Mitochondrial Transcription Factor B2 Is Essential For Mitochondrial and Cellular Function in Panc - En.es (ESP)

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Artículo original
El factor de transcripción mitocondrial B2 es esencial

para la función mitocondrial y celular en el páncreas.b-
células
Lisa M. Nicolás1,*,5, Berengère Valtat1,5, Anya Medina1, Lotta Anderson1, Mía Abels2, Inés G. Mollet3,
Deepak Jain4, Lena Eliasson3, Nils Wierup2, Malin Fex1, Hindrik Mulder1
ABSTRACTO
Objetivo:Liberación de insulina del páncreasb-las células está controlada por los niveles de glucosa en plasma a través del metabolismo de combustible mitocondrial. Por lo tanto, la
secreción de insulina depende de manera crítica del ADN mitocondrial (ADNmt) y de los genes que codifica. El factor de transcripción mitocondrial B2 (TFB2M) controla la transcripción de
genes codificados por mitocondrias. Sin embargo, su papel preciso en el metabolismo mitocondrial en el páncreasb-células y, en consecuencia, en la secreción de insulina sigue siendo
desconocido.
Métodos:Para dilucidar el papel de TFB2M en la función mitocondrial y la secreción de insulinain vitroyen vivo,ratones con unb-knockout homocigoto o
heterocigoto específico de la célula deTfb2my las células productoras de insulina clonales de rata en las que se silenció el gen se examinaron con una serie de
ensayos metabólicos y funcionales.
Resultados:Hubo un efecto de la dosis de genes enTfb2mexpresión y función. Pérdida deTfb2mcondujo a la diabetes debido a la transcripción interrumpida del
ADN mitocondrial (ADNmt) y al contenido reducido de ADNmt. La disfunción mitocondrial subsiguiente activó mecanismos compensatorios destinados a limitar
la disfunción celular y el daño deb-células. Estos procesos incluyeron la respuesta de la proteína mitocondrial desplegada, la mitofagia y la autofagia. Sin
embargo, en última instancia, estos sistemas de protección celular se anularon, lo que provocó una disfunción mitocondrial y la activación de vías apoptóticas
dependientes de mitocondrias. De este modo,b-la función celular y la masa se redujeron. Juntas, estas perturbaciones resultaron en una alteración de la
secreción de insulina, hiperglucemia progresiva y, en última instancia, el desarrollo de diabetes.
Conclusiones:Pérdida deTfb2men páncreasb-células da como resultado una disfunción mitocondrial progresiva. En consecuencia, se altera la secreción de insulina en
respuesta a estímulos metabólicos yb-masa celular reducida. Nuestros resultados indican que TFB2M juega un papel funcional importante en pancreáticob- células. Las
perturbaciones de sus acciones pueden conducir a la pérdida de funcionalidad.b-masa celular, un sello de T2D.
- 2017 Los Autores. Publicado por Elsevier GmbH. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
Palabras claveMetabolismo mitocondrial; Pancreáticob-células; secreción de insulina
1. INTRODUCCIÓN El factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) y el factor de transcripción

mitocondrial B2 (TFB2M) son necesarios para la transcripción de los genes
Pancreáticob-Las células mantienen la homeostasis metabólica al acoplar mitocondriales, mientras que el factor de transcripción mitocondrial B1
estrechamente los niveles de glucosa ambiental con la secreción de insulina.[1,2]. En (TFB1M) actúa como factor de traducción para las proteínas mitocondriales.
diabetes tipo 2 (T2D), que afecta a más de 380 millones de personas en todo el [8,9]. ratones con unb-eliminación específica de células (KO) deTfamdesarrollar
mundo[3],b-disfunción celular y pérdida deb-la masa celular conduce a la secreción b-disfunción celular e hiperglucemia[10]. Portadores de una variante común
defectuosa de insulina y al desarrollo de diabetes[1,4]. El metabolismo mitocondrial delTFB1M(rs950994) muestran una expresión reducida deTFB1Men los islotes
juega un papel central en la capacidad de detección de glucosa deb-células a través pancreáticos, así como alteración de la respuesta de la insulina a la glucosa,
del proceso de acoplamiento estímulo-secreción[5], por lo tanto, controlar la niveles elevados de glucosa durante una prueba de tolerancia oral a la glucosa
liberación de insulina de estas células[6]. y mayor riesgo futuro de DT2[11]. ratones con unb-KO específico de celda de
El mtDNA codifica 13 polipéptidos que forman parte de los complejos de transporte tfb1mmostrar disfunción mitocondrial, producción reducida de ATP y, en
de electrones I, III, IV y V, que llevan a cabo la respiración celular y la síntesis de ATP, consecuencia, alteración de la secreción de insulina estimulada por glucosa
también conocida como fosforilación oxidativa (OXPHOS)[7]. Ambos (GSIS)[12].
1Departamento de Ciencias Clínicas de Malmö, Unidad de Metabolismo Molecular, Centro de Diabetes de la Universidad de Lund, CRC, Hospital Universitario de Skåne, 20502, Malmö, Suecia2Departamento de
Ciencias Clínicas de Malmö, Unidad de Biología Celular Neuroendocrina, Centro de Diabetes de la Universidad de Lund, CRC, Hospital Universitario de Skåne, 20502, Malmö, Suecia3Departamento de Ciencias
Clínicas de Malmö, Unidad de Exocitosis de Células de los Islotes, Centro de Diabetes de la Universidad de Lund, CRC, Hospital Universitario de Skåne, 20502, Malmö, Suecia4Departamento de Ciencias Médicas
Experimentales, Centro de Diabetes de la Universidad de Lund, CRC, Hospital Universitario de Skåne, 20502, Malmö, Suecia
5Lisa M. Nicholas y Bérengère Valtat contribuyeron igualmente a este trabajo.
* Autor correspondiente. Laboratorios de Investigación Metabólica de la Universidad de Cambridge, Wellcome Trust-MRC Institute of Metabolic Science, Addenbrooke's Hospital, Cambridge,
CB2 0QQ, Reino Unido. Correo electrónico:ln305@medschl.cam.ac.uk (LM Nicolás).
Recibido el 2 de abril de 2017-Revisión recibida el 6 de mayo de 2017-Aceptado el 10 de mayo de 2017-Disponible en línea el 19 de mayo de 2017
http://dx.doi.org/10.1016/j.molmet.2017.05.005
METABOLISMO MOLECULAR 6 (2017) 651mi663 -2017 Los Autores. Publicado por Elsevier GmbH. Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).
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Artículo original
En contraste con TFAM y TFB1M, el conocimiento sobre el papel de TFB2M en KRBB que contiene glucosa 2,8 mM, glucosa 16,7 mM, glucosa 2,8 mM y
pancreáticob-faltan células y si la pérdida de TFB2M conduce a una disfunción glucosa 10 mMa-KIC o glucosa 2,8 mM y KCl 35 mM. La insulina secretada se
mitocondrial. Con este fin, examinamos las consecuencias funcionales de determinó mediante ELISA (Mercodia, Uppsala, Suecia).
Tfb2m-deficiencia en ratones conb-homocigotos y heterocigotos específicos
de células KO deTfb2my en células productoras de insulina clonales de rata. 2.5. Contenido de insulina de los islotes
Encontramos esoTfb2m-la deficiencia condujo rápidamente a una disfunción La insulina se extrajo en 100metrol de etanol/ácido clorhídrico. El
mitocondrial generalizada, que anuló gradualmente los sistemas de sobrenadante se analizó mediante ELISA (Mercodia, Uppsala, Suecia).
protección celular. Esto resultó enb-disfunción celular, así como una mayor
activación de la apoptosis a través de la vía mitocondrial dependiente y 2.6. potencial de membrana mitocondrial
pérdida deb-masa celular. Los islotes se cargaron con TMRM 400 nM durante 2 h en KRBB que contenía
glucosa 2,8 mM, lo que permitió el análisis en "modo de extinción".[dieciséis].
2. MATERIALES Y MÉTODOS El TMRM se excitó a 543 nm y la emisión se detectó con un filtro de paso largo
de 585 nm. Los islotes se estimularon con glucosa 16,7 mM para investigar los
2.1. Generación de ratones conb-knockout homocigoto y heterocigoto cambios en el potencial de membrana mitocondrial.
específico de la célula deTfb2m
Para generar un KO condicional deTfb2menb-células, usamosTfb2mloxP/ loxPratones 2.7. Procesamiento de tejidos
en los que el exón 2 delTfb2mel locus estaba flanqueado por dos sitios loxP. El Se disecaron los páncreas y se pesaron antes de fijarlos durante la noche a 4°C en
esperma para establecer nuestra colonia de estos ratones se obtuvo del Proyecto solución de Stefanini. El tejido se lavó minuciosamente en solución de Tyrode que
Knock Out Mouse (https://www.komp.org/index.php) en la Universidad de California, contenía sacarosa al 10% y luego se congeló en hielo seco. 10metrom secciones
Davis. heterocigotoTfb2mþ/loxPlos ratones se aparearon con ratones transgénicos fueron cortadas y descongeladas montadas en portaobjetos.
heterocigotos que expresabanCrerecombinasa bajo el control del promotor del gen
de la insulina de rata 2 (Rip Cre)[13]. Ratones 2.8. inmunohistoquímica
con el genotipoTfb2mþ/loxP,þ/Rip Crefueron recuperadas de este cruce y Las secciones se incubaron con anticuerpo primario contra insulina
criadas conTfb2mloxP/loxPratones para generarTfb2mloxP/loxP,þ/Rip Cre (dilución: 1:5000, código: 9003, EuroDiagnostica, Malmö, Suecia) y con
(b-Tfb2m-/-)b-específico de la célulaTfb2mratones KO homocigotos,Tfb2mþ/ loxP, anticuerpo secundario con especificidad para cobaya IgG (Jackson, West
þ/Rip Cre(b-Tfb2mþ/-)b-específico de la célulaTfb2mratones KO heterocigotos, y Grove, PA EE. UU.). Las secciones se montaron en PBS:glicerol (1:1).
Tfb2mloxP/loxPratones de control. Se utilizaron tanto animales machos como
hembras para los experimentos de control yb-Tfb2m-/-ratones de 18 a 50 días; 2.9. Morfometría
sólo se utilizaron machos para los experimentos de control yb- Tfb2mþ/- Parab-cuantificación de la masa celular, todos los islotes en partes
ratones a los seis o siete meses de edad. La crianza y el manejo de los ratones seleccionadas al azar de cada páncreas se analizaron utilizando el software
se llevaron a cabo de acuerdo con los procedimientos aprobados por el comité NIS-Elements (NIS-Elements 3.1, Nikon, Tokio, Japón) como se describió
regional de ética animal en Lund, Suecia. anteriormente[12]. Se analizaron y calcularon el área total teñida con insulina
y el área total de la sección. La relación lograda se multiplicó por el peso del
2.2. Mediciones de glucosa e insulina páncreas para calcular elb-masa celular.
Se recolectó sangre cuando los ratones fueron asesinados por dislocación
cervical y decapitación en d18, d50 (b-Tfb2m-/-), y siete meses de edad (b- 2.10. Microscopio de transmisión por electrones
Tfb2mþ/-). La determinación cuantitativa de la glucosa plasmática se llevó a Grupos de 40miSe fijaron 50 islotes aislados en tampón de Millonig y se postfijaron
cabo utilizando Infinity-Glucose Oxidase (Thermo Fisher Scientific, (Waltham, en tetróxido de osmio al 1,0%, luego se deshidrataron y se incluyeron en AGAR 100
MA, EE. UU.). La insulina se midió mediante ensayo inmunoabsorbente ligado (Oxfors Instruments Nordiska AB, Suecia). 70miSe cortaron, montaron y contrastaron
a enzimas (ELISA) (Mercodia, Uppsala, Suecia). Prueba de tolerancia a la secciones ultrafinas de 90 nm de espesor antes de examinarlas en el microscopio
glucosa intravenosa (IVGTT) también se llevó a cabo enb-Tfb2mþ/ electrónico JEM 1230 (JEOL-USA, Inc, MA, EE. UU.). Las micrografías se analizaron con
-
ratones a los seis meses de edad como se describe[15]. La comida se retiró 1 h respecto a la morfología mitocondrial y la distribución de gránulos en relación con la
antes de la exposición a la glucosa. Los ratones fueron anestesiados como se membrana celular. Los diámetros de los gránulos se analizaron utilizando ImageJ
describió previamente.[15]. Se recogió sangre retroorbitalmente a los 0, 1, 5, 10, 20, (NIH, software gratuito) y se estimó el diámetro de los gránulos en 3D.[17]. La
50 y 75 min después de la inyección intravenosa de glucosa (1 g/kg de peso corporal) densidad volumétrica de los gránulos (Nv) y densidad superficial (Ns) se calcularon a
para determinar la concentración de glucosa e insulina en plasma como se describe partir del área celular y la distancia de los gránulos a la membrana utilizando un
anteriormente. programa Matlab interno en MatLab7 (MathWorks, Natick, MA, EE. UU.) y métodos
volumétricos descritos en otros lugares[18].
2.3. Aislamiento de islotes pancreáticos
El páncreas se perfundió con solución de colagenasa P (Roche) (ratones de 35 2.11. Cultivo celular y ARN de interferencia
días y adultos: 3 ml; ratones de 18 días: 1 ml) a través del colédoco. Se Las células INS-1 832/13 se cultivaron como se describió anteriormente
recogieron pancreata y se digirieron a 37 °C durante 18 min (ratones adultos y [19]y se transfectó utilizando una mezcla de reactivo de transfección
de 35 días) o 15 min (ratones de 18 días). Los islotes se recolectaron a mano Lipofectamine-RNAiMAX (Invitrogen, Life Technologies, Estocolmo,
bajo un microscopio estereoscópico y se incubaron a 37 C durante la noche en Suecia) y los respectivos siRNA Silencer Select. Se empleó la secuencia de
una atmósfera humidificada de aire y 5% de CO2en medio RPMI-1640 (glucosa control, Silencer Negative Control #2 (Ambion, Life Technologies). Las
11,1 mM) suplementado con FBS al 10 %, penicilina 100 U/ml y 100metro células se cultivaron en medio RPMI-1640 completo durante 72 h a 37 C,
sulfato de estreptomicina g/ml. 5% CO2en presencia de ARNsi 50 nM antes de los análisis funcionales.
2.4. Ensayo de secreción de insulina en islotes 2.12. Ensayo de secreción de insulina en células INS-1 832/13
Los islotes se incubaron en KrebsmiTampón de bicarbonato de Ringer (KRBB) con glucosa Antes del ensayo, las células se incubaron en tampón de ensayo de secreción
2,8 mM durante 1 h. A continuación, se incubaron grupos de islotes durante 1 h en (SAB) y se complementaron con glucosa 2,8 mM durante 2 h. Entonces se
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se añadieron y las células se incubaron durante 1 h en SAB que contenía (Laboratorios Vector, CA, EE. UU.). Se capturaron con una cámara digital (Nikon
glucosa 2,8 mM, glucosa 16,7 mM, piruvato 10 mM, glucosa 2,8 mM y KCl DS-2Mv) imágenes de células en las cámaras de portaobjetos de 8 pocillos,
35 mM o leucina/glutamina 10 mM. La insulina secretada se determinó vistas con un microscopio de epifluorescencia (Olympus, BX60) con un objetivo
mediante radioinmunoensayo Coat-a-Count (Siemens Medical Solutions 100. Los datos de imagen se recopilaron con una plataforma de alto contenido
Diagnostics, Los Ángeles, CA). ArrayScan-XTI Live con un objetivo 20 (Cellomics, Waltham, MA, EE. UU.). Se
analizaron imágenes de 500 células para cada grupo de tratamiento para
2.13. Cuantificación de la expresión de ARNm mediante PCR cuantitativa en obtener el área de fluorescencia LC3 por célula.
tiempo real (qRT-PCR)
El ARN total se extrajo de los islotes y las células INS-1 832/13 utilizando el kit 2.16. Contenido de ADN mitocondrial
de purificación de ARN RNAeasy (Qiagen GmbH, Hilden, Alemania). Se El ADN genómico y mitocondrial se extrajo y amplificó por PCR, utilizando
transcribieron cantidades iguales de ARN total utilizando el kit de síntesis de cebadores para el receptor de melanocortina-4 (MC4R) y la subunidad II de la
ADNc RevertAid-First-Strand (Fermentas, Vilnius, Lituania). La qRT-PCR se citocromo oxidasa (CoxII), respectivamente.
realizó en el sistema ViiA7 qRT-PCR, utilizando ensayos de expresión génica
TaqMan prediseñados (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). La 2.17. Cuantificación del contenido de ATP
expresión génica se determinó mediante el método de cuantificación absoluta Los islotes y las células INS-1 832/13 se incubaron en SAB que contenía
y se normalizó a la expresión deHprt. glucosa 2,8 o 16,7 mM durante 1 h y se estimularon. Los islotes y las células se
lisaron seguido de congelación instantánea en una mezcla de hielo seco y
2.14. Cuantificación de la abundancia de proteínas mediante transferencia etanol. El contenido de ATP a 2,8 o 16,7 mM de glucosa se ensayó utilizando
Western islotes (control,norte¼6 ratones yb-Tfb2m-/-,norte¼5 ratones) y un ensayo luminiscente basado en luciferasa (BioTherma, Handen, Suecia)
células INS-1 832/13 (norte¼5 pasajes/grupo diferentes) se lisaron en tampón según las instrucciones del fabricante.
de ensayo de radioinmunoprecipitación (RIPA) mezclado con un cóctel
inhibidor de proteasa 1:100 (v/v) (Sigma, St. Louis, MO, EE. UU.) y se separaron 2.18. Actividad de citrato sintasa
en un Mini-PROTEAN TGX Precast Gel Any kDa (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.). La actividad de citrato sintasa se midió en mitocondrias aisladas de
Cada gel se cargó con proteína de todos los controles yTfb2m-muestras células INS-1 832/13. La actividad se determinó a 412 nm agregando
deficientes. Para las células INS-1 832/13, una cantidad igual de proteína (20 ácido oxaloacético 10 mM y detectando la formación de ácido 2-nitro-5-
metrog) se cargó en cada pocillo. Por el contrario, debido al bajo rendimiento tiobenzoico como se describió anteriormente.[20].
de proteína en los islotes, los pocillos se cargaron con la cantidad máxima de
proteína disponible, lo que resultó en diferentes cantidades de proteína 2.19. Consumo de oxigeno
cargada entre el control y el control.b-Tfb2m-/ Las tasas de consumo de oxígeno (OCR) se midieron con el analizador de flujo
-
muestras Las proteínas se transfirieron a una membrana de extracelular XF24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Las células se
difluoruro de polivinilideno utilizando el sistema de transferencia Turbo preincubaron durante 2 horas a 37 °C en un tampón de ensayo que contenía
TransBlot (Bio-Rad, Hercules, CA, EE. UU.), se bloquearon y se incubaron glucosa 2,8 mM. La respiración se midió en presencia de glucosa 16,7 mM. Se
durante la noche a 4 °C con antisueros primarios contra: AKT, fosfo-AKT inyectaron oligomicina, FCCP y rotenona como se mostró anteriormente[21].
(Ser 473), BAX, BCL-2, caspasa escindida 3 (CC3), caspasa escindida 9 Todos los cálculos se realizaron como se describió anteriormente.[21].
(CC9) y DDIT3/CHOP (tecnología de señalización celular, Danvers, EE.
UU.), HSP60, MT-ND1, PARKIN, PINK1, NDUFB8, SDHB, UQCRC2, MT-CO1 2.20. Detección de ROS
y ATP5A (OXPHOS total), TFAM, TFB1M, TFB2M (Abcam, Cambridge, Se detectaron especies reactivas de oxígeno (ROS) en presencia y ausencia de
Reino Unido), CLPP (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, EE. UU.). Las 10metroM del antioxidante N-acetil-L-cisteína utilizando la DCFDAmiKit de
membranas se lavaron y el anticuerpo unido se detectó usando ensayo de detección de ROS celular (Abcam, Cambridge, Reino Unido) según
anticuerpos secundarios conjugados con peroxidasa de rábano picante y las instrucciones del fabricante.
reactivos de quimioluminiscencia mejorados (Bio-Rad, Hercules, CA, EE.
UU.). Se utilizó el software Image Lab versión 5.2.1 (Bio-Rad, Hercules, 2.21. Estadísticas
CA, EE. UU.) para cuantificar la densidad de bandas específicas.b- Todos los cálculos se realizaron en el software GraphPad Prism 6.03
tubulina (Abcam). Todas las membranas se eliminaron una vez utilizando (GraphPad, La Jolla, California, EE. UU.).PAGlos valores se consideraron
Restore-Western Blot Stripping Buffer (Thermo Fisher Scientific, significativos a menos de 0,05. Todos los datos se presentan como SEM medio
Waltham, MA, EE. UU.) después de la detección de la proteína de interés del número indicado de experimentos o animales. Los datos se analizaron
para cuantificar la abundancia de utilizando Student's no apareadot-prueba, ANOVA de 1 vía o medida repetida
b-tubulina en la misma membrana. de ANOVA de 2 vías con la prueba post hoc de Tukey cuando se compararon
más de dos grupos.
2.15. inmunofluorescencia
Los islotes dispersos y las células INS-1 832/13 se cultivaron durante 24 h. Se 3. RESULTADOS
añadió LC3B-GFP (Premo Autophagy sensores BacMam 2.0; Life technologies-,
Waltham, MA, EE. UU.) a las células y se cultivó durante 18 h. Dos horas antes 3.1. Pérdida deTfb2menb-las células dan como resultado la alteración de la
del final del tiempo de incubación, se añadió LysoTracker Red DND-99 o homeostasis de la glucosa y el desarrollo de diabetes
Mitotracker Mitochondrion-selective Probe (Life technologies-) diluido en Ratones con un KO homocigoto deTfb2menb-células (b-Tfb2m-/-) mostró un
medio RPMI fresco. Las células se lavaron en PBS y se fijaron con aumento de la glucosa en plasma (P < 0,05;Figura 1A) pero sin cambios en la
paraformaldehído al 4 % durante 20 min. Las células se tiñeron conjuntamente concentración de insulina plasmática (Figura 1B) en estado de alimentación
con antiinsulina de cobaya policlonal (Dako, Carpinteria, CA, EE. UU.), usando libre desde los 18 días de edad. A los 50 días de edad, la hiperglucemia se
Alexa Fluor 594 anti-cobaya IgG (HþL) conjugado (Invitrogen, Waltham, MA, EE. acentuó aún más enb-Tfb2m-/-ratones (P < 0,0001; 1c); los niveles de insulina
UU.) como anticuerpo secundario. Finalmente, las células se montaron con en plasma ahora se redujeron notablemente en el estado de alimentación
montura Vectashield con DAPI para morfología nuclear. libre (P <0.01;Figura 1D).
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Figura 1: Homeostasis de glucosa en control yb-Tfb2m-/-ratones. (A) Glucosa plasmática y (B) concentraciones de insulina en control sin ayuno yb-tfb1m-/-ratones a los 18 días de edad; control,norte¼11 yb-
tfb1m-/-,norte¼13. (C) glucosa plasmática y (D) concentraciones de insulina en control sin ayuno yb-tfb1m-/-ratones a las siete semanas de edad; control, norte¼7 yb-tfb1m-/-,norte¼6. Todos los datos son
medias sem. Las diferencias estadísticas se examinaron mediante pruebas de Student no apareadas.t-prueba. *P < 0,05, **P < 0,01 y ****P < 0,0001 frente al valor correspondiente para los ratones de control.
3.2. Pérdida deTfb2menb-células da como resultado una disminución de la expresión de ex-vivoen islotes pancreáticos aislados. GSIS ya estaba comprometido en
genes codificados mitocondriales en los islotes pancreáticos b-Tfb2m-/-ratones a los 18 días de edad (P < 0.001) y esto persistió después del
Luego examinamos si el fenotipo diabético deb-Tfb2m-/- destete (Día 35; P < 0.001) (figura 3ANTES DE CRISTO). También examinamos la
ratones se debió a la disminución de la expresión de genes codificados por secreción de insulina en respuesta al combustible mitocondriala-ácido
mitocondrias.Tfb2mLa expresión de ARNm se redujo en aproximadamente un 80% cetoisocaproico (a-KIC), así como el cloruro de potasio (KCl), que evita el
en los islotes deb-Tfb2m-/-ratones (a los 35 días de edad) (P < 0,01;Figura 2A). acoplamiento metabólico y despolariza directamente la membrana plasmática.a-La
Mientras que la expresión del ARNm deTfamdisminuyó (P < 0.05), la abundancia de secreción de insulina estimulada por KIC se vio afectada en los islotes deb-Tfb2m-/-
proteína TFAM no cambió (Figura 2B). A diferencia de,tfb1mLa expresión génica no ratones en ambos 18 (P < 0,05;figura 3B) y 35 días de edad (P¼0,06;figura 3C). Por el
se vio afectada por la pérdida deb-tfb2m (control: 1,02 0,13; contrario, la secreción de insulina estimulada por KCl no se vio afectada enb- Tfb2m
b-Tfb2m-/-: 0,94 0,06). Hubo una reducción significativa en la expresión de -/-islotes antes y después del destete (figura 3ANTES DE CRISTO). El contenido de
genes codificados por mitocondriasmt-atp8 (p<0,001),mt-Co1 (p<0,01),mt-Cyb ( insulina de los islotes no cambió enb-Tfb2m-/-ratones a los 18 días de edad (Control:
p<0,05),mt-Nd1 (P < 0,05), ymt-Rnr2 (P < 0.05), así como la abundancia de 9,4 2,7metrog/islote vs.b-Tfb2m-/-: 7,9 2,0metrog/islote). Dado que observamos
proteína de MT-CO1 (P < 0.05) enb- Tfb2m-/-islotes (Figura 2CD). También hubo GSIS perturbado enb-Tfb2m-/-islotes, a continuación examinamos la ultraestructura
una disminución en la abundancia de proteínas mitocondriales codificadas en de los gránulos.b-células enb-Tfb2m-/-Los islotes de ratones de 18 días de edad
el núcleo NDUFB8 (P < 0,05) y UQCRC2 (P < 0,05) y una mayor abundancia de mostraron una mayor densidad superficial de vesículas de núcleo denso grande
ATP5A (P < 0,05), que forman parte del Complejo I, III y V, respectivamente ( acopladas (LDCV) en las que se empaqueta la insulina (P <0.05; figura 3D). Sin
Figura 2D). Esto sugiere que la estabilidad de las proteínas codificadas por el embargo, la densidad de volumen de LDCV, que refleja el número total de gránulos
núcleo en las mitocondrias depende de las proteínas codificadas por las de insulina, no se modificó (Control: 8,16 ± 0,31 gránulos/metrometro3contrab-
mitocondrias críticas.[12]. El contenido de mtDNA también disminuyó enb- Tfb2m-/-: 7,97 0,33 gránulos/metrometro3). Estos datos concuerdan con nuestro
Tfb2m-/-islotes (Figura 2MI). hallazgo de que el contenido de insulina no cambia enb- Tfb2m-/-islotes; un mayor
número de gránulos acoplados concuerda con una deficiencia de señales
3.3. Pérdida deTfb2menb-las células conduce a la disfunción mitocondrial y, en metabólicas que promueven la exocitosis. Juntos, nuestros datos sugieren que la
consecuencia, al deterioro de la secreción de insulina pérdida deTfb2mconduce al deterioro de la función mitocondrial y al acoplamiento
A continuación, determinamos las consecuencias funcionales deb-pérdida metabólico de la secreción de insulina.
específica de células deTfb2men islotes. Un determinante crítico de la función
mitocondrial es la hiperpolarización inducida por la glucosa de la membrana 3.4. Pérdida deTfb2menb-Las células conducen a una ultraestructura
mitocondrial interna, que impulsa la cadena respiratoria. De hecho, la mitocondrial alterada y una mitofagia alterada.
disminución máxima en la fluorescencia de TMRM se redujo en un 40 % en los En vista de la disfunción mitocondrial, examinamos la ultraestructura
islotes deb- Tfb2m-/-ratones después de la estimulación con glucosa 16,7 mM mitocondrial enb-Tfb2m-/-islotes, usando microscopía electrónica de
(Día 18; P <0,05,figura 3A). transmisión (TEM). De hecho, hubo una mayor abundancia de
Dada la disfunción mitocondrial enb-Tfb2m-/-islotes y el papel regulador de las mitocondrias vesiculares e hinchadas enb-células deTfb2m-ratones
mitocondrias en la secreción de insulina, luego investigamos GSIS deficientes (P < 0,0001;Figura 4A).
Figura 2: Expresión de genes asociados a mitocondrias y contenido de ADN mitocondrial en control yb-Tfb2m-/-ratones. (A) Análisis qRT-PCR deTfb2mARNm en islotes de control yb-Tfb2m-/-
ratones;norte¼3 ratones (B) análisis qRT-PCR deTfamARNm (izquierda;norte¼3 ratones/grupo) y análisis de Western blot y densitometría de la abundancia de proteína TFAM (derecha;
control,norte¼6 ratones yb-Tfb2m-/-,norte¼5 ratones) en islotes de control yb-Tfb2m-/-ratones. (C) análisis qRT-PCR deatp8, co1, cibernético, nd1,yRnr2ARNm en islotes de control yb-Tfb2m-/-
ratones,norte¼3 ratones/grupo. (D) Western blot y análisis de densitometría de la abundancia de proteínas NDUFB8, SDHB, UQCRC2, MT-CO1 y ATP5A en islotes de control yb-Tfb2m-/-
ratones; control,norte¼6 ratones yb-Tfb2m-/-,norte¼5 ratones (E) Contenido de ADN mitocondrial en islotes de control yb-Tfb2m-/-ratones; control, norte¼6 ratones yb-Tfb2m-/-,norte¼9
ratones. Se muestran imágenes representativas de transferencias Western cuantitativas. Todos los datos son medias sem. Las diferencias estadísticas se examinaron mediante pruebas de
Student no pareadas.t-prueba. *P < 0,05, **P < 0,01 y ***P < 0,001 frente al valor correspondiente para los ratones de control.
Luego evaluamos si las mitocondrias disfuncionales estaban siendo clarob-gránulos, fueron activados[24]. La inmunotinción reveló un área
eliminadas de manera efectiva por la mitofagia, la degradación selectiva aumentada de LC3þpuncta enb-células deb-Tfb2m-/-islotes el día 18 (P <
de las mitocondrias por la autofagia. La autofagia se inicia con la 0,001;Figura 5A). Esto es característico de la activación de la autofagia y,
formación de una estructura de doble membrana, el fagóforo, que en consecuencia, la expresión del marcador de autofagia de etapa
evoluciona hacia el autofagosoma. Pérdida deTfb2menb-células deb- posterior.ctsb[24]se incrementó (P < 0.05), mientras que la expresión de
Tfb2m-/-los islotes aumentaron la cantidad de mitocondrias dirigidas a Lámpara2,un regulador negativo de la autofagia[25]disminuyó (P < 0.05)
los autofagosomas marcados con LC3-GFP (P <0.05;Figura 4B). Esto (Figura 5B).
plantea dos posibilidades: (1) aumento de la producción de Determinamos la fusión autofagosoma-lisosoma cuantificando el área de
autofagosomas y/o (2) eliminación reducida de autofagosomas debido a LC3þpuncta co-teñido con el colorante Lysotracker específico del
una fusión alterada de autofagosoma-lisosoma.[22]. lisosoma, lo que refleja la presencia de autofagolisosomas. Esto fue
Para resolver esto, examinamos la expresión de los genes clave de la interrumpido enb-células deb-Tfb2m-/-islotes ya que hubo una reducción
mitofagia. rosa1 (control: 1,01 0,09;b-Tfb2m-/-: 1,12 0,17),parque2 en el número de LC3þpuntos puncta coteñidos con Lysotracker (P <
(Control: 1,04 0,20;b-Tfb2m-/-: 0,93 0,04), yMfn2 (control: 1,01 0,11;b- 0,001;Figura 5C). La autofagia también se activa en respuesta al estrés
Tfb2m-/-: 0.80 0.08), que están involucrados en procesos aguas arriba de del RE.[26]. De hecho, la expresión de los marcadores de estrés ERDdit3
la formación de autofagosomas[23], se mantuvieron sin cambios en (P < 0.0001) yCebpb (P < 0,001) se incrementó significativamente enb-
Tfb2m-deficienteb-células. Curiosamente, la expresión del maestro Tfb2m-/-islotes ya a los 18 días de edad (Figura 5D).
regulador de lab-celúla,pdx1 (P < 0,01), que recientemente se ha
implicado en la regulación de la mitofagia enb-células[22], se redujo en 3.6. Pérdida deTfb2menb-células da como resultado cambios en los marcadores
b-Tfb2m-/-islotes, al igual que la expresión de objetivos genéticos aguas apoptóticos, reducciónb-masa celular y densidad de islotes reducida La autofagia
abajo de Pdx1: Ins1 (p<0,05),Ins2 (p<0,01),Slc2a2 (P < 0,001) (Figura 4c), y desregulada (incluida la mitofagia) puede eventualmente conducir a un aumento de
Tfam (p<0,05;Figura 2B). la apoptosis. En consecuencia, encontramos una mayor abundancia de proteínas de
la caspasa 9 escindida (P <0.05) pero no de la caspasa 3 escindida enb-Tfb2m-/-islotes
3.5. Pérdida deTfb2menb-células conduce a una autofagia alterada Con base Sin embargo, la proporción de Bax proapoptótico a Bcl-2 antiapoptótico se redujo (P
en nuestros hallazgos de una mayor densidad de LDCV acoplados frente a la < 0,05;Figura S1a), lo que sugiere que los mecanismos de protección pueden
reducción de glucosa ya-secreción de insulina estimulada por KIC, activarse en estos jóvenesb-Tfb2m-/-
investigamos si los procesos autofágicos, que son responsables de ratones.
655
Artículo original
Figura 3: Pérdida deTfb2menb-las células conduce a la disfunción mitocondrial y al deterioro de la secreción de insulina. (Una izquíerdamiCinética de extinción de TMRM en islotes de control yb- Tfb2m-/-
ratones,norte¼5 ratones BienmiCambio en la intensidad de fluorescencia de TMRM desde el inicio después de la estimulación de islotes aislados de control yb-Tfb2m-/-ratones con glucosa 16,7 mM, lo que
conduce a la hiperpolarización de la membrana y a una intensidad de fluorescencia mínima en el modo de extinción,norte¼5 ratones (B) Secreción de insulina de los islotes aislados del control yb-Tfb2m-/-
ratones a los 18 días de edad. Los islotes se incubaron durante 1 h en glucosa 2,8 mM y 16,7 mM, glucosa 2,8 mM con glucosa 10 mMa-ácido cetoisocaproico (a-KIC) y glucosa 16,7 mM con cloruro de potasio
35 mM (KCl); control,norte¼5 ratones,b-Tfb2m-/-,norte¼7 ratones. (C) Secreción de insulina de los islotes aislados del control yb-Tfb2m-/-ratones a los 35 días de edad. Los islotes se incubaron durante 1 h en
glucosa 2,8 mM y 16,7 mM, 10 mMa-ácido cetoisocaproico (a-KIC) y glucosa 16,7 mM con cloruro de potasio 35 mM (KCl); control,norte¼3 ratones,b-Tfb2m-/-,norte¼6 ratones. (D) Densidad superficial de
vesículas de núcleo denso grandes acopladas enb-células de control yb-Tfb2m-/-islotes aislados de ratones de 18 días. Los gránulos se definieron como acoplados si el centro de los gránulos estaba dentro de
los 150 nm de la membrana plasmática, control yb-Tfb2m-/-,norte¼4 ratones cada uno a los 18 días de edad. Todos los datos son medias sem. Las diferencias estadísticas se examinaron mediante pruebas de
Student no pareadas.t-prueba. *P < 0,05 y ***P < 0,001 frente al valor correspondiente para los ratones de control.
En vista de estos hallazgos, examinamos si hubo pérdida deb- masa celular en para la glucosa plasmática aumentó (P < 0,05) y la respuesta aguda de la
siete semanas de edadTfb2m-/-ratones, que presentan diabetes manifiesta. De insulina tendió a ser menor (P¼0,07;Figura S2e,f).
hecho, el análisis estereológico cuantitativo imparcial mostró una marcada Tras la estimulación con glucosa 16,7 mM, la disminución máxima de la
reducción enb-masa celular en diabeticosb-Tfb2m-/-ratones (P < 0,05;Figura intensidad de fluorescencia de TMRM se redujo en un 64 % en muestras
S1b), así como una densidad de islotes reducida (P < 0.01; Figura S1c). aisladas.b- Tfb2mþ/-islotes (P < 0.05,Figura S2g). El paso final en el
metabolismo mitocondrial es la producción de ATP; Encontramos esob- Tfb2m
þ/-Los islotes contenían niveles basales aumentados de ATP (P¼0,05; Figura
3.7. Pérdida heterocigótica deTfb2menb-Las células también dan como resultado una S2h). El contenido de ATP, sin embargo, fue menor en estos islotes en el
alteración de la homeostasis de la glucosa en ratones como consecuencia del deterioro de estado estimulado por glucosa en comparación con los islotes de control (P <
la función mitocondrial y la disminución de la secreción de insulina. 0,05; Figura S2i).
A continuación, determinamos siTfb2mejerce un efecto de dosis de genes en Secreción de insulina en respuesta a la glucosa (P < 0,001) ya-KIC (P¼0.05)
la función de los islotes, utilizando ratones con un objetivoTfb2m-alelo enb- también se redujo deb-Tfb2mþ/-islotes (Figura S2j). Contrariamente ab-Tfb2m
células (b- Tfb2mþ/-ratones).Tfb2mexpresión enb-Tfb2mþ/-islotes se redujo en -/-islotes, la respuesta de la insulina a KCl se redujo significativamente enb-
aproximadamente un 50 % en comparación con los controles (P < 0,05;Figura Tfb2mþ/-islotes (Figura S2j; P < 0,001), pero el contenido de insulina de los
S2a), confirmando queTfb2mla expresión depende del número de alelos islotes no fue diferente (Control: 15,0 3,4metrog/islote vs.b-Tfb2mþ/-: 18,6 3,9
funcionales, es decir, de la dosis génica. En contraste conb-Tfb2m-/-ratones, metrog/islote). Encontramos, sin embargo, queb- Tfb2mþ/-los ratones habían
expresión deTfam se mantuvo sin cambios enb-Tfb2mþ/-islotes (Figura S2a), disminuido el contenido de insulina pancreática por peso de páncreas (P <
como eratfb1mexpresión génica (Control: 1,02 0,13;b-Tfb2mþ/-: 1,02 0,10). 0,05;Figura S2k). Esto podría explicarse por la reducción
Además, de los genes codificados por mitocondrias, sólo la expresión demt- b-masa celular, es decir, número de islotes reducido ya que el contenido de insulina
atp8 (p<0,01) ymt-Nd5/6 (P < 0.05) disminuyó en los islotes deb- Tfb2mþ/- de los islotes no cambió. Este hallazgo recuerda la reducción en la densidad de
ratones; expresión génica demt-Co1, mt-Cyb,ymt-Nd1 permanecido sin islotes que se observó enb-Tfb2m-/-ratones (Figura S1c). De este modo,b-pérdida
cambios (Figura S2b). específica de células deTfb2mla expresión de un alelo es suficiente para alterar tanto
De acuerdo con el efecto más modesto sobre las proteínas mitocondriales, el la función mitocondrial como la secreción de insulinaen vivoyin vitro.
fenotipo deb-Tfb2mþ/-ratones se retrasó y fue menos pronunciado que el deb-
Tfb2m-/-ratones: la concentración de glucosa plasmática sin ayunas tendió a 3.8. silenciamiento deTFB2Men las células productoras de insulina da como
ser solo ligeramente elevada (P¼0,07) mientras que la insulina plasmática fue resultado una disminución de la expresión de genes codificados mitocondriales,
menor (P < 0,01) enb-Tfb2mþ/-ratones a los siete meses de edad (Figura S2c, d disfunción mitocondrial y alteración de la secreción de insulina
). Enb-Tfb2mþ/-ratones sometidos a una prueba de tolerancia a la glucosa Para alcanzar una comprensión mecanicista más profunda, creamos unin vitro
intravenosa, el área total bajo la curva (AUC) modelo deTFB2M-deficiencia en células clonales INS-1 832/13, que, al igual queb-
Figura 4: Pérdida deTfb2menb-las células conduce a una ultraestructura mitocondrial alterada y una mitofagia alterada. (A) Gráfico que muestra el porcentaje de mitocondrias con morfología vesicular e
hinchada enb-células de control yb-Tfb2m-/-islotes aislados de ratones a los 18 días de edad. Micrografía electrónica representativa que muestra mitocondrias de forma normal en un controlb-celular y
mitocondrias vesiculares e hinchadas enb-Tfb2m-/-b-celúla; control,norte¼34 imágenes (4 ratones),b-Tfb2m-/-,norte¼40 imágenes (3 ratones). Las flechas blancas apuntan a las mitocondrias. Barras de escala:
0.5metrometro. (B) IzquierdamiImagen de microscopía de fluorescencia representativa de células que expresan LC3-GFP (verde) de control disperso yb-Tfb2m-/-
islotes después del tratamiento con Mitotracker (rojo). Núcleo teñido con DAPI (azul). Barras de escala, 10metrometro. BienmiCuantificación de LC3þárea co-localizada con Mitotracker en control y
b-Tfb2m-/-islotes; control yb-Tfb2m-/-, se contaron 200 células por condición,norte¼4 ratones cada uno a los 18 días de edad. (C) análisis qRT-PCR dePdx1, Ins1, Ins2,ySlc2a2ARNm en islotes de control yb-Tfb2m
-/-ratones,norte¼3 ratones Los datos son medias sem. Las diferencias estadísticas se examinaron mediante pruebas de Student no pareadas.t-prueba. *P < 0,05, **P < 0,01,
* * * P < 0,001 y ****P < 0,0001 frente al valor correspondiente para los ratones de control.
Tfb2m-/-ratones, exhibieron alteración de la secreción de insulina (VerFigura S3para datos células deficientes (Figura 6B). En conjunto, nuestros hallazgos enTFB2M- las
detallados). células silenciadas reflejan aún más las deTfb2m-islotes deficientes, es decir,
Este modelo nos permitió determinar O2consumo por citocromo C oxidasa disfunción mitocondrial y alteración de la secreción de insulina.
(Complejo IV), que se usa comúnmente para evaluar la actividad de la cadena
respiratoria mitocondrial y OXPHOS, lo que refleja la función mitocondrial[11]. 3.9. silenciamiento deTFB2Men las células productoras de insulina da como resultado una
Las células de control INS-1 832/13 mostraron un aumento progresivo en la autofagia alterada
tasa de consumo de oxígeno (OCR) luego de un aumento en la concentración Nosotros usamosTFB2M-células deficientes para comprender si la autofagia y
de glucosa de 2.8 a 16.7 mM (Figura 6A). En cambio, no sólo hizo TFB2M-las la mitofagia alteradas se observaron enb-Tfb2m-/-los islotes fueron causados
células deficientes exhiben un OCR basal más bajo en comparación con los por la disminuciónTfb2mexpresiónper sey no una consecuencia de la
controles, estas células tampoco lograron aumentar su OCR en la misma hiperglucemia y la condición fisiopatológica prevaleciente. Como en
medida en respuesta a la glucosa (Figura 6A). Tras la adición de oligomicina, b-Tfb2m-/-islotes, LC3þpuncta fueron más abundantes (P < 0.0001; Figura
que bloquea la ATP sintasa y, por lo tanto, refleja el recambio de ATP, el OCR S4a). Expresión deBECN1,involucrado en la autofagia en etapa temprana,
disminuyó en menor medida enTFB2M-células deficientes; también hubo una se incrementó enTFB2M-células deficientes (P < 0,01;Figura S4b).
tendencia (P¼0.06) hacia la disminución de Hþfuga entre el control yTFB2M- Expresión deCTSBse incrementó (P < 0.001) mientras que la expresión de
células deficientes después de la corrección de la respiración no mitocondrial ( LAMPARA2no ha cambiado (Figura S4b). Sin embargo, comob-Tfb2m-/-
Figura 6A). De acuerdo con la reducción del recambio de ATP (OCR sensible a islotes, la fusión autofagosoma-lisosoma se interrumpió enTFB2M- células
la oligomicina), el contenido de ATP celular después de una incubación de 1 h deficientes (medido por LC3þpuntos puncta coteñidos con Lysotracker) (P <
a 16,7 mM de glucosa se redujo significativamente (P < 0,05) enTFB2M- 0,01;Figura S4c). No hubo efecto deTFB2M-deficiencia en
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Figura 5: Pérdida deTfb2menb-conduce a una ultraestructura alterada de la insulina y una autofagia alterada. (Una izquíerdamiImagen de microscopía de fluorescencia representativa deb-
células (teñidas para insulinamirojo) de control yb-Tfb2m-/-islotes que expresan LC3-GFP (verde). Núcleo teñido con DAPI (azul). Barras de escala, 10metrometro. BienmiCuantificación de LC3
totalþárea de control yb-Tfb2m-/-islotes; control yb-Tfb2m-/-,norte¼4 ratones cada uno a los 18 días de edad. (B) análisis qRT-PCR deLámpara2yctsbARNm en islotes de control yb-Tfb2m-/-
ratones,norte¼3 ratones (C) IzquierdamiImagen de microscopía de fluorescencia representativa de células que expresan LC3-GFP (verde) de control yb-Tfb2m-/-islotes después del
tratamiento con Lysotracker (rojo). Núcleo teñido con DAPI (azul). Barras de escala, 10metrometro. BienmiCuantificación de LC3þco-localizado con Lysotracker en control yb- Tfb2m-/-islotes;
control yb-Tfb2m-/-,norte¼4 ratones cada uno a los 18 días de edad. (D) análisis qRT-PCR deDdit3yCebpbARNm en islotes de control yb-Tfb2m-/-ratones,norte¼3 ratones Todos los datos son
medias sem. Las diferencias estadísticas se examinaron mediante pruebas de Student no pareadas.t-prueba. *P < 0,05, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001 frente al valor correspondiente para los
ratones de control.
Figura 6: Silenciamiento deTFB2Men las células productoras de insulina da como resultado una alteración de la respiración celular y una disminución del contenido de ATP. (Una izquíerdamiTasa de consumo de
oxígeno (OCR) en control yTFB2M-células clonales INS-1 832/13 deficientes después del tratamiento con glucosa, oligomicina, rotenona y cianuro de carbonilo-4-(trifluorometoxi) fenilhidrazona (FCCP). Bienmi
Cálculo de la respiración basal, estimulada por glucosa y estimulada por oligomicina, así como la fuga de protones en control yTFB2M-células clonales INS-1 832/13 deficientes;norte¼5 pases celulares/grupo
diferentes. (B) Contenido de ATP a glucosa 2,8 mM y tras estimulación con glucosa 16,7 mM en control yTFB2M-células clonales INS-1 832/13 deficientes;norte¼9 pases celulares/grupo diferentes. Todos los
datos son medias sem. Las diferencias estadísticas se examinaron mediante pruebas de Student no pareadas.t-o por un ANOVA de medidas repetidas de dos vías seguido de la prueba post-hoc de Tukey (Ami
izquierda) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001 frente al valor correspondiente para los controles.
Células INS-1 832/13 en la expresión deCEBPBARNm (Figura S4d). Sin yTFAM (p<0,05;Figura S3b). Tomados en conjunto,TFB2M-deficiencia en las
embargo, hubo una mayor expresión deDDIT3 (P < 0,01; Figura S4d). Por células productoras de insulina tuvo un impacto similar en la mitofagia como
lo tanto, experimentalmente inducidaTFB2M-deficienciain vitro enb- Tfb2m-/-islotes
recapitula la autofagia alterada observada enb-Tfb2m-/-islotes
3.11. silenciamiento deTFB2Men las células productoras de insulina da como resultado
3.10. silenciamiento deTFB2Men las células productoras de insulina da como una mayor activación de la apoptosis a través de la vía dependiente de la mitocondria
resultado la interrupción de la respuesta proteica mitocondrial desplegada y la
alteración de la mitofagia Dado que es probable que tanto la autofagia como la mitofagia desreguladas
DDIT3 también regula la respuesta proteica desplegada mitocondrial conduzcan eventualmente a un aumento de la apoptosis enb-células,
(UPRmt), que se activa en respuesta al estrés mitocondrial aguas arriba evaluamos marcadores apoptóticos. Como enb-Tfb2m-/-islotes, encontramos
de la vía de la mitofagia[27]. De hecho, la abundancia de proteínas de la una mayor activación de la vía apoptótica enTFB2M-células INS-1 832/13
chaperona HSP60, que normalmente se activa como parte de la UPRmt, deficientes, indicadas por una mayor abundancia de caspasa-3 escindida (P <
se incrementó enTFB2M-células deficientes [P < 0,01;Figura S5a (panel 0,05;Figura 7A). Expresión de la proteína proapoptótica BAX (P < 0,01;Figura 7
izquierdo)]. Por el contrario, la expresión génica deHSP60 (P < 0.001) y la A) pero también del antiapoptótico BCL-2, así como de la serina/treonina
proteasa mitocondrialCLPP (P < 0,01) se redujo en estas células [Figura quinasa AKT y AKT fosforilada (Ser 473) (P < 0.05; Figura 7B).
S5a(panel derecho)].
A continuación, examinamos la mitofagia enTFB2M-celdas INS-1 832/13
silenciadas. De hecho, estas células mostraron un mayor número de LC3 3.12. silenciamiento deTFB2Men las células productoras de insulina da como
þpuntos puncta teñidos con Mitotracker (P < 0,0001;Figura S5b). No hubo resultado una mayor producción de especies reactivas de oxígeno (ROS) Reducido
cambios en la abundancia de proteínas PINK1 y PARKIN (Figura S5c). PDX1expresión, como se observó en este estudio, bajo ciertas condiciones, puede
Comob- Tfb2m-/-islotes,TFB2M-Las células INS-1 832/13 deficientes resultar de un aumento de ROS[28]. De hecho, el silenciamiento de TFB2Mdio como
mostraron una expresión disminuida dePDX1 (P < 0,05) y sus objetivos resultado un aumento de los niveles de ROS tanto a 2,8 como a 16,7 mM de glucosa
aguas abajo, INS1 (p<0,01),INS2 (p<0,05),SLC2A2 (P < 0,01) (Figura S5d), (P < 0,05;Figura 8A,B). Tratamiento deTFB2M-células deficientes
Figura 7: Silenciamiento deTFB2Men las células productoras de insulina da como resultado una mayor activación de la apoptosis a través de la vía dependiente de la mitocondria. (A) Western blot y análisis de
densitometría de la abundancia de proteínas BAX y Cleaved-caspasa 3 en control yTFB2M-células clonales INS-1 832/13 deficientes;norte¼5 pases celulares/grupo diferentes. (B) Western blot y análisis de
densitometría de AKT, fosfo-AKT (Ser 473) y abundancia de proteína BCL-2 en control yTFB2M-células clonales INS-1 832/13 deficientes;norte¼5 pases celulares/grupo diferentes. Se muestran imágenes
representativas de transferencias Western cuantitativas. Las diferencias estadísticas se examinaron mediante pruebas de Student no apareadas.t-prueba. *P < 0,05 y **P < 0,01 frente al valor correspondiente
para los controles.
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Figura 8: Silenciamiento deTFB2Men las células productoras de insulina da como resultado una mayor producción de especies reactivas de oxígeno (ROS).Cuantificación de ROS utilizando el colorante
fluorogénico 20,70midiacetato de diclorofluorescina (DCFDA) en control yTFB2M-células clonales INS-1 832/13 deficientes en presencia y ausencia de 10metroM de N-acetil-L-cisteína (NAC) en
glucosa 2,8 mM (A) y 16,7 mM (B). (C) Secreción de insulina del control yTFB2M-células clonales INS-1 832/13 deficientes en presencia y ausencia de 10metroM NAC que se incubaron durante
1 h en glucosa 2,8 mM y 16,7 mM. (DmiH) análisis qRT-PCR dePDX1, TFAM, INS1, INS2,ySLC2A2ARNm en control yTFB2M-células clonales INS-1 832/13 deficientes en presencia y ausencia de
10metroM NAC. (I) análisis qRT-PCR deGATO, CÉSPED2,yGLRX2ARNm en control yTFB2M-células clonales INS-1 832/13 deficientes;norte¼5 pases celulares/grupo diferentes. Las diferencias
estadísticas se examinaron mediante un ANOVA unidireccional seguido de la prueba post-hoc de Tukey (AmiH) o por estudiantes no emparejadost-prueba (yo). *P < 0,05,
* * P < 0,01, ***P < 0,001 y ****P < 0,0001 frente al valor correspondiente a los controles.
con el antioxidante N-acetilcisteína (NAC) redujo los niveles de ROS tanto a 2,8 de este factor de transcripción mitocondrial enb-la función celular y describió los
mM como a 16,7 mM de glucosa (P < 0,0001;Figura 8A,B). El nivel de ROS en posibles mecanismos moleculares que sustentan el metabolismo mitocondrial
TFB2M-las células deficientes tratadas con NAC también permanecieron más interrumpido yb-disfunción celular, que puede conducir a T2D. Aquí, utilizamos tres
bajas que en las células de control a 2,8 (P < 0,001) y 16,7 mM de glucosa (P < modelos experimentales diferentes deTfb2m-deficiencia enb- células. Encontramos
0,0001;Figura 8A,B). que la pérdida deTfb2mdio lugar a una disminución de la expresión de genes
Tratamiento deTFB2M-las células deficientes con NAC también mejoraron GSIS codificados por mitocondrias, así como a un contenido reducido de mtDNA. Esto
(P <0.05;Figura 8C), pero la secreción de hormonas seguía siendo menor que condujo a una disfunción mitocondrial grave, caracterizada por una
en las células de control (P < 0,05;Figura 8C). A pesar de la reducción de los hiperpolarización disminuida de la membrana mitocondrial interna, un consumo
niveles de ROS enTFB2M-células deficientes por NAC, el tratamiento con este deficiente de oxígeno y una producción reducida de ATP. Juntos, esto dio como
antioxidante no pudo eliminar la disminución en la expresión génica dePDX1 ( resultado un acoplamiento estímulo-secreción perturbado enb-células, lo que
P < 0,05) y sus objetivos aguas abajoTFAM (p<0,01),INS1 (p<0,01),INS2 (P < conduce a una alteración de la secreción de insulina y, posteriormente, a una
0.0001), ySLC2A2 (P < 0,01) (Figura 8Dmih). DesdeTFB2M- la deficiencia resultó hiperglucemia progresiva en ratones.
en un aumento de los niveles de ROS, investigamos la expresión de enzimas Un resultado sorprendente de este estudio fue la rapidez con que evolucionaron estas
antioxidantes clave, que desempeñan un papel en la defensa contra las ROS. perturbaciones enTfb2m-ratones deficientes en comparación con los vistos previamente en
Expresión deGATOno se modificó, pero el deSOD2 (P < 0.05) yGLRX2 (P < 0,01) ratones con unb-pérdida específica celular de cualquieraTfam[10]otfb1m[12]. A las siete
disminuyó enTFB2M-células INS-1 832/13 deficientes (Figura 8I). semanas de edad,Tfam-los ratones deficientes muestran una expresión alterada de mtDNA
y, en consecuencia, una deficiencia grave de la cadena respiratoria en el páncreasb-células.
Pérdida de producción de insulinab-células, sin embargo, se detectó cuando los ratones
4. DISCUSIÓN tienen 39 semanas de edad[10]. EnTfb1m-ratones deficientes, la disfunción mitocondrial es
evidente a los tres meses de edad seguida de hiperglucemia, que es evidente por primera
TFB2M juega un papel importante en la transcripción del mtDNA a través de vez a los cuatro meses de edad[12]. Por el contrario, los cambios patológicos observados
su papel principal en la fusión del promotor, así como en la estabilización del aquí enTfb2m-los ratones deficientes ocurrieron en el punto de tiempo más temprano
complejo promotor abierto.[8,29]. Hasta la fecha, la importancia de TFB2M en estudiado (día 18), un punto de tiempo en el que estos ratones estaban solo ligeramente
la función celular y mitocondrial y sus implicaciones para el páncreas hiperglucémicos en el estado sin ayuno. Dado que la concentración de insulina plasmática
b-células, que dependen de las mitocondrias para el control de la secreción de insulina yb- no se redujo enb- Tfb2m-/-ratones a esta edad, especulamos queb-la masa celular sigue
masa celular, siguen siendo desconocidos. El estudio actual exploró el papel siendo
intacto. De hecho, los ratones ingieren una dieta pobre en carbohidratos antes del destete, Además, CLPP, que se localiza dentro de la matriz mitocondrial, sirve como
lo que requiere poca insulina, lo que puede explicar la hiperglucemia moderada y sensor de proteínas desplegadas.[36]. Esto implica, por lo tanto, que una
conservada.b-masa celular. Con el tiempo, la pérdida deb-la masa celular se hizo evidente regulación al alza de HSP60 solo enTFB2M-Las celdas INS-1 832/13 deficientes
también enb-Tfb2m-/-ratones (siete semanas de edad). En este punto, reflejan una capacidad insuficiente de estas celdas para montar un UPRmt
b-la función celular se vio gravemente comprometida con una elevación de más del apropiado. Curiosamente, la expresión génica del objetivo DDIT3CLPPy su
doble de la concentración de glucosa en plasma y una reducción del 75% en la objetivoHSP60se redujo enTFB2M-células deficientes. Se ha demostrado
concentración de insulina en plasma. previamente que esto perturba la morfología mitocondrial.[37]. En efecto,
El efecto de la dosis de genes enTfb2mexpresión y el fenotipo retrasado Tfb2m-deficiencia en ratónb-las células dieron como resultado una mayor
resultante enb-Tfb2mþ/-los ratones fueron otros hallazgos importantes. signos abundancia de mitocondrias vesiculares e hinchadas. La conformación de la
deb-la disfunción celular alrededor de los seis meses de edad fue evidente membrana interna mitocondrial cambia a la forma vesicular durante la
como una disminución de la concentración de insulina en plasma en el estado liberación del citocromo C y la matriz se hincha durante o después de la
sin ayuno, así como una eliminación retardada de glucosa y una tendencia a pérdida del potencial de la membrana mitocondrial.[38]. En conjunto, estos
una respuesta de insulina aguda alterada durante un IVGTT. Esto puede resultados sugieren queTFB2M-las células deficientes pueden estar tratando
atribuirse a una reducción deb-masa celular a esta edad. Pérdida de un de montar un UPRmt (como se refleja en el aumento de DDIT3 y HSP60), pero
funcionalTfb2m alelo también resultó en disfunción mitocondrial y, en la reducción enCLPPy/oHSP60la expresión génica puede ser un signo de
consecuencia, deterioro de la secreción de insulina deb-células. Además, los "debilidad" en el sistema. Esto podría llevar a que el sistema UPRmt se vea
islotes deb- Tfb2mþ/-los ratones mostraron una capacidad exocitótica de abrumado, lo que resultaría en la activación de la mitofagia.[27]. De hecho, el
insulina deteriorada, que no estaba presente enTfb2m-/-ratones. Creemos que mayor número de mitocondrias dirigidas a vesículas positivas para LC3,
esta diferencia se debe al efecto adicional del envejecimiento;b-Tfb2mþ/-Se observado enTfb2m-deficienteb-células, indicaron un aumento del flujo a
aislaron islotes de ratones de seis meses de edad frente a ratones jóvenes de través de la mitofagia o una fusión alterada del autofagosoma-lisosoma, es
18 y 35 días. Tfb2m-/-ratones. decir, flujo de mitofagia incompleto[22]. La falta de cambios importantes en la
Funcionalb-la masa celular está determinada tanto por un fuerte acoplamiento expresión de genes y proteínas implicados en la mitofagia respalda la idea de
estímulo-secreción como por el número deb-células. La disfunción que el flujo de mitofagia enTfb2m-deficienteb-las células están deterioradas.
mitocondrial, por lo tanto, tendrá un gran impacto en estos dos parámetros. UPRmt, estrés ER, mitofagia y autofagia enb-las células finalmente convergen
De hecho, tanto los homocigotos como los heterocigotosTfb2m- los ratones en la activación de las vías apoptóticas. De hecho, observamos la activación de
deficientes mostraron un acoplamiento estímulo-secreción deteriorado y una la apoptosis a través de la vía dependiente de mitocondrias. Esto se reflejó en
reducciónb-masa celular. Si bien está claro cómo la disfunción mitocondrial niveles más altos de Bax proapoptótico y Cleavedcaspase 3 enTFB2M-
afecta el acoplamiento estímulo-secreción, las vías que llevan de la disfunción deficienteb-células. Signos de mecanismos compensatorios enTFB2M-las
mitocondrial a la pérdida deb-la masa celular son menos conocidas. El control células deficientes sugieren que están luchando para hacer frente a una
adecuado de los procesos autofágicos es esencial para el mantenimiento mayor activación de la vía apoptótica, como lo demuestra la regulación
normalb-arquitectura celular y, por lo tanto,b-masa celular positiva de AKT y su objetivo antiapoptótico BCL-2[40]. El estrés oxidativo y/o
[25]. Por lo tanto, buscamos determinar si la autofagia se ve afectada alTfb2m- las ERO se asocian con frecuencia con la disfunción mitocondrial y con la
deficiencia. Hubo una mayor expresión del marcador de autofagia de etapa muerte celular. Enb-células, la generación de ROS está acoplada al
posteriorctsb[24]junto con una disminución de la expresión deLámpara2,que metabolismo glucolítico y respiratorio[41]. Las enzimas antioxidantes
es un regulador negativo de la autofagia[25]. Esto fue acompañado por una contenidas dentro de las células son la primera línea de defensa contra los
mayor activación de la maquinaria autofágica. La maduración y degradación niveles excesivos de ROS[42]. Estas enzimas antioxidantes se expresan en
del autofagosoma, que implica la fusión con el endosoma.milisosoma para niveles comparativamente bajos enb-células, haciéndolas más susceptibles al
formar autolisosomas[30], es una etapa crítica de la autofagia. Este proceso estrés oxidativo[28]. Anteriormente informamos sobre un vínculo entre la
fue interrumpido, sin embargo, alTfb2m-deficiencia, lo que sugiere que generación de ROS y la muerte celular enTfb1m-islotes deficientes[12]. Aquí,
aunque un mecanismo o mecanismos fueron activados dentroTfb2m-células encontramos que la disfunción mitocondrial enTFB2M-Las células INS-1
deficientes para aumentar el aclaramiento autofágico, es decir, de gránulos 832/13 deficientes se asociaron con un aumento de los niveles de ROS. Estas
secretores de insulina, la autofagia todavía estaba alterada. Es importante células también exhibieron una defensa antioxidante deteriorada, indicada
destacar que esto podría conducir a la acumulación de vacuolas autofágicas por una expresión disminuida deSOD2yGLRX2.El tratamiento con el
en el citoplasma y la muerte celular autofágica distinta de la apoptosis.[31]. De antioxidante NAC pudo normalizar los niveles de ROS y mejorar ligeramente la
hecho, se ha demostrado que las vacuolas marcadas con LC3 se acumulan en secreción de insulina.
células que carecen deLámpara2disminución de la expresión pero la El factor de transcripción del homeodominio pancreático PDX1 es un regulador
colocalización de LC3 y los lisosomas, lo que sugiere que se inhibe la fusión maestro delb-célula, importante para su desarrollo embrionario y función
entre las vacuolas autofágicas y los lisosomas[31]. La autofagia también se diferenciada[43]. Mutaciones heterocigóticas enPDX1están asociados con T2D en
activa en respuesta al estrés del RE.[26]. De hecho, encontramos una mayor humanos[44]. Entre las funciones de PDX1 está su capacidad para activar la
expresión de los marcadores de estrés ERDDIT3yCEBPB transcripción deTFAMuniéndose a su promotor[43] así como la regulación de la
[32]. fusión autofagosoma-lisosoma, la autofagia y la mitofagia[22,45]. Además, PDX1
La primera línea de defensa contra el estrés o la disfunción mitocondrial es la también afecta la producción y secreción de insulina a través de sus genes diana.Ins1
UPRmt, que se activa antes de que se produzca la mitofagia.[27]. UPRmt se yIns2.Pérdida dePdx1Se ha demostrado que conduce a un aumento de la apoptosis
desencadena por el agotamiento de mtDNA y/o mutaciones que reducen la enb-células. En este estudio, encontramos queTfb2m-deficiencia resultó en una
expresión de componentes de la cadena respiratoria o perturban su capacidad disminución de la expresión dePdx1y varios de sus objetivos aguas abajo. Estos
para plegarse [27,33]. EnTFB2M-células INS-1 832/13 deficientes, encontramos resultados sugieren que PDX1 puede servir como un factor común que media los
una mayor expresión génica deDDIT3,que regula UPRmt activando la cambios observados en Tfb2m-células deficientes. Se ha demostrado que las ROS
transcripción de chaperonas y proteasas mitocondriales[34], junto con un afectan la expresión y la función dePdx1a nivel epigenético, transcripcional y
aumento correspondiente en la abundancia de la chaperona HSP60 pero no postraduccional[28]. En este estudio, encontramos tanto un aumento en los niveles
de la proteasa mitocondrial CLPP. La regulación positiva de HSP60 y CLPP de ROS como una disminuciónPdx1expresión, lo que plantea la posibilidad de que
reduce la agregación de proteínas mitocondriales[35]. ROS
661
Artículo original
es el principal determinante de los cambios patológicos observados. Aunque el [4]Ardestani, A., Paroni, F., Azizi, Z., Kaur, S., Khobragade, V., Yuan, T., et al., 2014. MST1 es
tratamiento con NAC fue capaz de normalizar los niveles de ROS, la expresión de un nuevo regulador de la apoptosis en las células beta pancreáticas. Medicina natural
PDX1y sus objetivos permanecieron disminuidos en tratados con NAC TFB2M-células 20(4):385mi397.
deficientes. Esto sugiere que el aumento de los niveles de ROS proporciona sólo una [5]Supale, S., Li, N., Brun, T., Maechler, P., 2012. Disfunción mitocondrial en el páncreasb
explicación parcial, vinculando la pérdida deTFB2M,disfunción mitocondrial y, en células. Tendencias en Endocrinología y Metabolismo 23(9):477mi487.
consecuencia, alteración de la secreción de insulina. [6]Maechler, P., Li, N., Casimir, M., Vetterli, L., Frigerio, F., Brun, T., 2010. Papel de las
mitocondrias en la función y disfunción de las células beta. Avances en Medicina
5. CONCLUSIÓN Experimental y Biología 654:193mi216.

[7]Maechler, P., Wollheim, CB, 2001. Función mitocondrial en células beta normales
Empleamos tres modelos diferentes deTfb2m-deficienciamihomocigotos y y diabéticas. Naturaleza 414(6865):807mi812.
heterocigotosb-desactivación celular en ratón y ARNi en células clonales productoras [8]Litonin, D., Sologub, M., Shi, Y., Savkina, M., Anikin, M., Falkenberg, M., et al.,
de insulinamiidentificar un papel importante de TFB2M enb- función celular. 2010. Revisión de la transcripción mitocondrial humana: solo se requieren
Específicamente, hemos esbozado los mecanismos moleculares que operan durante TFAM y TFB2M para la transcripción de los genes mitocondriales in vitro. Revista
Tfb2m-Deficiencia y disfunción mitocondrial. Es importante destacar que de química biológica 285 (24): 18129mi18133.
encontramos que, en algunos casos, la perturbación deb-el metabolismo celular [9]Metodiev, M., Lesko, N., Park, CB, Cámara, Y., Shi, Y., Wibom, R., et al., 2009. La metilación
conduce a la activación de mecanismos compensatorios que limitan la disfunción y el del ARNr 12S es necesaria para la estabilidad in vivo de la subunidad pequeña de el
daño celular. Sin embargo, en última instancia, la disfunción mitocondrial ribosoma mitocondrial de los mamíferos. Metabolismo Celular 9:1mi12.
generalizada supera los sistemas de protección celular, como la UPRmt, la autofagia [10]Silva, JP, Kohler, M., Graff, C., Oldfors, A., Magnuson, MA, Berggren, PO, et al., 2000.
y la mitofagia, lo que conduce ab-disfunción celular, así como aumento de la Deterioro de la secreción de insulina y pérdida de células beta en ratones knockout
apoptosis y pérdida deb-masa celular. El inicio rápido y las consecuencias dramáticas específicos de tejido con diabetes mitocondrial . Genética natural 26(3):336mi340.
de la deficiencia de TFB2M sugieren un papel crítico e imprevisto para este factor de [11]Koeck, T., Olsson, AH, Nitert, MD, Sharoyko, VV, Ladenvall, C., Kotova, O., et al.,
transcripción mitocondrial. 2011. Una variante común en TFB1M se asocia con una secreción de insulina
reducida y un mayor riesgo futuro de tipo 2 diabetes. Metabolismo celular
13(1): 80mi91.
CONTRIBUCIONES DE AUTOR
[12]Sharoyko, VV, Abels, M., Sun, J., Nicholas, LM, Mollet, IG, Stamenkovic, JA, et al.,
2014. La pérdida de TFB1M da como resultado una disfunción mitocondrial que
LMN y BV realizaron la mayoría de los experimentos, analizaron los datos y
provoca una alteración de la secreción de insulina y diabetes. Genética
escribieron el manuscrito. AM, LA MA, DJ e IGM realizaron experimentos y analizaron
Molecular Humana.
datos. MF, LE y NW proporcionaron comentarios sobre la interpretación de los datos.
[13]Herrera, PL, 2000. Las células adultas productoras de insulina y glucagón se diferencian a
HM concibió el proyecto y escribió el manuscrito. Todos los autores revisaron el
partir de dos linajes celulares independientes. Desarrollo 127(11):2317mi2322.
manuscrito.
[15]Fex, M., Wierup, N., Nitert, MD, Ristow, M., Mulder, H., 2007. Los ratones con
recombinasa 2-Cre del promotor de insulina de rata criados en un entorno C57BL/6J
AGRADECIMIENTOS
puro exhiben una tolerancia a la glucosa inalterada. Revista de Endocrinología
194(3):551mi 555.
Los autores agradecen a Nils-Göran Larsson (Instituto Karolinska, Suecia) por sus
[dieciséis]Goehring, I., Sharoyko, VV, Malmgren, S., Andersson, LE, Spegel, P., Nicholls, DG, et
comentarios constructivos sobre el manuscrito. Se reconoce a Laila Jacobsson por
al., 2014. Los niveles elevados crónicos de glucosa y piruvato afectan de manera
genotipificar los ratones. Ann-Helen Thorén Fischer es reconocida por su ayuda con el
diferente la bioenergética mitocondrial y la secreción de insulina estimulada por
trabajo con animales. Se recibió apoyo financiero de la Facultad de Medicina de la
combustible de células clonales INS-1 832/13. Revista de química biológica 289 (6):
Universidad de Lund, la Fundación Sueca de Diabetes, la Fundación Albert Påhlsson, el
3786mi3798.
Consejo Sueco de Investigación, el Bienestar de la Diabetes y la Fundación Sueca para la
[17]Kong, M., Bhattacharya, RN, James, C., Basu, A., 2005. Un enfoque estadístico para
Investigación Estratégica.
estimar la distribución de tamaño 3D de esferas a partir de distribuciones de tamaño
2D. Boletín 117 de la Sociedad Geológica de América (1mi2):244mi249.
CONFLICTO DE INTERESES
[18]Dehoff, RT, Rhines, FN, 1961. Determinación del número de partículas por unidad de
volumen a partir de mediciones realizadas en secciones planas aleatorias: el cilindro
Los autores no tienen intereses contrapuestos que declarar.
general y el elipsoide. Transacciones de la Sociedad Metalúrgica de AIME 221:975mi
982.
ANEXO A. DATOS COMPLEMENTARIOS
[19]Hohmeier, HE, Mulder, H., Chen, G., Henkel-Rieger, R., Prentki, M., Newgard, CB, 2000.
Aislamiento de líneas celulares derivadas de INS-1 con K robusto sensible a ATPþ
Los datos complementarios relacionados con este artículo se pueden encontrar enhttp://dx.doi.org/10.1016/j.
Secreción de insulina estimulada por glucosa dependiente e independiente del canal.
molmet.2017.05.005.
Diabetes 49(3):424mi430.
[20]Kuznetsov, AV, Gnaiger, E., 2010. Protocolo de laboratorio complejo I (NADH:
REFERENCIAS
ubiquinona oxidorreductasa; EC 1.6. 5.3) membrana mitocondrial.
[21]Malmgren, S., Nicholls, DG, Taneera, J., Bacos, K., Koeck, T., Tamaddon, A., et al., 2009. Se
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parkin selecciona contra una mutación deletérea de mtDNA en heteroplasmic
663

Mitochondrial Transcription Factor B2 Is Essential For Mitochondrial and Cellular Function in Panc - En.es (ESP)

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Mitochondrial Transcription Factor B2 Is Essential For Mitochondrial and Cellular Function in Panc - En.es (ESP)

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El factor de transcripción mitocondrial B2 es esencial

Palabras claveMetabolismo mitocondrial; Pancreáticob-células; secreción de insulina

1. INTRODUCCIÓN El factor de transcripción mitocondrial A (TFAM) y el factor de transcripción

5Lisa M. Nicholas y Bérengère Valtat contribuyeron igualmente a este trabajo.

5. CONCLUSIÓN Experimental y Biología 654:193mi216.

Empleamos tres modelos diferentes deTfb2m-deficienciamihomocigotos y y diabéticas. Naturaleza 414(6865):807mi812.

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