B: Determinación de ALAT ALT (GPT): (E. C. 2.6.1.2).

La alanin-aminotransferasa, ALAT es la enzima que cataliza la transferencia del grupo amino del
aminoácido alanina a -cetoglutarato, liberando piruvato según la siguiente reacción:

GPT o ALAT
alanina + -cetoglutarato ⎯→ piruvato + ácido glutâmico

Sí acoplamos la reacción anterior a la reacción de reducción del piruvato a través de la enzima

láctica deshidrogenasa (LDH), podemos cuantificar la actividad de GPT. La enzima LDH requiere
de NADH+H+ como cofactor.

LDH
Piruvato + NADH+H+ ⎯→ lactato + NAD

A 340 nm NADH+H+ presenta el máximo de absorción en tanto que el cofactor oxidado, NAD,
prácticamente no absorbe a esa longitud de onda. La disminución de la absorbancia por unidad de
tiempo del NADH+H+ a 340 nm es directamente proporcional a la actividad de la enzima GPT. Para
realizar esta actividad práctica Ud. recibirá un kit reactivo que contiene las siguientes sustancias

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Linealidad del método: Es lineal hasta una concentración de 600 mg/dL.
Si la concentración de colesterol es mayor de 600 mg/dL en el suero o plasma diluir la muestra con
solución salina y repetir la determinación, multiplicando el resultado por el factor de dilución.

8.3.3 ASAT o AST (GOT)

Para realizar esta actividad práctica Ud. recibirá un kit reactivo que contiene las siguientes
sustancias:

Reactivo A: Tampón Tris-HCl pH 7,7 30 mM, Aspartato de sodio 280 mM, EDTA 7 mM
Reactivo B: NADH+H+ 0,25 mM, MDH  600 U/L, LDH  250 U/L, -cetoglutarato, sal sódica 12
mM. (Estará la mezcla preparada).

Al momento de usar se mezclan ambos reactivos y se conservan entre 2 y 8 °C y es estable durante

5 días conservado a esta temperatura. Se incluye LDH para eliminar el piruvato endógeno durante
la fase final.
Se usa como muestra suero o plasma obtenido con heparina, EDTA o citrato. El suero no debe
presentar hemólisis.

Materiales por grupo Reactivos

Espectrofotómetro Reactivo A
Cubetas Reactivo B
Pizeta
Vaso pp de 250
Micropipetas p1000, p200

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Procedimiento Experimental
Mezclar según se indica en la siguiente tabla (o como diga el inserto).
Volumen (mL)
Reactivo A y B a 37 °C 1,0
Suero 0,1

Después de 1 minuto medir la absorbancia a intervalos de 1 min. durante 10 minutos a 340 nm.
Cuide que la temperatura permanezca estable a 37 °C. Es posible operar a 30 C. Determine A /
min desde un gráfico Absorbancia versus tiempo en minutos. Use este valor para determinar la
actividad ASAT en el suero que esta analizando.

Cálculos:
a 37 ºC UI/L = A / min x 2570
a 30ºC UI/L = A / min x 1770

7.3.4. ALAT ALT (GPT): (E. C. 2.6.1.2).

Para realizar esta actividad práctica Ud. recibirá un kit reactivo que contiene las siguientes
sustancias:
Reactivo A: Tampón Tris-HCl pH 7,7 30 mM, Alanina 450 mM, EDTA 6 mM
Reactivo B: NADH+H+ 0,25 mM, LDH  250 U/L, -cetoglutarato, sal sódica 12 mM.

Al momento de usar se mezclan ambos reactivos y se conservan entre 2 y 8 °C y es estable

durante 5 días conservado a esta temperatura.
Se usa como muestra suero o plasma obtenido con heparina, EDTA o citrato. El suero no debe
presentar hemólisis.

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Materiales por grupo
Espectrofotómetro
Cubetas Pizeta
Vaso pp de 250 Micropipetas p1000, p200
Reactivos Reactivo A y Reactivo B

Procedimiento Experimental
Mezclar según se indica en la siguiente tabla (o como diga el inserto).
Volumen (mL)
Reactivo A y B a 37ºC 1,0
Suero 0,1

Mezclar e incubar 5 a 10 minutos a 37°C. Después de 1 minuto medir la absorbancia a intervalos

de 1 min. durante 10 minutos a 340 nm. Cuide que la temperatura permanezca estable a 37°C. Es
posible operar a 30 °C en este caso debe emplear 0,1 mL de suero y 1,0 mL de reactivo. Determine
A / min. desde un gráfico Absorbancia versus tiempo en minutos. Use este valor para determinar
la actividad GOT en el suero que esta analizando.
Cálculos:
a 37 ºC UI/L = A / min x 3570
a 30ºC UI/L = A / min x 1770

Cuestionario
1. Investigue por qué se deben conocer los valores de GOT y GPT
2. Investigue como interfiere y en que concentración citrato y EDTA (usado como anticoagulante).
3. ¿Qué diferencia hay entre suero y plasma sanguíneos?
4. ¿Da lo mismo utilizar suero o plasma en las determinaciones de GOT y GPT? Explique
5. Investigue como es el espectro de absorción del NAD y del NADH. ¿Cómo se relacionan con esta
actividad experimental?
6. Investigue por qué el ayuno para determinar glicemia no debe ser superior a las 12 horas.

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