y se deben escoger unos valores de compromiso comunes para todas
las substancias analizadas. Los parámetros optimizados para las familias de antibióticos
se recogen en la Tabla 5.3, así como los valores de compromiso escogidos.
192
Capítulo 5
Tabla 5.3. Parámetros óptimos para el análisis de antibióticos por LC-ToF.
Cefalosporinas Penicilinas Quinolonas

Fragmentor (V) 160 160 180
Skimmer (V) 60 60 60
Octapole RFV (V) 250 250 250
Tal como se muestra en la Tabla 5.3, para todas las cefalosporinas y penicilinas se
requieren los mismos valores óptimos, mientras que las quinolonas necesitan de un
potencial de fragmentor ligeramente superior para obtener la máxima señal.
Por último, cuando se han analizado las muestras con LC-LTQ-Orbitrap, ninguna
optimización se ha llevado a cabo ya que se han analizado en modo full-scan y aislando
los iones de compuestos desconocidos. Se han usado los parámetros establecidos por
defecto en los Servicios Científico-Técnicos de la Universidad de Barcelona.
5.7. BÚSQUEDA DE TPs Y METABOLITOS
En una primera etapa las muestras de leche fortificadas con patrones individuales de
antibióticos, fueron calentadas para simular los tratamientos térmicos de la leche.
Posteriormente, las muestras fueron tratadas por SPE [77] con el fin de extraer los
antibióticos y TPs. Las muestras se analizaron por LC-ToF para obtener los espectros de
masas de alta resolución en modo de full-scan. Los espectros de MS de las muestras
fortificadas se compararon manualmente, para encontrar las diferencias entre los
espectros procedentes de muestras que habían sido fortificadas o no, así como las que
habían sido sometidas a tratamiento térmico o no (Figura 5.5A). Posteriormente, dado
que la comparación manual de espectros es una tarea muy laboriosa, se usó un software
gratuito MZmine2 para la obtención del listado de masas exactas susceptible de tratarse
de TPs y metabolitos. . Con este programa es posible comparar los datos obtenidos del
análisis mediante LC-ToF de muestras (M i ) y blancos (B i ) simultáneamente y se
obtiene un listado de relaciones m/z presentes en las muestras que contenían antibiótico
y no en los blancos (Figura 5.5B). El programa clasifica los resultados en dos colores,
verde cuando una relación m/z está presente y rojo cuando una determinada relación no
está presente. Se escogen como metabolitos o TPs aquellas relaciones m/z que se
193
encuentran presentes en muestras pero no en los blancos control. Los iones moleculares
de los TPs, fueron fragmentadas usando un LTQ-Orbitrap. Las estructuras de los TPs
fueron elucidadas a partir de los espectros obtenidos de la fragmentación de las
moléculas. En una segunda etapa, se usó el mismo procedimiento para analizar las
muestras de leche procedentes de vacas medicadas con antibióticos y que fueron
tratadas térmicamente, con el objetivo de identificar los posibles metabolitos de los
antibióticos suministrados.
A) B)
x103
m/z B1 B2 M1 M2
1
376.1660
376.1660
380.1584
402.1998
0
364 368 372 376 380 384 388 392 396 400 404 408 412 416
(m/z)
Figura 5.5. Comparación de espectros de MS de muestra de leche fortificada con ENR y sin
fortificar (Blanco). A) Manualmente. El negro corresponde al espectro del blanco y el rojo al de
la muestra que contiene ENR, B) Con el software MZmine 2.
5.7.1. QUINOLONAS
Los estudios se realizaron en tres etapas: análisis de patrones sin matriz de leche,
análisis de antibióticos adicionados en matriz y análisis de muestras de leche
procedentes de vacas medicadas con antibióticos. En una primera etapa, se estudió el
efecto de la temperatura sobre cuatro quinolonas distintas, ENR, CIP, DIF y SAR.
Fueron escogidas estas quinolonas pues se ha descrito que CIP y SAR son,
respectivamente, los principales metabolitos de ENR y DIF. Además al analizar dos
parejas distintas de antibiótico-metabolito nos podía permitir conocer si se obtenían
compuestos análogos en las dos parejas, lo que podría ser extrapolado a otras
quinolonas con estructuras parecidas. Inicialmente, se evaluó su estabilidad al calentar
patrones individuales de las citadas quinolonas, a las temperaturas de 60, 72 y 120ºC,
correspondientes a los tratamientos térmicos más usuales durante 20 min. Las muestras
194
Capítulo 5
se analizaron por LC-ToF, y se observó que a 60 y 72 ºC las quinolonas no mostraban

signo alguno de degradación, por lo que se decidió evaluar el efecto de la temperatura
calentando a 120ºC durante 20 y 60 min.
Las muestras de leche fortificadas también fueron sometidas a tratamiento térmico. Al

analizar dichas muestras, se detectaron algunos iones encontrados previamente en los
patrones calentados y otros nuevos formados por contacto del antibiótico con la matriz.
Dos grupos de muestras de leche procedentes de vacas medicadas con ENR fueron
analizadas, 4 muestras independientes y 7 muestras recogidas durante tres días de
tratamiento farmacológico y los siguientes cuatro días después de haber finalizado éste.
En la Tabla 5.4, se recogen todos los TPs y metabolitos de ENR elucidados durante la
presente tesis doctoral relacionados con ENR en orden creciente de m/z. En todos los
compuestos elucidados el error en la asignación ha sido inferior a 3 ppm
Tabla 5.4. TPs y metabolitos encontrados en muestras de leche fortificada con ENR y
CIP y procedente de animales medicados con ENR.
m/z Fórmula Otra

Estructura propuesta
teórica molecular información
O O
F
OH
A 263.0826 C 13 H 12 N 2 O 3 F+ ENR-1
H3N N
O O
O F
OH
B 291.0776 C 14 H 12 N 2 O 4 F+ H N
ENR-2
NH
H
O
HO
O
Tripéptido
C 302.1499 C 16 H 20 N 3 O 3 +
HO N Glu-Gly-Pro
H
O O H2N
195
m/z Fórmula Otra

O O
F
OH
D 306.1248 C 15 H 17 N 3 O 3 F+ ENR-3
N N
H
H3N
O O
F
OH
E 307.1089 C 15 H 16 N 2 O 4 F+ ENR-4
N N
H2
HO
O O
F
OH
F 321.0881 C 15 H 14 N 2 O 5 F+ HO
N N
H2
O
HO
H O Dipéptido
+ H3N N
G 329.1496 C 18 H 21 N 2 O 4
OH
Phe-Tyr
O
OH
O
N
Conjugación
+
H 329.1496 C 18 H 21 N 2 O 4 con AA
H3N
O
(Tyr)
HO
O O
F
OH
I 332.1405 C 17 H 19 N 3 O 3 F+ CIP
N N
H2N
196
Capítulo 5
m/z Fórmula Otra

O O
F
OH
+
J 334.1198 C 16 H 17 N 3 O 4 F N N ENR-5
H2
H N
H
O
O O
F
OH
+
K 334.1561 C 17 H 21 N 3 O 3 F ENR-6
N N
H
NH2
O O
F
OH
L 346.1198 C 17 H 17 N 3 O 4 F+ ENR-7
NH N
HN
O O
F
OH
LL 348.1354 C 17 H 19 N 3 O 4 F+ HO ENR-8
N N
H2 N
O O
F
OH
+
M 348.1354 C 17 H 19 N 3 O 4 F N N ENR-9
H2
NH
197
m/z Fórmula Otra

O O
F
OH
N
Conjugación
+ H2N
N 350.1511 C 17 H 21 N 3 O 4 F O con AA
CH3 (Lys)
NH3
O O
O
OH Conjugación
+ O
Ñ 350.1705 C 17 H 24 N 3 O 5 N N con AA
H H
(Lys)
NH3
O O
F
OH
+
O 360.1354 C 18 H 19 N 3 O 4 F NH N ENR-10
H N
O O
F
HO OH
P 362.1147 C 17 H 17 N 3 O 5 F+ ENR-11
N N
H
HN
OH O O
Q 362.1147 C 17 H 17 N 3 O 5 F+ F
ENR-12
OH
N N
H
R 362.1147 C 17 H 17 N 3 O 5 F+ HN ENR-13
198
Capítulo 5
m/z Fórmula Otra

O O
F
OH
+
S 374.1511 C 19 H 21 N 3 O 4 F NH N ENR-14
N
O O
F
OH
+
T 375.1463 C 18 H 20 N 4 O 4 F N N ENR-15
H
H2N N
O O
F
OH
U 376.1667 C 19 H 23 N 3 O 3 F+ HO ENR-16
N N
N
H
O O
F
OH
V 376.1667 C 19 H 23 N 3 O 3 F+ O
ENR-17
NH N
N
OH O O
W 390.1460 C 19 H 21 N 3 O 5 F+ F ENR-18
OH
N N
+ H
X 390.1460 C 19 H 21 N 3 OF 5 N ENR-19
NH2
O
HN
Tripéptido
Y 405.2135 C 20 H 29 N 4 O 5 + O
O
Gln-Lys-Phe
N
H
HO
O
199
m/z Fórmula Otra

O O
F
OH
OH
C 29 H 39 N 3 O 13 F OH N N Conjugación
Z 656.2461 + HO HO N
O H con lactosa
O
HO O
OH HO
De los 28 compuestos recogidos en la tabla resumen 5.4, 19 de ellos no habían sido

descritos previamente en la bibliografía (A, B, C, D, E, G, H, J, LL, M, N, Ñ, P, Q, R,
S, T, U, W, X, Y y Z). Como puede observarse, muchos de estos compuestos son
resultado de procesos de oxidación en las dos posiciones α al nitrógeno del anillo
piperazina. Además de CIP, metabolito principal de ENR, se han observado otros
compuestos relacionados con la estructura del antibiótico padre y en las muestras
procedentes de animal medicado, se han detectado y elucidado tres metabolitos
resultantes de la conjugación de un fragmento de ENR con aminoácidos (AA) presentes
en la leche de vaca, como se muestra en la Tabla 5.4 (H, N y Ñ).
Al calentar las muestras de leche procedentes de animales medicados con ENR, se

observa una disminución de la concentración de todos los TPs y metabolitos presentes
en la leche.
En el último artículo presentado en esta memoria, se sugiere una posible ruta de

metabolización para ENR en la que se relacionan todos los metabolitos encontrados e
identificados durante este trabajo. La ruta de metabolización de ENR se muestra en la
siguiente Figura 5.6.
200
Capítulo 5
O O O O
O O F F
F OH OH
OH O N N
V S
NH NH
NH N N N
N
m/z 376.1667 O m/z 374.1511
O O
OH O O O O F O O O O
F F OH F F
OH OH OH OH
N N
N
W, X
N N N NH
K O
N N N
N
H
NH2
H N
H H2N I H N
O
m/z 390.1460 m/z 334.1561 ENR m/z 332.1405 m/z 360.1354
m/z 360.1718
O O O O O O
F F F
OH OH OH
M
N N N NH N
L
N
NH
H2
H3N
H
D HN
O m/z 348.1354 m/z 306.1248 m/z 346.1198

O O
F
OH
O O O O
N N
F F H2
OH OH H N
H
J
A
H3N N N N O
E
H2
HO m/z 334.1198
O O m/z 263.0826 m/z 307.1089 O O
O F F
OH OH
B
H N NH N N
H
HO
H2
F
m/z 291.0783
m/z 321.0881
OH
O
H
N
H3N O
O O
F m/z 329.1496
OH O O O O
N F HO
D
N OH OH
H
H3N N N O O
N NH2
H H H
m/z 306.1248 H3N H3N OH
O
N N
O
Ñ
H H
m/z 350.1705 NH3
O O
F
OH
O O N
F
OH O O H2N
O
F
A
H3N N OH CH3
H3N N
m/z 263.0826
H
NH3 N
m/z 350.1511
Figura 5.6. Ruta de metabolización propuesta para ENR.
En las muestras de leche procedentes del tratamiento farmacológico, además de los

metabolitos previamente comentados, se han identificado péptidos que pueden ser de
gran interés dado que se ha observado que disminuyen su concentración a medida que
201
avanza el tratamiento, dicho de otro modo, disminuyen su concentración al curarse la

enfermedad del animal como por ejemplo la mastitis. Estos péptidos podrían ser usados
como posibles biomarcadores de la enfermedad de los animales tal como sugiere R.
Mansor para el péptido Phe-Tyr (G) con m/z 329.1496 [78]. En la Figura 5.7, se muestra
el espectro de masas de uno de los péptidos elucidados, m/z 405.2135, que puede ser un
posible biomarcador de mastitis.
(Gln – NH3) + Lys

25
129.1025 240.1347
Gln – NH3
Lys
Lys
Relative Abundance
84.0808
222.1238
10 Phe
258.1451
120.0809
Phe
Phe + Lys
166.0864
CO H2O
H2O
139.0868 195.1128 294.1814 304.1655 CO 405.2135
NH3 NH3
CO2
359.2084 387.2031
277.1549
0
80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280 300 320 340 360 380 400
m/z
Figura 5.7. Espectro MS/MS obtenido por LC-LTQ-Orbitrap para el tripéptido con m/z
405.2135.
Al estudiar el efecto de la temperatura sobre las muestras de leche procedentes de

animales medicados con ENR, se observó una disminución de la concentración de todos
los TPs y metabolitos presentes en la leche.
En el caso de las muestras fortificadas con DIF y su principal metabolito SAR, se han
elucidado diversos compuestos análogos a los encontrados con ENR, como por ejemplo,
los correspondientes desetilenos e hidroxilados de DIF y SAR, además del N-óxido de
DIF y SAR acetilada y formamidada, entre otros.
202
Capítulo 5
5.7.2. β-LACTAMAS
El estudio de los TPs y metabolitos de β-lactamas, se realizó siguiendo las tres etapas
comentadas para las quinolonas, es decir, en patrones en agua, en muestras fortificadas
de leche y en muestras de leche procedentes de vaca medicada. El estudio con patrones
se realizó calentando disoluciones de las penicilinas AMOX y PENG, y las
cefalosporinas PIR y TIO a 60, 72 y 120ºC durante 30 min. A diferencia de las
quinolonas, que son más estables térmicamente, a estas temperaturas ya se observaban
distintos niveles de degradación en función del antibiótico. Se analizaron muestras de
leche fortificadas con las cuatro β-lactamas y calentadas a las condiciones anteriormente
indicadas. En la Tabla 1 del artículo de Journal of Chromatography A y en el material
suplementario de dicho artículo, se recogen las estructuras de los TPs detectados e
identificados para los cuatro antibióticos en muestras de leche fortificadas. Los errores
en la asignación de las estructuras fueron inferiores a 3.4 ppm. De los 23 TPs
encontrados en las muestras de leche fortificadas con AMOX, PIR, TIO y PENG, 8 de
ellos no habían sido descritos previamente en la bibliografía (PIR-1, PIR-2, PIR-9, TIO-
1, TIO-3, TIO-4, PENG-3 y PENG-5). La mayoría de los TPs provienen de las
reacciones de oxidación y descarboxilación. Otros se forman durante el tratamiento de
muestra, como PIR-7, PIR-8 y TIO-4 que son resultado de la reacción de esterificación
con el MeOH usado para la elución de los analitos del cartucho de SPE.
En una última etapa, se analizaron muestras recogidas el segundo día de tratamiento

farmacológico (DT) que duró 3 días, de vacas medicadas con PENG y del segundo día
tras la finalización de éste (PT). Los compuestos identificados en estas muestras se
clasificaron como TPs (PENG-1-5) provenientes de degradación química o térmica y
como metabolitos (PENG-6-10) resultantes de las reacciones metabólicas sufridas por el
antibiótico en el animal. En la Tabla 5.5 se recogen las estructuras de todos los TPs y
metabolitos encontrados en las muestras de leche de vaca medicada con PENG.
203
Tabla 5.5. TPs y metabolitos encontrados en muestras de leche procedente de animales

medicados con PENG.
m/z Fórmula Otra

O
OH
O
H2N
309.1267 C 15 H 21 N 2 O 3 S+ N PENG-1
H S
O O
H2
335.1063 C 16 H 19 N 2 O 4 S+ N N O PENG-2
S
OH
O
O
H OH
O
N
351.1009 C 16 H 19 N 2 O 5 S+ N PENG-3
H S
O O
OH
HN
353.1166 C 16 H 21 N 2 O 5 S+ NH2 PENG-4
S O
OH
O O
N
HN
420.1952 C 21 H 30 N 3 O 4 S+ NH2 PENG-5
S O
OH
204
Capítulo 5
m/z Fórmula Otra

O
H2N
N
263.1213 C 14 H 19 N 2 OS+ H S PENG-6
OH
HS
O
297.1267 C 14 H 21 N 2 O 3 S+ NH O PENG-7
NH3
HO OH
O S
313.1217 C 14 H 21 N 2 O 4 S+ NH O PENG-8
NH3
O O
O
HN
367.1322 C 17 H 23 N 2 O 5 S+ NH2 PENG-9
S O
OH
OH O
NH
393.1802 C 15 H 29 N 4 O 6 S+ H2N O PENG-10

S OH
HN
N
H2 O
OH
Se identificaron 5 metabolitos nuevos (PENG-6-10) y dos de ellos se formaron a través

de una conjugación enzimática con aminoácidos (PENG-7 y PENG-10). Con los
resultados obtenidos se ha planteado una ruta de metabolización que se presenta en la
Figura 5.8.
205
O OH Phenylalanine OH
O HS
H3N conjugation O
O H2
N OH NH O
O
HS
NH S PENG-7
Penicillamine NH3
m/z 297.1267
Oxidation
PENG-9
Hydrolysis
m/z 367.1322
O
O HO OH
O S
O
H
N N
NH O
OH
O
OH HS
O H2 NH3
N OH
O
O PENG-8
O m/z 313.1217
NH S H2
N N O
PENG-4 S
m/z 353.1166 OH
Arg and Ser
PENG-2
conjugation O
m/z 335.1063
OH
Δ
O O HN
O
HN O
OH
H3N
O NH S
N NH
H S
NH
PENG-6 N HO
H S
m/z 263.1213 PENG-10
O m/z 393.1802
PENG
m/z 335.1060
OH
Figura 5.8. Ruta de metabolización sugerida para PENG.
También fue estudiado el efecto de la temperatura sobre los TPs y los metabolitos. Se
ha observado que los compuestos con elevado peso molecular se detectan a mayor
concentración en las muestras que no han sido sometidas a tratamiento térmico o
calentadas a bajas temperaturas (60ºC). En cambio, a 120 ºC se detectan compuestos de
m/z menores, con lo que se concluye, que al calentar los TPs y metabolitos de elevado
peso molecular se degradan para dar lugar a TPs más pequeños.
5.8. ANÁLISIS POR COMPONENTES PRINCIPALES (PCA)
Las muestras procedentes de animales medicados con ENR, se han analizado mediante
herramientas quimiométricas, concretamente usando el análisis por componentes
principales (PCA). Las muestras analizadas consisten en muestras de leche de vaca no
medicada y muestras de leche de vaca medicada recogidas durante 7 días distintos, 3
206
Capítulo 5
días de tratamiento farmacológico (DT) y 4 días post-tratamiento (PT). Se recogen datos

de las muestras antes y después de someterlas a un tratamiento térmico de 120ºC
durante 20 y 60 min. Como puede observarse en el gráfico de Scores de la Figura 5.9,
en función de PC1, las muestras se clasifican en tres grupos distintos (muestras
recogidas durante el tratamiento farmacológico, muestras recogidas tras el tratamiento
farmacológico y muestras de animales no tratados con el antibiótico). Las muestras DT
son las que se encuentran más a la derecha del gráfico, mientras que las PT están
situadas más a la izquierda entre los blancos y las DT. En PC2, en cambio, las muestras
se clasifican en función del tratamiento térmico aplicado, es decir, las muestras sin
calentar son las que se encuentran en la parte superior del gráfico y a medida que
aumenta la intensidad del tratamiento térmico se van desplazando a valores más bajos
de PC2.
70 1
-
60 Muestras post-
Muestras tratamiento
50 blancas (PT)
3
40 26
25 Antibiótico y +
30 - 64 metabolitos
5
20 28
Muestras
7 24
10 9
30
48 29 23
27 14
21 19
10 durante
43 11
18 20 12 13 tratamiento
4951
50 46 22 40 15
0 47
45 44 (DT)
17
16
41
4233
-10 8 65 67
66 64 3937
34
3132
38
36
68 70 69
+ 62 35
-20 72 71 6361
5259
58 5360 55
5456 57
-30
-40 -30 -20 -10 0 10 20 30 40 50
Figura 5.9. Gráfico de Scores del análisis exploratorio por PCA.
207
CAPÍTULO 6
Conclusiones
Capítulo 6
6. CONCLUSIONES
Las conclusiones de la presente tesis se han dividido en dos bloques, el primero

dedicado al desarrollo y validación de métodos de análisis y el segundo a la búsqueda
de metabolitos y productos de transformación (TPs).
1. Para la determinación de residuos de antibióticos en leche cruda de vaca es

necesaria una etapa de tratamiento de muestra. La SPE nos permite la limpieza
de la matriz además de preconcentrar los antibióticos. Se ha demostrado que el
uso de la SPE para el análisis de antibióticos en leche proporciona resultados
adecuados para la determinación de 21 antibióticos de las familias de β-lactamas
y quinolonas.
2. Se ha desarrollado y optimizado (mediante diseños experimentales de Plackett-

Burman y Doehlert) un método que usa la DLLME para la extracción de 31
antibióticos en muestras de leche. Se ha comprobado que los factores más
influyentes han sido el pH, volumen de disolvente dispersante y extractante. Se
ha comprobado, que es necesario un pH de 3.0 para la extracción de quinolonas
ácidas y β-lactamas y un pH de 8.0 para las quinolonas con carácter anfotérico,
por lo que se requiere realizar dos extracciones para analizar los 31 antibióticos
objeto de estudio. Este método puede ser una alternativa válida a la SPE ya que
se trata de un método mucho más rápido y con menos gasto de disolventes y por
tanto mucho más respetuoso con el medio ambiente.
3. Se ha desarrollado y optimizado (mediante diseños experimentales de mezcla y

Doehlert) un método que utiliza la extracción asistida con ultrasonidos (USE) y
un posterior clean-up por d-SPE. En la extracción con ultrasonidos los
parámetros más influyentes son el pH, tiempo de ultrasonidos y composición-
volumen del disolvente de extracción. Para poder extraer los 31 antibióticos
estudiados, ha sido necesario escoger un valor de pH de 6.0, ya que a pH más
ácidos y a pH más básicos no es posible la extracción simultánea de todos los
211
Conclusiones
antibióticos. Al tratarse de un procedimiento muy sencillo, lo hace adecuado

para el análisis de un elevado número de muestras.
4. La separación cromatográfica de los antibióticos regulados por la comunidad

europea, en leche de vaca, se ha optimizado utilizando LC-MS/MS y UHPLC-
MS/MS. Con una fase móvil MeCN-H 2 O y ácido fórmico 0.1% en ambos
disolventes se consigue una adecuada separación de dichos antibióticos en 10
min con LC-MS/MS y en 4 min con UHPLC-MS/MS.
5. Se ha observado un efecto matriz importante con el patrón interno, piperacilina,

en muestras de leche cruda analizadas por UHPLC-MS/MS. Para solventar este
problema ha sido necesario un cambio de patrón interno, ácido pipemídico, para
la cuantificación de las β-lactamas.
6. Se han establecido cuatro métodos para el análisis de multiresiduos (SPE-LC-

MS/MS, SPE-UHPLC-MS/MS, DLLME-UHPLC-MS/MS y USE-d-SPE-
UHPLC-MS/MS) que permiten la determinación de antibióticos en leche de
vaca. Los parámetros de calidad de los métodos cumplen los criterios de la
decisión 657/2002/CE sobre funcionamiento de métodos analíticos y la
interpretación de resultados.
7. Se han establecido los límites de cuantificación (LOQ) siguiendo la normativa

de la FDA. Los valores de LOQ más bajos se obtienen al usar SPE en la etapa de
tratamiento de muestra, aunque los valores obtenidos con USE-d-SPE son del
mismo orden de magnitud.
8. Las mejores recuperaciones se han obtenido con el método USE-d-SPE-

UHPLC-MS/MS con valores próximos al 100% para todos los compuestos. Las
recuperaciones obtenidas con DLLME-UHPLC-MS/MS oscilan entre 80-100%,
mientras que con SPE-LC-MS/MS y SPE-UHPLC-MS/MS se encuentran entre
el 70-100% excepto para AMOX y DAN.
9. La precisión inter-day, establecida en tres días diferentes, de los distintos

métodos es inferior al 15%. Las mejores precisiones se obtienen utilizando
212
Capítulo 6
DLLME-UHPLC-MS/MS y USE-d-SPE-UHPLC-MS/MS con valores de RSD

inferiores al 7%.
10. Se han analizado 84 muestras de leche suministradas por el Laboratorio

Interprofesional Lechero de Cataluña (ALLIC). Estas muestras habían dado
positivo en un screening previo de antibióticos. De las 84 muestras analizadas,
64 dieron positivo en quinolonas y β-lactamas. El 63% de las muestras de leche
positivas correspondían a penicilinas, el 25% a cefalosporinas y el 12% a
quinolonas. En concreto, los antibióticos más detectados en las muestras fueron
PENG (30%), AMOX (23%), PIR (15%) y ENR junto a su metabolito
mayoritario CIP (10%). El resto de los antibióticos detectados se encontraron
con un porcentaje inferior al 5%.
11. Se han simulado los tratamientos térmicos de pasteurización (60ºC – 30 min;

72ºC – 4 s) y esterilización de la leche (120ºC -20 min) y se ha estudiado el
efecto de la temperatura sobre cuatro quinolonas distintas, ENR, CIP, DIF y
SAR en patrones y muestras de leche fortificadas individualmente con cada
quinolona. Dada la elevada estabilidad de las quinolonas, solo se observó la
degradación de éstas en las condiciones de temperatura propias de la
esterilización. Para aumentar las concentraciones de los productos de
transformación fue necesario aumentar el tiempo de calentamiento hasta 60 min.
12. Se ha estudiado el efecto de la temperatura (60, 72 y 120ºC durante 30 min)

sobre las β-lactamas AMOX, PENG, PIR y TIO en patrones y muestras de leche
fortificadas con cada una de estas β-lactamas. Debido a la labilidad del anillo β-
lactámico, las penicilinas y cefalosporinas mostraron degradación a todas las
temperaturas ensayadas.
13. Se ha estudiado el efecto de la temperatura sobre muestras de leche procedentes

de animales medicados con ENR y con PENG y recogidas durante y después del
213
Conclusiones
tratamiento farmacológico. Las muestras de leche con antibióticos se han

comparado con muestras sin antibiótico y con muestras sin tratamiento térmico.
Se han detectado compuestos que no aparecían en las muestras fortificadas con
ENR y PENG. Estos compuestos proceden de la metabolización del fármaco
administrado al animal.
14. Se han detectado y elucidado 28 compuestos relacionados con la presencia de

ENR y su principal metabolito, CIP. Los productos de transformación (TPs)
debidos al tratamiento térmico y al contacto del antibiótico con la matriz, son
mayoritariamente resultado de procesos de oxidación en las dos posiciones α del
átomo de nitrógeno del anillo piperazina. 19 de los compuestos elucidados han
sido descritos por primera vez.
15. Se han detectado y elucidado 10 compuestos relacionados con la presencia de

PENG. 9 de estos compuestos provienen de la ruptura del anillo β-lactámico y
en consecuencia han perdido su actividad antimicrobiana. 7 de los compuestos
relacionados con la presencia de PENG no habían sido identificados
previamente.
16. Los TPs de DIF y SARA son análogos a los encontrados en el estudio con ENR
y CIP, obteniéndose entre otros los compuestos desetilados e hidroxilados.
17. Se han detectado y elucidado 18 TPs de AMOX, PIR y TIO en muestras de

leche fortificadas. Seis de estos compuestos no habían sido descritos con
anterioridad en la bibliografía. La mayoría de los TPs de AMOX, PIR y TIO
provienen de reacciones de oxidación y descarboxilación. Se ha comprobado
que algunos TPs se han generado por el tratamiento de muestra efectuado, ya
que son el resultado de una reacción de esterificación con el metanol usado en la
elución de la etapa de SPE.
18. Al calentar las muestras de leche procedentes de animales medicados con ENR,
se observa una disminución de la concentración de todos los TPs y metabolitos
presentes en la leche. En cambio, en el caso tanto de las muestras de leche
214
Capítulo 6
adicionadas como de muestras de leche procedentes de animales medicados con

β-lactamas se ha observado que a medida que se calienta, aumenta la
concentración de TPs de bajo peso molecular, que provienen de la degradación
térmica de otros TPs de masas superiores.
19. Tanto en las muestras de leche procedentes de vacas medicadas con ENR como
con PENG, se han detectado y elucidado metabolitos formados por conjugación
con distintos aminoácidos presentes en la leche. En el caso de ENR se produce
la conjugación de fragmentos de ENR con tirosina (Tyr) y Lys (Lisina). En el
caso de PENG la conjugación tiene lugar con Fenilalanina (Phe) y Arginina
(Arg) y Serina (Ser). Estos compuestos han sido identificados y descritos por
primera vez.
20. En las muestras de leche procedentes de vacas medicadas con ENR y recogidas
durante y después del tratamiento farmacológico, se han detectado e identificado
péptidos (Glu-Gly-Pro, Phe-Tyr y Gln-Lys-Phe) que se encuentran a alta
concentración al inicio del tratamiento y que disminuyen a medida que se cura la
enfermedad. Dichos péptidos pueden ser usados como biomarcadores de la
enfermedad de los animales.
21. Las muestras procedentes de animales medicados con ENR, se han analizado
utilizando herramientas quimiométricas, PCA. Se han podido clasificar las
muestras en tres grupos (muestras recogidas durante el tratamiento
farmacológico, muestras recogidas tras el tratamiento farmacológico y muestras
de animales no tratados con el antibiótico). También se ha podido distinguir
entre muestras no calentadas, las calentadas a 120ºC - 20 min y las calentadas a
120ºC - 60 min.
215
CAPÍTULO 7
Bibliografía
Capítulo 7
7. BIBLIOGRAFÍA
[1] Chemical analysis of antibiotic residues in food. Ed. J. Wang, J. D. MacNeil, J. F.

Kay. Wiley (2012)
[2] www.mediavida.com
[3] V. Samanidou, S. Nisyriou. Multi-residue methods for confirmatory determination

of antibiotics in milk. J. Sep. Sci 31 (2008) 2068-2090.
[4] L. Cordiés Jackson, L. A. Machado Reyes, M. L. Hamilton Cordiés. Principios

generales de la terapéutica antimicrobiana. Acta Médica 8 (1998) 13-27.
[5] C. Suárez, F. Gudiol. Antibiótocos betalactámicos. Enferm. Infec. Microbiol. Clin.

27 (2009) 116-129.
[6] M. P. Rang, M. M. Dale, J. M. Ritter, P. K. Moore. Farmacología. 5ª Edición,

Elsevier 2003.
[7] G. L. Patrick. An Introduction to Medical Chemistry. 3rd Edition. Oxford, 2005.
[8] A. Delgado, C. Minguillón, J. Joglar. Introducción a la química terapéutica. 2ª

edición, Ed. Díaz de Santos, 2004.
[9] M. Morejón García, R. Salup Díaz. Actualización en quinolonas. Electron. J.

Biomed. 1 (2003) 170-178.
[10] S. Mella, G. Acuña, M. Muñoz, C. Pérez, J. Labarca, G. González, H. Bello, M.

Domínguez, R. Zemelman. Quinolonas: Aspectos generales sobre su estructura y
clasificación. Rev. Chil. Infect. 17 (2000) 53-66.
[11] M. I. Andersson, A. P. MacGowan. Development of the quinolones. J. Antimicrob.

Chemother. 51 (2003) S1 1-11.
[12] Council Regulation No 1831/2003 of the European Parliament and of the Council
of 22 September 2003 on additives for use in animal nutrition.
[13] Sales of veterinary antimicrobials agents in 26 EU/EEA countries in 2012. Fourth

ESVAC (European Surveillance of Veterinary Antimicrobial consumption) report.
219
Bibliografía
[14] Commission of the European Communities, Diario Oficial de las Comunidades

Europeas (DOCE) 2377/90 L224, 991, 2608, 18 August 1990.
[15] Commission of the European Communities, Diario Oficial de las Comunidades

Europeas (DOCE) No. 37/2010 L15/1, December 22, 2009.
[16] Commission of the European Communities, Decision 2002/657/EC of 12 August

2002 implementing Council Directive 96/23/EC concerning the performance
ofanalytical methods and the interpretation of results, Off. J. Eur. Comm. (2002),
L221/8-L221/21.
[17] U.S. Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration,
Center for Drug Evaluation and Research (CDER), Center for Veterinary Medicine
(CVM), Bioanalytical Method Validation, Guidance for Industry, 2001,pp. 1–22.
[18] http://www.fao.org/agricultura/dairy-gateway/portal-lacteo/es
[19] Handbook of milk composition. Ed. R. G. Jensen. American Press (1995).
[20] www.tetrapak.com
[21] Laxman Kole, G. Venkatesh, J. Kotecha R. Sheshala. Recent advances in sample

preparation techniques for effective bioanalytical methods. Biomed. Chromatogr. 25
(2011) 199-214.
[22] M. Becker, E. Zittlau, M. Petz. Residue analysis of 15 penicillins and

cephalosporins in bovine muscle, kidney and milk by liquid chromatography-
tandem mass spectrometry. Anal. Chim. Acta 520 (2004) 19-32.
[23] E. A. Christodoulou, V. F. Samanidou. Multiresidue HPLC analysis of ten

quinolones in milk after solid phase extraction: Validation according to the
European Union Decision 2002/657/EC. J. Sep. Sci. 30 (2007) 2421-2429.
[24] A. A. M. Stolker, P. Rutgers, E. Oosterink, J. J. P. Lasaroms, R. J. B. Peters, J. A.

van Rhijn, M. W. F. Nielen. Comprehensive screening and quantification of
veterinary drugs in milk using UPLC-ToF-MS. Anal. Bioanal. Chem. 391 (2008)
2309-2322.
220
Capítulo 7
[25] A. Zafra Gómez, A. Garballo, O. Ballesteros, A. Navalón, L. E. García Ayuso.

Simultaneous determination of quinolone antibacterials in bovine milk by liquid
chromatography-mass spectrometry. Biomed. Chromatogr. 22 (2008) 1186-1193.
[26] S. B. Turnipseed, W. C. Andersen, C. M. Karbiwnyk, M. R. Madson, K. E. Miller.

Multi-class, multi-residue liquid chromatography/tandem mass spectrometry
screening and confirmation methods for drug residues in milk. Rapid Commun.
Mass Spectrom. 22 (2008) 1467-1480.
[27] M. Gaugain Juhel, B. Delépine, S. Gautier, M. P. Fourmond, V. Gaudin, D.

Hurtaud Pessel, E. Verdon, P. Sanders. Validation of a liquid chromatography-
tandem mass spectrometry screening method to monitor 58 antibiotics in milk: a
qualitative approach. Food Addit. Contam. 26 (2009) 1459-1471.
[28] Q. Tang, T. Yang, X. Tan, J. Luo. Simultaneous determination of fluoroquinolone

antibiotic residues in milk simple by solid phase extraction-liquid chromatography-
tandem mass spectrometry. J. Agric. Food. Chem. 57 (2009) 4535-4539.
[29] S. H. Hsieh, H. Y. Huang, S. Lee. Determination of eight penicillin antibiotics in

pharmaceuticals, milk and porcine tissues by nano-liquid chromatography. J.
Chromatogr. A 1216 (2009) 7186-7194.
[30] D. A. Bohm, C. S. Stachel, P. Gowik. Multi-method for the determination of

antibiotics of different substance groups in milk and validation in accordance with
Commission Decision 2002/657/EC. J. Chromatogr. A 1216 (2009) 8217-8223.
[31] D. Ortelli, E. Cognard, P. Jan, P. Edder. Comprehensive fast multiresidue

screening of 150 veterinary drugs in milk by ultra-performace liquid
chromatography coupled to time of flight mass spectrometry. J. Chromatogr. B 877
(2009) 2363-2374.
[32] M. Martínez Huélamo, E. Jiménez Gámez, M. P. Hermo, D. Barrón, J. Barbosa.

Determination of penicillins in milk using LC-UV, LC-MS and LC-MS/MS. J. Sep.
Sci. 32 (2009) 2385-2393.
[33] H. Zhang, Y. Ren, X. Bao. Simultaneous determination of (fluoro)quinolones

antibacterials residues in bovine milk using ultra performance liquid
221
Bibliografía
chromatography tandem mass spectrometry. J. Pharm. Biomed. Anal. 49 (2009)

367-374.
[34] S. B. Turnipseed, J. M. Storey, S. B. Clark, K. E. Miller. Analysis of veterinary

drugs and metabolites in milk using quadrupole time of flight liquid
chromatography mass spectrometry. J. Agric. Food Chem. 59 (2011) 7569-7581.
[35] S. Gao, H. Jin, J. You, Y. Ding, N. Zhang, Y. Wang, R. Ren, R. Zhang, H. Zhang.
Ionic liquid-based homogeneous liquid-liquid microextraction for the determination
of antibiotics in milk by high performance liquid chromatography. J. Chromatogr. A
1218 (2011) 7254-7263.
[36] L. Kantiani, M. Farré, D. Barceló. Rapid residue analysis of fluoroquinolones in

raw bovine milk by online solid phase extraction followed by liquid
chromatography coupled to tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 1218
(2011) 9019-9027.
[37] E.G. Karageorgou, V. F. Samanidou. Development and validation according to

European Union Decision 2002/657/EC of an HPLC-DAD method for the milk
multi-residue analysis of penicillins and amphenicols based on dispersive extraction
by QuEChERS in MSPD format. J. Sep. Sci. 34 (2011) 1893-1901.
[38] L. Adlnasab, H. Ebrahimzadeh, Y. Yamini. A three phase dispersive liquid-liquid

microextraction technique for the extraction of antibiotics in milk. Microchim. Acta
179 (2012) 179-184.
[39] C. Quesada Molina, B. Claude, A. M. García Campaña, M. del Olmo Iruela, P.

Morin. Convenient solid phase extraction of cephalosporins in milk using a
molecularly imprinted polymer. Food Chem. 135 (2012) 775-779.
[40] L. Jank, R. B. Hoff, P. C. Tarouco, F. Barreto, T. M. Pizzolato. β-lactam antibiotics

residues analysis in bovine milk by LC-ESI-MS/MS: a simple and fast liquid-liquid
extraction method. Food Addit. Contam. 29 (2012) 497-507.
[41] Y. Y. Tang, H. F. Lu, H. Y. Lin, Y. C. Shih, D. F. Hwang. Multiclass analysis of

23 veterinary drugs in milk by ultraperformance liquid chromatography electrospray
tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. B 881-882 (2012) 12-19.
222
Capítulo 7
[42] J. Zhan, X.J. Yu, Y.Y. Zhong, Z. T. Zhang, X. M. Cui, J. F. Peng, R. Feng, X. T.
Liu, Y. Zhu. Generic and rapid determination of veterinary drug residues and other
contaminants in raw milk by ultra performance liquid chromatography-tandem mass
spectrometry. J. Chromatogr. B 906 (2012) 48-57.
[43] M. Y. Piñero, R. Garrido Delgado, R. Bauza, L. Arce, M. Valcárcel. Easy simple

treatment for the determination of enrofloxacin and ciprofloxacin residues in raw
bovine milk by capillary electrophoresis. Electrophoresis 33 (2012) 2978-2986.
[44] J. A. Ruiz Viceo, N. Rosales Conrado, V. Guillén Casla, L. V. Pérez Arribas, M. E.

León González, L. M. Polo Díez. Fluoroquinolone antibiotic determination in
bovine milk using capilary liquid chromatography with diode array and mass
spectrometry detection. J. Food Compos. Anal. 28 (2012) 99-106.
[45] I. Maia Toaldo, G. Zandonadi Gamba, L. Almeida Picinin, G. Rubensam, R. Hoff,

M. Bordignon Luiz. Multiclass analysis of bacterial residues in milk using RP-liquid
chromatography with photodiode array and fluorescence detection and tandem mass
spectrometry confirmation. Talanta 99 (2012) 616-624.
[46] A. Freitas, J. Barbosa, F. Ramos. Development and validation of a multiresidue and

multiclass ultra-high-pressure liquid chromatography- tandem mass spectrometry
screening of antibiotics in milk. Int. Dairy J. 33 (2013) 6-11.
[47] M. T. Martins, J. Melo, F. Barreto, R. B. Hoff, L. Jank, M. S. Bittencourt, J. B.

Arsand, E. E. S. Schapoval. A simple, fast and cheap non-SPE screening method for
antibacterial residue analysis in milk and liver using liquid chromatography-tandem
mass spectrometry. Talanta 129 (2014) 374-383.
[48] N. Van Hoof, K. De Wasch, L. Okerman, W. Reybroeck, S. Poelmans, H. Noppe,

H. De Brabander. Validation of a liquid chromatography-tandem mass spectrometric
method for the quantification of eight quinolones in bovine muscle, milk and
aquacultured products. Anal. Chim. Acta 529 (2005) 265-272.
[49] F. J. Lara, A. M. García Campaña, F. Alés Barrero, J. M. Bosque Sendra, L. E.

García Ayuso. Multiresidue method for the determination of quinolone antibiotics in
bovine raw milk by capillary electrophoresis-tandem mass spectrometry. Anal.
Chem. 78 (2006) 7665-7673.
223
Bibliografía
[50] M. P. Hermo, E. Nemutlu, S. Kir, D. Barrón, J. Barbosa. Improved determination

of quinolones in milk at their MRL levels using LC-UV, LC-FD, LC-MS and LC-
MS/MS and validation in line with regulation 2002/657/EC. Anal. Chim. Acta 613
(2008) 98-107.
[51] L. Kantiani, M. Farré, M. Sibum, C. Postigo, M. López de Alda, D. Barceló. Fully

automated analysis of β-lactams in bovine milk by online solid phase extraction-
liquid chromatography-electrospray-tandem mass spectrometry. Anal. Chem. 81
(2009) 4285-4295.
[52] X. L. Hou, Y. L. Wu, Yan. Lv, X. Q. Xu, J. Zhao, T. Yang. Development and
validation of an ultra high performance liquid chromatography tandem mass
spectrometry method for determination of 10 cephaloporins and desacetylcefapirin
in milk. J. Chromatogr. B 931 (2013) 6-11.
[53] X. Zhang, L. Chen, Y. Xu, H. Wang, Q. Zeng, Q. Zhao, N. Ren, L. Ding.

Determination of β-lactam antibiotics in milk based on magnetic molecularly
imprinted polymer extraction coupled with liquid chromatography-tandem mass
spectrometry. J. Chromatogr. B 878 (2010) 3421-3426.
[54] M. Lombardo Agüí, L. Gámiz Gracia, C. Cruces Blanco, A. M. García Campaña.

Comparison of different simple treatments for the analysisi of quinolones in milk by
capillary-liquid cromatography with laser induced fluorescence detection. J.
Chromatogr. A 1218 (2011) 4966-4971.
[55] G. Van Royen, P. Dubruel, E. Daeseleire. Development and evaluation of a

molecularly imprinted polymer for the detection and cleanup of benzylpenicillin in
milk. J. Agric. Food Chem. 62 (2014) 8814-8821.
[56] J. Zhang, L. L. Wang, J. Q. Ma, Y. L. Wang. Preparation of ofloxacin

poly(glycidyl methacrylate-co-ethylenedimethacrylate) (P GMA/EDMA ) molecularly
imprinted microspheres and their application to the analysis of quinolones in milk.
Food Anal. Methods 7 (2014) 721-729.
[57] M. D. Marazuela, S. Bogialli. A review of novel strategies of sample preparation

for the determination of antibacterial residues in foodstuffs using liquid
chromatography-based analytical methods. Anal. Chim. Acta 645 (2009) 5-17.
224
Capítulo 7
[58] E. Karageorgou, A. Myridakis, E. G. Stephanou, V. Samanidou. Multiresidue LC-

MS/MS analysis of cephalosporins and quinolones in milk following ultrasound-
assisted matrix solid-phase dispersive extraction combined with the quick, easy,
cheap, effective, rugged, and safe methodology. J. Sep. Sci. 36 (2013) 2020-2027.
[59] M. Anastassiades, S. J. Lehotay, D. Stajnbaher, F. J. Schenck. Fast and easy

multiresidue method employing acetonitrile extraction/partitioning and "dispersive
solid-phase extraction" for the determination of pesticide residues in produce.
JAOAC Int. 86 (2003) 412-431.
[60] M. M. Aguilera Luiz, J. L. Martínez Vidal, R. Romero González, A. Garrido

Frenich. Multi-residue determination of veterinary drugs in milk by ultra-high-
pressure liquid chromatography-tandem mass spectrometry. J. Chromatogr. A 1205
(2008) 10-16.
[61] J. L. Martínez Vidal, A. Garrido Frenich, M. M. Aguilera Luiz, R. Romero-

González. Development of fast screening methods for the analysis of veterinary
drug residues in milk by liquid chromatography-triple quadrupole mass
spectrometery. Anal. Bioanal. Chem. 397 (2010) 2777-2790.
[62] S. K. B. Freitas, A. P. S. Paim, P. T. de Souza e Silva. Development of a LC-IT-

ToF MS procedure to quantify veterinary drug residues in milk employing a
QuEChERS approach. Food Anal. Methods 7 (2014) 39-46.
[63] M. Rezaee, Y. Yamini, M. Faraji. Evolution of dispersive liquid–liquid

microextraction method. J. Chromatogr. A 1217 (2010) 2342-2357.
[64] A. V. Herrera Herrera, M. Asensio Ramos, J. Hernández Borges, M. A. Rodríguez

Delgado. Dispersive liquid-liquid microextraction for determination of organic
analytes. Trends Anal. Chem. 29 (2010) 728-751.
[65] C. Mahugo Santana, Z. Sosa Ferrera, M. E. Torres Padrón, J. J. Santana Rodríguez.

Application of new approaches to liquid-phase microextraction for the
determination of emerging pollutants. Trends Anal. Chem. 30 (2011) 731-748.
225
Bibliografía
[66] X. Huang, L. Chen, M. Chen, D. Yuan, S. Nong. Sensitive monitoring of penicillin

antibiotics in milk and honey treated by stir bar sorptive extraction based on
monolith and LC-electrospray MS detection. J. Sep. Sci. 36 (2013) 907-915.
[67] X. Liu, Y. Yu, M. Zhao, H. Zhang, Y. Li, G. Duan. Solid phase extraction using
magnetic core mesoporous shell microspheres with C18-modified interior pore-
walls for residue analysis of cephalosporins in milk by LC-MS/MS. Food Chem.
150 (2014) 206-212.
[68] A. Kaufmann, P. Butcher, k. Maden, S. Walker, M. Widmer. Multi-residue

quantification of veterinary drugs in milk with a novel extraction and clean-up
technique: Salting out supported liquid extraction (SOSLE). Anal. Chim. Acta 820
(2014) 56-68.
[69] J. M. Hernández. Espectrometría de masas: Aplicaciones clínicas. Ed. Cont. Lab.

Clín. 11 (2007) 19-30.
[70] High-Throughput Analysis for Food Safety. Wiley (2014)
[71] Q. Hu, R. J. Noll, H. Li, A. Makarov, M. Hardman, R. G. Cooks. The Orbitrap: a

new mass spectrometer. J. Mass Spectrom. 40 (2005) 430–443.
[72] M.A. Bezerra, R. E. Santelli, E. P. Oliveira, L. A. Escaleira. Response surface

methodology (RSM) as a tool for optimization in analytical chemistry. Talanta 76
(2008) 965-977.
[73] S. L. C. Ferreira, W. N. L. dos Santos, C. M. Quintella, B. B. Neto, J. M. Bosque

Sendra. Doehlert matrix: a chemometric tool for analytical chemistry. Talanta 63
(2004) 1061-1067.
[74] Desarrollo de métodos de análisis para la cuantificación de disruptores endocrinos

químicos en muestras biológicas. Rocío Rodríguez Gómez. (2014) Universidad de
Granada (España)
[75] S. L. C. Ferreira, R. E. Burns, H. S. Ferreira, G. D. Matos, J. M. David, G. C.

Brandão, E. G. P. da Silva, L. A: Portugal, P. S. dos Reis, A. S. Souza, W. N. L. dos
Santos. Box-Behnken design: An alternative for the optimization of analytical
methods. Anal. Chim. Acta (2007) 179-186.
226
Capítulo 7
[76] Aplicación de la metodología de superficies de respuesta para el mejoramiento de

la calidad del aceite de soya. Alejandra Siqueiros Tarazón (2004) Universidad de
Sonora (México).
[77] A. Junza, R. Amatya, D. Barrón, J. Barbosa. Comparative study of the LC–MS/MS

and UPLC–MS/MS for the multi-residue analysis of quinolones, penicillins and
cephalosporins in cow milk, and validation according to the regulation
2002/657/EC. J. Chromatogr. B, 879 (2011) 2601- 261.
[78] Proteomic and metabolomic studies on milk during bovine mastitis. Rozaihan
Mansor (2012) University of Glasgow.
227

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Directores: Dr. José Barbosa Torralbo y Dra. Dolores Barrón Bueno

Barcelona, julio 2015

Que el presente trabajo de investigación titulado “Desarrollo de métodos de

Y para que conste, expedimos y firmamos el presente certificado.

Barcelona, julio 2015

Dr. José Barbosa Torralbo Dra. Dolores Barrón Bueno

Gràcies a l’Anna Jubert i la Rosa Codony del Laboratori Interprofessional Lleter de

Gracias a la gente del grupo de Ciencias de la vida del departamento de Química

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